李 萌，王旭東，羅昭標，宋嘉寶，曲 鵬，候?qū)帉?，郭林青，?智，馬 林

（1. 鄭州輕工業(yè)大學 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450002；2. 江西省煙草公司撫州市公司，江西 撫州 344000；3. 四川中煙工業(yè)有限責任公司 新型煙草制品中心，四川 成都 610021；4. 四川三聯(lián)新材料有限公司新型煙草事業(yè)部，四川 成都 610100；5.紅云紅河煙草（集團）有限責任公司，云南 昆明 650231）

煙草發(fā)酵是卷煙加工過程中重要的環(huán)節(jié)，微生物在發(fā)酵過程中發(fā)揮重要作用。發(fā)酵后煙葉刺激性減小，煙草特征香氣顯露，吸食品質(zhì)改善。煙葉發(fā)酵的方法一般分為人工發(fā)酵和自然發(fā)酵[1]，自然發(fā)酵時間長、成本高，人工添加有益微生物在煙葉發(fā)酵中能夠縮短發(fā)酵和醇化時間、降低煙堿含量和增加香氣含量，改善煙葉品質(zhì)[2]。早在20世紀中期，IZQUIERDO[3]利用微球菌屬（Micrococcus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）菌株或者兩者混菌發(fā)酵煙葉，煙葉抽吸品質(zhì)得到改善。ENGLISH 等[4]利用從煙葉上分離出的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和嗜熱芽孢桿菌（Thermophilic bacillus）發(fā)酵煙葉，經(jīng)混菌發(fā)酵的煙葉產(chǎn)生悅?cè)说姆枷恪＠梦⑸镎T導煙葉產(chǎn)生香氣物質(zhì)的研究在國內(nèi)開展較晚，羅家基等[5]將從煙葉中篩選出的優(yōu)勢芽孢桿菌隨機混合發(fā)酵，經(jīng)評吸發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵煙葉比未施加菌液的發(fā)酵煙葉具有更加明顯的煙香；趙銘欽等[6]利用2 種增香菌和3 種微生物酶配制而成的煙草發(fā)酵增質(zhì)劑對在線配方煙葉進行了處理，經(jīng)評吸表明微生物發(fā)酵增質(zhì)劑對提高卷煙整體香吃味質(zhì)量作用明顯；鄭澤浩[7]利用多個高產(chǎn)水解酶的菌株配伍制備復(fù)合菌劑，噴灑于煙葉表面發(fā)酵，能顯著改善煙葉品質(zhì)；王穎等[8]研究單一菌株和復(fù)配菌株對卷煙葉組化學成分的影響，煙葉吸食品質(zhì)明顯改善；帥瑤等[9]使用解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliticus）對煙葉進行混菌發(fā)酵，能縮短發(fā)酵時間，提高蛋白酶活力和煙葉感官質(zhì)量；龍章德等[10]采用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Oligotrophic maltophilia）混合發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)混合微生物發(fā)酵后煙葉香氣質(zhì)、香氣量均有所增加，煙葉刺激性和雜氣均降低。目前，關(guān)于混合微生物發(fā)酵煙葉的研究中菌株多為細菌且未對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，應(yīng)用酵母發(fā)酵煙葉研究較少。酵母是一類重要的產(chǎn)香微生物，可利用多種基質(zhì)產(chǎn)生香氣物質(zhì)，具有安全性好、生長速度快等諸多優(yōu)點。低次煙葉香氣量不足、雜氣重、刺激性強，難以在配方中應(yīng)用或僅能用于低檔卷煙，通常只能通過加香處理補充其香氣。郭林青等[11]將從水果中篩選的產(chǎn)香酵母（有孢漢遜酵母屬，Hansenia）接種到煙葉上進行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)對煙末發(fā)酵能產(chǎn)生香味物質(zhì)。鑒于此，將前期篩選到的2 株產(chǎn)香酵母混合接種于低次煙葉中進行發(fā)酵，探究混菌發(fā)酵對煙葉致香成分的影響，以彌補低次煙葉香味不足的缺點，旨在為應(yīng)用多菌株混合發(fā)酵改善低次煙葉品質(zhì)提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品與菌株 低次煙葉來源于河南中煙工業(yè)有限責任公司技術(shù)中心（2016 年度平頂山DBF31 復(fù)烤煙葉）。產(chǎn)香酵母菌株為鄭州輕工業(yè)大學煙草生物技術(shù)實驗室分離篩選的優(yōu)質(zhì)酵母菌株：YJX（有孢漢遜酵母屬）和MG（畢赤酵母屬，Pichia）。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 YPD 培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸膏1%。

