魯?shù)さ?，譚政委，楊紅旗，李 磊，余永亮，許蘭杰，楊 青，梁慧珍

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 芝麻研究中心，河南 鄭州 450002）

紅花（Carthamus tinctoriusL.）是菊科1 年生草本植物，是菊科較大的家族之一。菊科植物比如蒿、萵苣和菊花等，大多具有藥用、觀賞或經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1?3]，紅花的干燥花瓣也是很重要的一種傳統(tǒng)中草藥，被廣泛用于治療經(jīng)閉、胸痹心痛、跌撲損傷、瘡瘍腫痛等癥，有活血通經(jīng)、散瘀止痛的功效[4]。研究表明，紅花含有豐富的喹諾查爾酮、黃酮類(lèi)化合物、脂肪酸、生物堿及各種酚類(lèi)化合物，且喹諾查爾酮和黃酮類(lèi)化合物通常被認(rèn)為是紅花發(fā)揮療效的主要生物活性成分[5]，比如紅花對(duì)心血管系統(tǒng)的藥理作用是通過(guò)黃酮類(lèi)化合物激活抗氧化防御和清除自由基實(shí)現(xiàn)的[6]。因此，紅花黃酮代謝途徑的研究有助于提高紅花的品質(zhì)和利用價(jià)值。

黃酮類(lèi)化合物是苯丙氨酸代謝途徑衍生的次生代謝產(chǎn)物，是植物體內(nèi)常見(jiàn)的天然化合物，功能具有多樣性，比如色素沉著、紫外線保護(hù)、病原菌防御等[7]。此外，大量研究表明，黃酮類(lèi)化合物還有多種藥用價(jià)值，如抗氧化、抗衰老、提高機(jī)體免疫力、鎮(zhèn)痛等藥理活性[8?11]，富含黃酮類(lèi)化合物的食物還可以降低不同腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)防慢性疾病[12]。黃酮類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)多樣、種類(lèi)繁多，在植物體內(nèi)既可以與糖結(jié)合成苷類(lèi)或碳糖基，也可以游離形式存在。繁多的種類(lèi)及復(fù)雜多變的結(jié)構(gòu)使得不同植物體內(nèi)黃酮代謝途徑不盡相同。目前，擬南芥等模式植物中黃酮生物合成的代謝途徑已基本明確[13]。然而，紅花中黃酮類(lèi)化合物的生物合成仍然未知，確定紅花黃酮類(lèi)化合物生物合成的相關(guān)基因，對(duì)利用分子技術(shù)促進(jìn)紅花活性成分的合成具有重要意義。

查爾酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）屬于植物類(lèi)型Ⅲ聚酮合酶超基因家族，是黃酮類(lèi)化合物合成過(guò)程中的第1 個(gè)限速酶。查爾酮合成酶催化3分子丙二酰輔酶A 與1 分子香豆酰輔酶A 經(jīng)脫羧縮合成4′，5，7-三羥基黃烷酮型查爾酮，進(jìn)一步合成查爾酮、色酮、吡喃酮、姜黃素和吖啶酮等開(kāi)花植物中重要的功能化合物[14]。自首個(gè)CHS基因從歐芹中分離出來(lái)，近年來(lái)從單子葉及雙子葉植物中分離鑒定了將近650 個(gè)CHS及CHS類(lèi)的基因[15]，其中包括近20種中草藥的CHS基因，比如鐵皮石斛、艾納香、苦蘵、白芨等[15?18]。CHS 超家族通常以多基因家族的形式存在。目前，已發(fā)現(xiàn)的CHS基因在水稻中有27個(gè)，玉米中14個(gè)，海島棉中20個(gè)，甘蔗中7個(gè)[19?22]，而2021年紅花的基因組測(cè)序數(shù)據(jù)表明，紅花中至少有7個(gè)CHS基因[23]。2016 年，SHINOZAKI 等[24]克隆了3個(gè)CtCHS基因，并對(duì)其進(jìn)行了功能分析；2017年，劉秀明等[25]將CtCHS基因?qū)霐M南芥，發(fā)現(xiàn)其在擬南芥中超表達(dá)后提高了擬南芥黃酮含量；2018年，何貝軒等[26]發(fā)現(xiàn)了1 個(gè)CtCHS基因，其可以響應(yīng)茉莉酸甲酯誘導(dǎo)，促進(jìn)紅花醌式查爾酮類(lèi)化合物的積累。然而未見(jiàn)對(duì)CtCHS基因結(jié)構(gòu)、內(nèi)含子信息及不同品種、組織、發(fā)育時(shí)期表達(dá)量的分析報(bào)道。河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心藥用植物研究室在前期研究中已構(gòu)建了不同花色紅花三代測(cè)序全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，在此基礎(chǔ)上，本研究擬通過(guò)RT-PCR及PCR 方法克隆CtCHS基因的cDNA 及gDNA 序列，對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、內(nèi)含子及外顯子序列、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，并檢測(cè)該基因在不同花色的紅花、不同組織及不同發(fā)育時(shí)期花中的表達(dá)量，分析不同激素脅迫下該基因的表達(dá)模式，為解析紅花黃酮類(lèi)物質(zhì)的生物合成途徑及應(yīng)用分子技術(shù)提高紅花黃酮類(lèi)物質(zhì)含量提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

