萬華方， 陳松余， 冬夢荃， 丁一娟，楊楠， 黃登文， 孫峻溟， 錢偉

西南大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院/農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院， 重慶 400715

核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)屬子囊菌門(Ascomycota)、 核盤菌科(Sclerotiniaceae)、 核盤菌屬(Sclerotinia)真菌， 能夠廣泛侵染包括甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)在內(nèi)的400多種植物[1]. 甘藍(lán)型油菜是重要油料作物之一， 廣泛種植于中國、 加拿大及歐洲等溫帶地區(qū)[2-3]， 供給全世界約13%的植物油， 是全世界傳統(tǒng)食用油和能源用油的重要來源. 核盤菌侵染所致的菌核病可引起油菜減產(chǎn)10%～20%， 嚴(yán)重時可達(dá)80%[4]. 目前， 油菜菌核病的防控方法各有局限， 如化學(xué)防治不僅導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、 病菌的抗藥性增強(qiáng)、 生態(tài)環(huán)境惡化， 還可引起農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本增加[5-6]. 菌核在土壤中存活時間長， 且其寄主植物范圍廣， 作物輪作也很難對其實現(xiàn)有效控制[7]. 栽培油菜中缺乏抗病資源， 也制約其抗性育種進(jìn)程[8]. 近年來， 生物防治逐漸成為菌核病防控的新策略， 核盤菌的生防制劑研究也取得了一些進(jìn)展， 比如盾殼霉(Coniothyriumminitans)能抑制核盤菌子囊孢子對油菜葉片的侵染， 并減少其子實體的產(chǎn)生數(shù)量， 有效降低油菜菌核病的發(fā)病率[9-11]. 印度梨形孢(Piriformosporaindica)由Kost等[12]發(fā)現(xiàn)于印度沙漠地區(qū)灌木叢根部， 因其孢子類似梨形而得名. 印度梨形孢的共生不僅有利于植物對營養(yǎng)元素的吸收[13-15]， 促進(jìn)植物生長[16-18]， 還對部分病原真菌有抑制作用. 印度梨形孢能夠抑制大麥布氏白粉病菌(Blumeriagraminisf. sp. tritici)[19]、 小麥基腐病菌(Pseudocercosporellaherpotrichoides)[20]、 黃萎病菌(Verticilliumdahliae)[21]、 串珠鐮孢菌(Fusariumverticillioides)[22]以及灰霉病菌(Botrytiscinerea)[23]等， 可能是一種重要的植物病害生物防控資源. 灰霉病菌與核盤菌屬真菌近緣， 尤其與核盤菌親緣關(guān)系較近[24]. 基于印度梨形孢可以有效抑制灰霉菌， 我們推測其可能也是核盤菌生物防治的潛在資源. 為此， 本研究對核盤菌與印度梨形孢進(jìn)行對峙培養(yǎng)， 探究印度梨形孢對核盤菌的體外抑制作用， 并分析對峙培養(yǎng)過程中核盤菌生長發(fā)育、 逆境脅迫響應(yīng)關(guān)鍵基因的表達(dá)水平， 解析其抑制作用機(jī)理， 為利用印度梨形孢對菌核病進(jìn)行生物防治提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

試驗于2019-2020年在重慶市油菜工程技術(shù)研究中心進(jìn)行.

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株

核盤菌“1980”由重慶市油菜工程技術(shù)研究中心保存， 參考Mei等[25]的方法進(jìn)行活化與繼代培養(yǎng). 印度梨形孢“DSM 11872”由長江大學(xué)張文英教授惠贈， 其培養(yǎng)參照J(rèn)ohnson等[26]的方法進(jìn)行. 大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)為DH5α菌株.

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基

聚乙二醇(PEG-4000)， 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar， PDA)， 馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(Potato Dextrose Broth， PDB)等均購自北京酷來搏科技有限公司(Coolaber). 參照J(rèn)ohnson等[26]的方法配制改良PNM(modified PNM)培養(yǎng)基.

1.2 方法

1.2.1pEF-OGFP載體構(gòu)建與核盤菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

本研究用特異引物(表1)擴(kuò)增密碼子優(yōu)化的GFP(OGFP)基因序列[27]， 并將擴(kuò)增產(chǎn)物OGFP片段融合于核盤菌EF-1a基因(SS1G_07595)啟動子下游， 獲得pEF-OGFP過表達(dá)載體(圖1a). 參考Rollins[28]的方法進(jìn)行原生質(zhì)體制備及PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化， 將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化至核盤菌“1980”基因組. 利用潮霉素篩選轉(zhuǎn)化子， 并在波長488 nm下觀察轉(zhuǎn)基因核盤菌的原生質(zhì)體和菌絲， 篩選“1980-GFP”菌株， 用于后續(xù)試驗.