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 主要試劑：葡萄糖（AR，天津市致遠化學試劑有限公司）、蛋白胨（AR，北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司）、無水硫酸鈉（天津市致遠化學試劑有限公司）、二氯甲烷（天津市富宇精細化工有限公司）、氯化鈉（AR，天津市恒興化學試劑制造有限公司）。

主要儀器設(shè)備：煙草固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)艙（鄭州輕工業(yè)大學煙草生物技術(shù)實驗室自主研制）、落地恒溫振蕩器HZQ-211C（上海一恒科學儀器有限公司）、電熱恒溫水浴鍋HWS-12（上海一恒科學儀器有限公司）；立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器LXC35L（合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司）、無菌操作臺SW-CJ-2D（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、低溫冷卻液循環(huán)泵DLSB-5/20（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）、SHSL型調(diào)溫電熱套（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 產(chǎn)香酵母生長曲線的測定 將產(chǎn)香酵母接種到種子培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min 條件下活化培養(yǎng)24 h，在無菌條件下，將活化后的種子液接種至新的種子培養(yǎng)基中，并設(shè)置空白對照。每隔一段時間取樣，采用紫外可見分光光度計檢測其OD600，以反映菌體生長量。

1.2.2 單因素試驗

1.2.2.1 最佳發(fā)酵溫度的確定 取1 000 g 低次煙葉放入固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)艙，在發(fā)酵濕度70%、混菌比（YJX∶MG，下同）1∶1、接種量20%的條件下，分別在24、27、30、33、36 ℃下發(fā)酵24 h，發(fā)酵結(jié)束后測定煙葉揮發(fā)性致香成分含量。

1.2.2.2 最佳混菌比的確定 取1 000 g 低次煙葉放入固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)艙，在發(fā)酵濕度70%、發(fā)酵溫度30 ℃、接種量20%的條件下，分別以混菌比1∶0、1∶2、1∶1、2∶1、0∶1 條件下發(fā)酵24 h，發(fā)酵結(jié)束后測定煙葉揮發(fā)性致香成分含量。

1.2.2.3 最佳接種量的確定 取1 000 g 低次煙葉放入固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)艙，在發(fā)酵濕度70%、發(fā)酵溫度30 ℃、混菌比1∶1 的條件下，分別取10%、15%、20%、25%、30%的菌懸液噴灑在低次煙葉上發(fā)酵24 h，發(fā)酵結(jié)束后測定煙葉揮發(fā)性致香成分含量。

1.2.3 正交試驗設(shè)計 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取發(fā)酵溫度（T）、混菌比（H）、接種量（J）3個因素，每個因素選3個水平，以煙葉致香成分含量為指標，進行正交試驗，確定最佳發(fā)酵條件。正交試驗因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平Tab.1 Orthogonal test factors and levels