所用紅花材料包括紅色紅花（管狀花為紅色）和白色紅花（管狀花為白色）2 種，均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心提供，種植于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開(kāi)發(fā)基地（東經(jīng)113°42′，北緯35°01′，海拔63.40 m），自然條件下生長(zhǎng)。于不同生長(zhǎng)期，在田間采取紅色和白色紅花幼根、幼莖、幼葉、苞片和不同開(kāi)花時(shí)期的花瓣各3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，置于液氮中速凍處理，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 激素處理及取樣 將紅色紅花種植于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開(kāi)發(fā)基地，自然條件下生長(zhǎng)至開(kāi)花的第1天時(shí)，對(duì)其果球進(jìn)行激素處理。分別取茉莉酸甲酯（100μmol/L）、赤霉素（100μmol/L）、脫落酸（100 μmol/L）、生長(zhǎng)素（100 μmol/L）溶液各5 mL，均勻噴灑至果球表面，并立即用干凈的塑料袋套住。每個(gè)處理選取5株紅花，在處理后的0、3、6、12、24 h采集不帶苞片的花瓣，液氮速凍后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 gDNA 和總RNA 的提取及cDNA 第1 鏈合成 于紅色紅花幼苗3～5葉期，取無(wú)病斑、無(wú)損傷的鮮葉，采用北京華越洋生物科技有限公司的植物基因組DNA 提取試劑盒提取紅色紅花gDNA；使用北京華越洋Quick RNA Isolation Kit 試劑盒提取紅色和白色紅花不同組織、不同發(fā)育時(shí)期花及紅色紅花不同激素處理的總RNA。具體操作步驟詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

利用1.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的總RNA的質(zhì)量、完整性，使用NanoDrop 2000 分光光度計(jì)測(cè)定其濃度。 使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser）將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為第1 鏈cDNA，反轉(zhuǎn)錄操作步驟詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)（Code No.RR047A）。

1.2.3CtCHS基因cDNA 和gDNA 序列的克隆 以本研究室前期不同花色紅花轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的Unigene 基因序列Uni8569 為參考序列，使用Primer Premier 5 軟件設(shè)計(jì)特異性引物（表1），分別以紅色紅花花瓣cDNA 和gDNA 為模板，使用KOD酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增體系20 μL：2× PCR buffer for KOD FX 10μL、2 mmol/L dNTPs 4μL、DNA 模板2μL、10 μmol/L 正 反 向 引 物 各0.6 μL、KOD FX 0.4μL 以及ddH2O 2.4 μL。反應(yīng)程序：94 ℃2 min；98 ℃10 s，46 ℃30 s，68 ℃2 min 30 s，35 個(gè)循環(huán)；68 ℃5 min。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，將目的條帶切下，經(jīng)TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0（Code No.9762）回收后，與TaKaRa pMD19-T 載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TaKaRa DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素（Amp）的固體LB 培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)15 h 左右。PCR 篩選陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性菌落重新挑入600 μL 含Amp 的LB 液 體 培 養(yǎng) 基 中，37 ℃200 r/min 搖菌6～8 h 后，將菌液送往河南尚亞生物技術(shù)公司測(cè)序。

表1 本研究所用引物Tab.1 Primers used in this study

1.2.4CtCHS基因序列的結(jié)構(gòu)及生物信息學(xué)分析

將克隆獲得的CtCHS的cDNA 序列和gDNA 序列分別提交GSDS 2.0 進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，將cDNA 序列提交NCBI ORF Finder 查找最大開(kāi)放閱讀框并獲得對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。運(yùn)用表2 中的在線網(wǎng)站對(duì)CtCHS基因的內(nèi)含子及編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。通過(guò)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的BlastP搜索CtCHS 同源的氨基酸序列及一些藥用植物的CHS 氨基酸序列，并使用MEGA 5.05 軟件采用Neighbor-joining 法構(gòu)建CtCHS 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，通過(guò)Bootstrap 方法對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行檢測(cè)，將Bootstrap值設(shè)置為1 000。

表2 分子生物學(xué)網(wǎng)站及分析內(nèi)容Tab.2 Molecular biology websites and application

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR） 通過(guò)qRTPCR 檢測(cè)CtCHS基因在紅花不同組織、不同發(fā)育時(shí)期的花及激素脅迫后的表達(dá)情況，使用Primer Premier 5 軟件設(shè)計(jì)定量引物（表1），內(nèi)參基因Ct60S引物序列參考文獻(xiàn)[27]。qRT-PCR 采用儀器BIORAD CFX Connect Real-Time System 進(jìn)行，試劑使用TaKaRa TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）。反應(yīng)體系10 μL：5 μL TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（2×）、1.5 μL cDNA、10μmol/L 正 反 向 引 物 各0.4 μL、2.7 μL RNase free ddH2O。首先將相同組分混勻配成混合液，之后分別加入不同體系中，以保證反應(yīng)條件的一致性，再加入差異組分。反應(yīng)程序：95 ℃30 s；95 ℃5 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，45 個(gè)循環(huán)。通過(guò)儀器自帶的熔解曲線程序分析監(jiān)測(cè)PCR 擴(kuò)增的特異性。每個(gè)qRT-PCR 反應(yīng)重復(fù)3 次。數(shù)據(jù)通過(guò)2-ΔΔCT相對(duì)定量法對(duì)基因進(jìn)行表達(dá)水平分析，運(yùn)用Excel 2007 采用TTEST法對(duì)表達(dá)量差異進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CtCHS基因cDNA和gDNA的克隆及結(jié)構(gòu)分析

以不同花色紅花轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的Unigene 基因序列Uni8569 為參考序列設(shè)計(jì)引物CtCHS-F/R（表1），分別以紅色紅花花瓣總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 及gDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得了1 000、2 000 bp 左右的條帶（圖1）。將目的條帶切膠回收后，分別連接載體pMD19-T，并轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。隨機(jī)挑選單菌落，經(jīng)PCR 篩選鑒定后，將陽(yáng)性菌液送往河南尚亞生物技術(shù)公司測(cè)序。

圖1 CtCHS基因的cDNA及gDNA擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification result of CtCHS cDNA and gDNA

將測(cè)序后的cDNA 和gDNA 序列分別用MEGA 5.05軟件與原始序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，引物CtCHSF/R 擴(kuò) 增 得 到 的cDNA 全 長(zhǎng)1 317 bp，gDNA 全 長(zhǎng)1 815 bp。將測(cè)序后的cDNA 和gDNA 序列分別提交GSDS 2.0 后發(fā)現(xiàn)，紅花CtCHS基因含有2 個(gè)外顯子、1 個(gè)內(nèi)含子（圖2）。外顯子1 位于25—220 bp，長(zhǎng)196 bp，編碼第1—66 位氨基酸；外顯子2 位于719—1 728 bp，長(zhǎng)1 010 bp，編碼第66—401 位氨基酸；內(nèi)含子位于221—718 bp，長(zhǎng)498 bp，在氨基酸序列Cys66密碼子的第1、2堿基。