1.2.4 煙葉揮發(fā)性致香成分分析 采用同時蒸餾萃取技術(shù)結(jié)合氣相色譜/質(zhì)譜（GC/MS）聯(lián)用測定發(fā)酵煙葉揮發(fā)性致香成分。將發(fā)酵后的煙葉在40 ℃烘箱中干燥，用粉碎機粉碎后過孔徑為0.425 mm篩，準確稱取25 g 煙末樣品、30 g 氯化鈉和200 mL水放入同時蒸餾萃取裝置一端的圓底燒瓶中，裝置的另一端盛有60 mL 二氯甲烷，在60 ℃下水浴加熱，同時蒸餾萃取2.5 h。同時蒸餾萃取完成后，二氯甲烷萃取液用無水硫酸鈉干燥，4 ℃下靜置過夜，過濾，加入1 mL的內(nèi)標物后濃縮，萃取液濃縮不足1 mL 時，濃縮結(jié)束，用二氯甲烷定容至1 mL，過0.22 μm 濾膜于2.0 mL 的色譜瓶中，立即進行上機檢測。

1.2.5 GC/MS 檢測條件 色譜柱HP-5MS（60 m ×0.25 mm×0.25μm）；進樣口溫度280 ℃；載氣為高純氦氣；柱溫箱為程序升溫，起始溫度50 ℃保持1 min，以4 ℃/min 升至148 ℃保持1 min，以2 ℃/min升至172 ℃保持1 min，以4 ℃/min 升至280 ℃保持5 min；分流比5∶1；流速3.0 mL/min。離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；EI 離子源70 eV；質(zhì)量掃描范圍35～550 amu；采用NIST14檢索。

1.2.6 感官評吸 將最佳發(fā)酵條件下發(fā)酵24 h 的煙葉切絲后進行卷制，置于溫度（22±1）℃、相對濕度（60±2）%的恒溫恒濕箱中平衡48 h。由7 人組成的專業(yè)評吸小組根據(jù)YC/T 138—1998[12]中的方法進行評吸，對抽吸結(jié)果進行感官質(zhì)量評價。

1.3 統(tǒng)計分析

采用Excel 2010、Origin 2018 和SPSS 22.0 對試驗數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌YJX和MG生長曲線

YJX 和MG 的 生 長 對 數(shù) 期 為8～18 h、6～20 h（圖1）。因此，取13 h 作為YJX 和MG 的最佳活化時間。

圖1 酵母菌YJX和MG生長曲線Fig.1 YJX yeast and MG yeast growth curve

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 發(fā)酵溫度對煙葉致香成分總量的影響 由圖2 可知，在24～36 ℃，煙葉致香成分含量隨溫度的升高先增加后減少。當發(fā)酵溫度在30 ℃時，煙葉中的致香成分總含量最高；之后溫度升高，煙葉中的致香成分總量減少。綜合考慮，選用27、30、33 ℃進行正交優(yōu)化試驗。

圖2 發(fā)酵溫度對煙葉致香成分總量的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on the total amount of aroma components in tobacco leaves

2.2.2 混菌比對煙葉致香成分總量的影響 單菌株發(fā)酵的煙葉致香成分總量普遍低于混菌發(fā)酵的煙葉致香成分總量。由圖3 可知，在混菌比為1∶1時，煙葉致香成分含量最高；在混菌比為1∶2 和2∶1條件下，煙葉致香成分總量均有所下降。綜合考慮，選擇混菌比1∶2、1∶1和2∶1進行正交優(yōu)化試驗。

圖3 混菌比對煙葉致香成分總量的影響Fig.3 Effect of mixed bacteria ratio on the tobal amount of aroma components in tobacco leaves

2.2.3 接種量對煙葉致香成分總量的影響 由圖4可知，隨著微生物接種量的增加，煙葉致香成分總量呈現(xiàn)出先增大后減少的趨勢。當接種量為25%時，煙葉致香成分總量最高；當接種量為20%和30%時，煙葉致香成分總量下降。綜合考慮，選擇15%、20%和25%進行正交優(yōu)化試驗。

圖4 接種量對煙葉致香成分總量的影響Fig.4 Effect of inoculation volume on the tobal amount aroma components in tobacco leaves