圖2 CtCHS基因結(jié)構(gòu)示意Fig.2 Gene structure diagram of CtCHS

2.2 CtCHS基因的內(nèi)含子分析

基因序列分析結(jié)果表明，CtCHS的外顯子和內(nèi)含子的剪切符合GT-AG 剪切法則[28]，且CtCHS的5′端剪切供體序列是GCATGTgtatgt，3′剪切受體序列為tttcagGTGATA（大寫(xiě)表示外顯子序列，小寫(xiě)表示內(nèi)含子序列），說(shuō)明其內(nèi)含子剪接機(jī)制較為保守。此外，CtCHS內(nèi)含子中堿基A 數(shù)目為161，堿基T 為186，AT 含量為69.68%，GC 含量為30.32%，AT 含量明顯高于GC 含量，且明顯高于外顯子中AT 含量（39.8%），這與非編碼區(qū)AT 含量高的特點(diǎn)是一致的。

使用Plant CARE 分析內(nèi)含子序列后發(fā)現(xiàn)，CtCHS基因的內(nèi)含子含有多個(gè)真核生物啟動(dòng)子響應(yīng)元件TATA-box 和增強(qiáng)子元件CAAT-box，可能在增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮作用。另外，內(nèi)含子序列中還有富含AT 的DNA 結(jié)合蛋白（ATBP-1）的結(jié)合位點(diǎn)AT-rich element、光響應(yīng)元件的一部分TCT-motif、光響應(yīng)元件GT1-motif、光響應(yīng)模塊的部分元件AEbox、參與光響應(yīng)的MYB 結(jié)合位點(diǎn)MRE、干旱脅迫響應(yīng)元件MBS（表3），說(shuō)明CtCHS內(nèi)含子可能參與了該基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并可能受光照、干旱等的誘導(dǎo)。

表3 CtCHS基因內(nèi)含子中的特異順式作用元件Tab.3 Specific cis-acting elements in intron of CtCHS gene

2.3 CtCHS基因編碼蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

使用NCBI ORF Finder 查找后發(fā)現(xiàn)，所克隆的CtCHS基因的1 317 bp cDNA 序列中含有1 個(gè)1 206 bp 的最大開(kāi)放閱讀框（25—1 230 bp），起始密碼子ATG，終止密碼子TAG，編碼401個(gè)氨基酸。在其氨基酸序列中能找到CHS高度保守的特征性多肽序列RLMMYQQGCFAGGTVLR 和GVLFGFGPGL[14]。通過(guò)NCBI CD-search 分析CtCHS 氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，CtCHS 含有3 個(gè)活性位點(diǎn)C170、H309、N342，這3個(gè)活性位點(diǎn)構(gòu)成了查爾酮合成酶典型的三聯(lián)催化中心C-H-N（圖3A）。此外，CtCHS還含有8個(gè)丙二酰輔酶A結(jié)合位點(diǎn)K61/R64/M65/F221/F271/312G/313P/314A，15 個(gè)產(chǎn)物的結(jié)合位點(diǎn)和30個(gè)雙聚體組合的接合面。植物CHS蛋白家族常見(jiàn)的保守域CHS_like、Chal_sti_synt_N、PLN03170、BH0617等在CtCHS蛋白的保守域分析中也都能找到。

蛋白質(zhì)氨基酸的親疏水性主要由其側(cè)鏈基團(tuán)R決定，如果R僅為H或是C、H 2個(gè)元素組成，均是疏水的，如果含有極性側(cè)鏈基團(tuán)，如-OH、-SH、-COOH、-NH2等，則是親水的。根據(jù)ExPASy-Prot Scale 在線工具的Hphob./Kyte&Doolittle 算法對(duì)CtCHS 蛋白的親水/疏水性進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3B 所示。從整體來(lái)看，親水氨基酸（負(fù)值）稍多于疏水氨基酸（正值），表明CtCHS 蛋白為親水性蛋白，且第360 位丙氨酸（Ala，A）分值最低（-2.644），親水性最強(qiáng)，第348 位纈氨酸（Val，V）分值最高（2.422），疏水性最強(qiáng)。另外，采用ExPASy-ProtParam 分析CtCHS 蛋白的總平均親水性（GRAVY），其值為-0.069，這與上述結(jié)論是一致的。