2.3 正交試驗結(jié)果

由表2 可知，影響發(fā)酵煙葉致香成分總量的各因素主次順序為混菌比>接種量>發(fā)酵溫度，說明混菌比的作用最大。最佳發(fā)酵條件為H3J3T2，即混菌比為2∶1、接種量為25%、發(fā)酵溫度30 ℃時，增香效果最好。

表2 正交試驗結(jié)果Tab.2 Orthogonal experimental results

2.4 單菌和混菌發(fā)酵煙葉揮發(fā)性致香成分分析

通過同時蒸餾萃取和GC/MS 分別對未發(fā)酵煙葉、單菌和混菌發(fā)酵煙葉樣品揮發(fā)性致香成分進行測定。采用NIST14譜庫檢索定性和內(nèi)標法定量，結(jié)果如表3 所示，共檢測到揮發(fā)性致香成分95 種，包含12種醇類、21種羰基類、8種酸類、15種酯類和內(nèi)酯類、23種烴類、10種雜環(huán)類和6種酚類化合物。

表3 不同處理發(fā)酵煙葉揮發(fā)性致香成分GC/MS分析結(jié)果Tab.3 GC/MS analysis results of volatile aroma components in tobacco leaf fermentation under different treatments μg/g

續(xù)表3 不同處理發(fā)酵煙葉揮發(fā)性致香成分GC/MS分析結(jié)果Tab.3（Continued） GC/MS analysis results of volatile aroma components in tobacco leaf fermentation under different treatments μg/g

續(xù)表3 不同處理發(fā)酵煙葉揮發(fā)性致香成分GC/MS分析結(jié)果Tab.3（Continued） GC/MS analysis results of volatile aroma components in tobacco leaf fermentation under different treatments μg/g

不同處理下發(fā)酵煙葉的揮發(fā)性致香成分含量有明顯差異,在醇類化合物中，苯甲醇、苯乙醇和芳樟醇等重要香味物質(zhì)含量都有提高，其中苯甲醇和苯乙醇是芳香族氨基酸裂解產(chǎn)物，可增加煙葉的花香香味[13]，芳樟醇是類胡蘿卜素降解產(chǎn)物，也屬于萜類化合物，能夠為煙草增加柔和的玫瑰香味。羰基類化合物中大多是類胡蘿卜素降解產(chǎn)物，由于其化學物質(zhì)閾值相對較低，對煙葉香氣質(zhì)量起主要作用[14]。與未添加微生物發(fā)酵的樣品相比，混菌發(fā)酵煙葉樣品中大馬酮和β-紫羅蘭酮含量分別提升61.14%和100.25%，且檢測出4-羥基-β-二氫大馬酮、螺巖蘭草酮、法尼基丙酮、α-大馬酮等重要香味物質(zhì)，增加了煙草中的清香、玫瑰香等[15]。在酸類化合物中，棕櫚酸香氣物質(zhì)含量較未添加微生物發(fā)酵提升79.86%，能夠增加豐滿度，間接影響煙氣的香味。在酯類和內(nèi)脂類化合物中，二氫獼猴桃內(nèi)脂是重要的類胡蘿卜素降解產(chǎn)物，混菌發(fā)酵煙葉中二氫獼猴桃內(nèi)酯含量較未添加微生物發(fā)酵提高147.67%，對消除煙氣刺激性具有重要作用，亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯較未添加微生物發(fā)酵分別提升42.76%和57.10%，這2 種物質(zhì)對于增加煙氣的醇和和濃度具有明顯的效果。

總體來說，混菌發(fā)酵煙葉中的揮發(fā)性致香成分含量明顯高于單菌發(fā)酵和未添加微生物發(fā)酵煙葉，混菌發(fā)酵的揮發(fā)性致香成分含量較YJX 發(fā)酵提高22.9%，較MG 發(fā)酵提高16.4%；混菌發(fā)酵煙葉中的醇類、羰基類和酸類相對含量明顯增加，酯類和內(nèi)酯類相對含量無明顯變化（圖5）。

圖5 揮發(fā)性致香成分不同類別含量分布Fig.5 Content distribution of different categories of volatile aroma components