信號(hào)肽是引導(dǎo)蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移的一段疏水性氨基酸，負(fù)責(zé)把蛋白質(zhì)引導(dǎo)到含不同膜結(jié)構(gòu)的亞細(xì)胞器內(nèi)。經(jīng)SignalP 4.0 Server 在線軟件分析發(fā)現(xiàn)，CtCHS 蛋白平均信號(hào)肽分值Mean S 為0.125，低于0.5，表明CtCHS 蛋白不存在信號(hào)肽（圖3C），可能在合成處起作用，不存在轉(zhuǎn)運(yùn)。

圖3 CtCHS編碼蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析Fig.3 Bioinformatic analysis of the protein encoded by CtCHS

蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)分析有助于蛋白質(zhì)功能的初步分析，如某蛋白質(zhì)沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)，但是亞細(xì)胞定位顯示其可定位于膜相關(guān)結(jié)構(gòu)，則說(shuō)明該蛋白質(zhì)可能是通過(guò)其他膜定位蛋白質(zhì)招募過(guò)去的。另外，蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)分析也和蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)密切相關(guān)，而基因定位于哪個(gè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，與其功能是密切相關(guān)的。使用TMHMM Server V.2.0 在線分析軟件對(duì)CtCHS 蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，CtCHS 蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)，可能定位于與膜無(wú)關(guān)的結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步的亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，CtCHS 蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)（表4）。

表4 CtCHS亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果Tab.4 Subcellular localization prediction results of CtCHS

2.4 CtCHS蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索已報(bào)道的一些藥用植物CHS 的氨基酸序列，構(gòu)建鄰接法系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分析藥用植物CHS 的進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果（圖4）顯示，CtCHS 與已報(bào)道的 紅花CtCHS2（BAV37882.1）有99%的同源性，而與CtCHS4（ATZ81753.1）、CtCHS3（BAV37883.1）進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，表明CtCHS 家族成員存在不同的進(jìn)化。另外，CtCHS 與同為菊科的矢車(chē)菊CHS 首先聚為一支，表明進(jìn)化關(guān)系最近，其次與菊科大薊、黃花蒿聚為一個(gè)大分支，表明進(jìn)化關(guān)系也較近，而與蘭科白芨和鐵皮石斛、鳶尾科香雪蘭、唇形科黃芩等的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。進(jìn)化分析結(jié)果還表明，同科不同種的CHS 進(jìn)化關(guān)系較近，比如同為菊科的紫莖澤蘭、CtCHS1、金龍膽草、菊花聚成一個(gè)大分支，而同為蓼科的苦蕎、虎杖，同為豆科的甘草、膜莢黃芪等各自聚為一個(gè)小分支，表明藥用植物CHS蛋白具有明顯的種屬特性。

圖4 CtCHS蛋白與藥用植物CHS蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic tree of CtCHS and CHS in pharmaceutical plants

2.5 CtCHS基因的組織特異性表達(dá)分析

利用qRT-PCR檢測(cè)不同紅花不同組織（初期果球、苞片、幼根、幼莖、幼葉）及不同發(fā)育時(shí)期花中CtCHS基因的表達(dá)量。結(jié)果（圖5）表明，不同品種CtCHS基因均是在花中表達(dá)量最高，在初期果球和幼根中的表達(dá)量最低。不同發(fā)育時(shí)期花中，紅色和白色紅花中，CtCHS基因的表達(dá)量呈現(xiàn)相同的表達(dá)趨勢(shì)，且均是在S6 期表達(dá)量最高，其次是S2，但不同的是紅色紅花中CtCHS在S3期表達(dá)量最低，而白色紅花在S4期表達(dá)量最低。另外，紅色和白色紅花中CtCHS基因的表達(dá)量在花發(fā)育的S1、S3期及幼莖和幼葉中差異顯著（P<0.05），在花發(fā)育的S5期差異極顯著（P<0.01），而在其他時(shí)期、其他組織中差異不顯著。

圖5 不同品種紅花中CtCHS基因的組織表達(dá)模式分析Fig.5 Tissue expression analysis of CtCHS gene in different varieties of Carthamus tinctorius L.