2.5 煙葉發(fā)酵感官評吸結(jié)果

不同處理方式煙葉感官評吸結(jié)果（圖6）顯示，混菌發(fā)酵和單菌發(fā)酵煙葉均好于未添加微生物發(fā)酵煙葉，混菌發(fā)酵煙葉感官評吸結(jié)果最好。YJX∶MG=2∶1 發(fā)酵后的卷煙香氣質(zhì)、香氣量、濃度、余味改善較為明顯。

圖6 不同處理方式卷煙評吸結(jié)果Fig.6 The evaluatuin results of cigarettes by different treatment methods

3 結(jié)論與討論

本研究以低次煙葉作為發(fā)酵底物探究混菌發(fā)酵對煙葉品質(zhì)的影響，主要考察了發(fā)酵溫度、混菌比和接種量對煙葉香味成分的影響。通過正交優(yōu)化試驗得到最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度30 ℃、混菌比2∶1、接種量25%、發(fā)酵時間24 h，發(fā)酵過程中致香物質(zhì)含量影響因素的主次為混菌比>接種量>發(fā)酵溫度。隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵煙葉致香成分總量先增加后減少，可能是由于溫度過高微生物代謝受到抑制導致[16]?；炀仁怯绊憻熑~致香物質(zhì)含量最主要的因素，隨著混菌比的變化，煙葉中致香成分總量差異明顯，這可能是由混合菌株的協(xié)調(diào)性決定的，在發(fā)酵體系中不同菌株的接種比例直接與這個體系中每一種微生物的生長密度和速度有關(guān)，影響混合發(fā)酵產(chǎn)物的組成，只有混合比例合適才能更大地發(fā)揮各自的優(yōu)點[17]。

煙葉的香氣是評定煙葉品質(zhì)的重要指標[18]。與優(yōu)質(zhì)煙葉相比，低次煙葉最大的缺陷是香氣量不足。煙葉香氣物質(zhì)按致香官能團進行分類可分為醇類、酮類、醛類、酯類、酸類、雜環(huán)類和烴類等[19]，其中醇類、酮類、醛類和酯類對煙葉香氣起主導作用，其含量可用來衡量香氣的強弱[20]。本研究利用混菌發(fā)酵煙葉致香成分含量明顯高于單菌發(fā)酵，揮發(fā)性致香成分含量顯著提升。就具體致香成分而言，苯甲醇、苯乙醇、芳樟醇、葉綠醇、大馬酮、β-紫羅蘭酮、棕櫚酸、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯等重要香氣物質(zhì)含量增加，這可能是由于酵母菌代謝主要促進類胡蘿卜素降解、芳香族氨基酸代謝；金合歡醇、α-大馬酮、2，4-二甲基苯甲醛等重要香氣物質(zhì)只有在混菌發(fā)酵煙葉中檢測到，這可能是由于混菌發(fā)酵能夠獲得某些單一微生物發(fā)酵無法得到的產(chǎn)物[21]。感官評吸結(jié)果表明，混菌發(fā)酵豐富了煙葉的花香和果香味等，這與增加的香味物質(zhì)多為花香和果香物質(zhì)一致，發(fā)酵后煙葉香氣充足，刺激性減小，感官質(zhì)量明顯提高。

本研究通過正交試驗優(yōu)化混菌發(fā)酵煙葉條件，利用GC/MS 對不同處理發(fā)酵煙葉中的揮發(fā)性致香成分進行分析，發(fā)現(xiàn)混菌發(fā)酵能夠明顯增加低次煙葉醇類和羰基類等重要香氣物質(zhì)含量，發(fā)酵后低次煙葉感官品質(zhì)顯著提升。本研究采用混菌發(fā)酵改善低次煙葉品質(zhì)，但其發(fā)酵機制還有待進一步探索，發(fā)酵條件也有待進一步深入優(yōu)化，為應(yīng)用到工業(yè)發(fā)酵中提供參考。