2.6 CtCHS基因在不同激素處理下的表達(dá)模式分析

qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果表明，茉莉酸甲酯處理3 h后，CtCHS基因的表達(dá)受到誘導(dǎo)，表達(dá)量最高，但在處理12、24 h 后表達(dá)量變化不明顯（圖6A）。另外，qRT-PCR 檢測(cè)表明，該基因的表達(dá)受赤霉素、脫落酸、生長(zhǎng)素的強(qiáng)烈抑制（圖6B、6C、6D）。其中，赤霉素和生長(zhǎng)素處理24 h 后抑制效果最顯著；而脫落酸在處理后的3 h 表達(dá)量最低，處理6 h 后表達(dá)量上升，之后表達(dá)量又下降。

圖6 CtCHS在不同激素處理下的表達(dá)分析Fig.6 Relative expression analysis of CtCHS under different hormone stresses

3 結(jié)論與討論

內(nèi)含子是真核生物中的一段特殊DNA序列，無(wú)編碼功能，在mRNA 加工過(guò)程中被剪切掉，最終不存在于成熟RNA 分子中[25]。通常認(rèn)為內(nèi)含子不具有基因功能，是冗余的DNA 序列，然而近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明，內(nèi)含子含有類(lèi)似增強(qiáng)子等的順式作用元件，可以增強(qiáng)基因表達(dá)，在基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)調(diào)控及基因演變過(guò)程中有重要作用[30]。另外，內(nèi)含子的選擇性剪接，可以使一個(gè)基因在不同組織細(xì)胞中、不同發(fā)育階段產(chǎn)生特定功能的蛋白質(zhì)，以滿足機(jī)體代謝的需要[28]。本研究在CtCHS基因的內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)了TATA 及CAAT 等真核生物啟動(dòng)子響應(yīng)元件、TCT 及GT1 等光響應(yīng)元件、MBS 等逆境應(yīng)答元件，表明CtCHS基因內(nèi)含子可能具有增強(qiáng)該基因轉(zhuǎn)錄的作用，并可能受光照、干旱脅迫誘導(dǎo)，但具體的功能還需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

不同植物中的CHS基因大多含有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，且第1個(gè)外顯子編碼30～60個(gè)或更多氨基酸，第2 個(gè)外顯子編碼340 多個(gè)氨基酸[14]，僅有少數(shù)例外，如從白芨中克隆獲得的CHS基因沒(méi)有內(nèi)含子[18]，金魚(yú)草CHS含有2 個(gè)內(nèi)含子[31]。本研究克隆所得的基因含有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，外顯子1編碼第1—66位氨基酸，外顯子2編碼第66—401位氨基酸，這與上述結(jié)論是一致的，且與大多數(shù)已報(bào)道的植物CHS基因的結(jié)構(gòu)也是相似的[32?33]。此外，不同植物CHS基因中內(nèi)含子的位置大致相同，介于第60 位左右Cys 密碼子的第1、2 堿基，但是內(nèi)含子長(zhǎng)度從50 bp 至幾個(gè)kb 不等[14]。本研究所獲得的基因 的 內(nèi) 含 子 在gDNA 序 列 的221—718 bp，長(zhǎng)498 bp，推導(dǎo)其介于氨基酸序列的Cys66 密碼子的第1、2堿基，與上述研究結(jié)果一致。

生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，CtCHS 蛋白的總平均親水性（GRAVY）值為-0.069，且親水氨基酸（負(fù)值）稍多于疏水氨基酸（正值），表明CtCHS 為親水性蛋白，這和鐵皮石斛、艾納香及藤茶CHS 蛋白的性質(zhì)一樣[15?16，33]，而與張?zhí)萚34]報(bào)道的金花茶等10種觀賞植物CHS基因編碼的蛋白質(zhì)可能為穩(wěn)定的疏水性蛋白的觀點(diǎn)不一致。另外，生物信息學(xué)分析還發(fā)現(xiàn)，CtCHS 不存在信號(hào)肽，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，定位于細(xì)胞質(zhì)，這些和大多數(shù)報(bào)道的CHS基因的結(jié)構(gòu)也是一致的[15，32]。這也表明大多數(shù)植物中的查爾酮合成酶均是在細(xì)胞質(zhì)中的核糖體上合成后直接發(fā)揮作用，不經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)。 但也有少數(shù)例外，比如SASLOWSKY 等[35]的研究表明，擬南芥CHS 蛋白定位于細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和液泡膜；TIAN 等[36]對(duì)葡萄發(fā)育過(guò)程中CHS 的定位研究表明，CHS 蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和表皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中；甘蔗的7 個(gè)CHS基因有不同的定位分布[22]。

本研究中，經(jīng)組織特異性表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，CtCHS基因在花中的表達(dá)量高于其他組織，而在初期果球和幼根中的表達(dá)量最低。桑樹(shù)中的5個(gè)CHS基因表現(xiàn)出不同的組織表達(dá)模式，MaCHS1/MaCHS2在果實(shí)中表達(dá)量較高，MaCHS4在根皮、莖皮和老葉中表達(dá)顯著，而MaCHS3和MaCHS5在老葉中表達(dá)量最高[37]。表明CHS 超基因家族不同成員的表達(dá)模式不盡相同。另外，劉秀明等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，CtCHS1在吉紅油姊妹系的盛花期和衰落期表達(dá)量最高，而在吉紅一號(hào)的花蕾期和盛花期的表達(dá)量最高，推測(cè)品種的差異性也可能導(dǎo)致CHS基因的表達(dá)量不同。本研究發(fā)現(xiàn)，紅色紅花中CtCHS在S3 期表達(dá)量最低，白色紅花在S4 期表達(dá)量最低，且紅色和白色紅花中CtCHS基因的表達(dá)量在花發(fā)育的S1、S3時(shí)期及幼莖和幼葉中差異顯著，在花發(fā)育的S5時(shí)期差異極顯著，這與上述觀點(diǎn)一致。另外，研究發(fā)現(xiàn)，白芨BsCHS在花和莖中表達(dá)較強(qiáng)，葉和根部次之，嫩蒴果最低[18]；藤茶中AgCHS1在成熟葉和花中的表達(dá)量最高，在老葉中的表達(dá)量最低[33]；菊芋HtCHS在根中表達(dá)量最高，其次是塊莖、莖和葉片[32]；向日葵HaCHS在花中表達(dá)量最高，其次是盤(pán)、葉、莖和種子，在根中的表達(dá)量最低[38]。表明CHS的表達(dá)受發(fā)育階段和環(huán)境因子的影響，在不同植物、不同組織部位及不同時(shí)期的表達(dá)量不同。

本研究中，CtCHS受茉莉酸甲酯的誘導(dǎo)不明顯，與CtCHS4響應(yīng)茉莉酸甲酯誘導(dǎo)促進(jìn)了紅花醌式查爾酮類(lèi)化合物的積累[26]的研究結(jié)果有些差異，這可能是品種間的差異造成的。薛英茹[39]研究發(fā)現(xiàn)，CtCHS基因響應(yīng)茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的模式因品種不同而不同，同一個(gè)CHS基因在茉莉酸甲酯處理云南巍山紅花后表達(dá)量明顯升高，而處理新紅花7號(hào)后，該基因的表達(dá)量則有所降低，特別在誘導(dǎo)后的6、12 h降低最明顯。薛英茹[39]還發(fā)現(xiàn)，CtCHS3720、CtCHS1515和CtCHS533基因?qū)t花黃酮類(lèi)生物合成途徑的貢獻(xiàn)因品種不同而不同，可能參與了紅花不同化學(xué)型品系黃酮類(lèi)化合物的形成過(guò)程。另外，研究也表明，CHS 超基因家族雖然在氨基酸水平上表現(xiàn)出高度的相似性，但在進(jìn)化過(guò)程中可能存在冗余或不同的功能，因此對(duì)激素的響應(yīng)也是不同的，比如5 個(gè)MaCHS基因在不同脅迫處理后表現(xiàn)出不同的響應(yīng)模式[37]。而本研究中CtCHS受赤霉素、生長(zhǎng)素、脫落酸的強(qiáng)烈抑制，和苦蘵PaCHS1及向日葵HaCHS上的研究結(jié)果是相似的[23，38]。