1.2.2 核盤菌與印度梨形孢對峙培養(yǎng)

參照張斌等[29]的方法， 進(jìn)行平板對峙培養(yǎng). 具體步驟： 用無菌打孔器(直徑6 mm)取印度梨形孢菌落邊緣菌絲塊， 置于直徑90 mm的PDA平板上， 距平板邊緣的1/8直徑處. 待印度梨形孢菌落生長至平板2/3直徑時， 使用相同的方法取“1980-GFP”核盤菌的菌絲塊置于平板的另一側(cè)， 以未放置印度梨形孢的平板為對照. 放置核盤菌后， 每隔12 h拍照并測量菌絲塊中心至菌落邊緣的距離(cm)， 以評價菌絲的生長速度. 利用熒光體視顯微鏡觀察兩菌菌落的接觸部分， 并評價菌絲的形態(tài)特征. 分別于對峙培養(yǎng)后24 h， 48 h， 72 h及96 h取菌絲， 立即置于液氮中保存， 用于實時熒光定量PCR分析， 3次重復(fù). 對峙培養(yǎng)7 d 后收集菌核， 統(tǒng)計菌核數(shù)量及其干質(zhì)量(g).

印度梨形孢發(fā)酵培養(yǎng)液培養(yǎng)核盤菌試驗參考王慧俐[30]的方法進(jìn)行， 略有改動. 在無菌條件下， 用無菌打孔器(6 mm)取5塊印度梨形孢菌絲塊置于PDB培養(yǎng)液中， 于28 ℃， 200 r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng). 培養(yǎng)4 d 后， 過濾并收集發(fā)酵培養(yǎng)液用于核盤菌培養(yǎng)， 以PDB， 1/2 PDB培養(yǎng)液培養(yǎng)核盤菌為對照. 22 ℃， 200 r/min培養(yǎng)4 d后， 比較各處理中核盤菌菌絲球的干質(zhì)量(g)， 3次重復(fù).

1.2.3 總RNA提取及總cDNA第一鏈合成

用試劑盒Ultrapure RNA Kit(DNase I)(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)進(jìn)行總RNA提取與純化； 用試劑盒PrimeScript?RT reagent Kit(Perfect Real Time)(TaKaRa)進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄.

1.2.4 引物設(shè)計及實時熒光定量PCR

參照NCBI數(shù)據(jù)庫中相關(guān)基因的編碼序列， 用Primer Premier 5設(shè)計引物(表1). 反應(yīng)體系： 1 μL cDNA(100 ng/μL)， SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL， 正向及反向引物各0.5 μL， RNase-free H2O 8 μL. 用CFX96TM real-time PCR 儀(Bio-Rad)進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測. 反應(yīng)程序： 95 ℃預(yù)變性30 s， 95 ℃變性5 s， 60 ℃退火20 s， 72 ℃延伸20 s， 40個循環(huán). 每個樣本重復(fù)3次. 以核盤菌SsTubulin基因作為內(nèi)參， 按照2-ΔΔCT法計算基因的相對表達(dá)量[31].

表1 載體構(gòu)建及實時熒光定量PCR所用引物

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Excel 2016和SAS 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析， 應(yīng)用t測驗法進(jìn)行差異顯著性檢驗.

2 結(jié)果與分析

2.1 綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因核盤菌菌株“1980-GFP”的獲得

為更清晰地觀察對峙培養(yǎng)下核盤菌的生長情況， 本研究構(gòu)建了綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因核盤菌菌株. 利用PEG轉(zhuǎn)化法， 將密碼子優(yōu)化后的pEF-OGFP載體(圖1a)轉(zhuǎn)入核盤菌菌株“1980”的原生質(zhì)體中， 經(jīng)復(fù)壁培養(yǎng)和潮霉素抗性篩選， 共獲得26個轉(zhuǎn)化子. 用激光掃描共聚焦顯微鏡和熒光體視顯微鏡觀察原生質(zhì)體和菌絲(圖1b， 1c)， 篩選出綠色熒光信號最強(qiáng)的轉(zhuǎn)化子， 其菌落生長、 菌絲形態(tài)以及菌核形成均與野生型一致， 用于進(jìn)行后續(xù)研究.

箭頭所指為原生質(zhì)體； 原生質(zhì)體由激光掃描共聚焦顯微鏡(ZEISS LSM 900)拍攝， 菌絲由熒光體視顯微鏡(OLYMPUS MVX 10)拍攝.圖1 綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因核盤菌菌株“1980-GFP”

2.2 印度梨形孢(P.i)對核盤菌(S.s)的抑制作用

印度梨形孢與核盤菌菌落接觸后， 后者的生長受到顯著抑制(圖2a). 在36 h時， 其生長半徑顯著降低(p<0.05). 此后， 處理組的菌落延伸半徑降低了36.43%～53.56%， 生長速度降低了84.76%(圖2b)， 并產(chǎn)生了抑菌帶(圖2a紅色方框). 抑菌帶處核盤菌菌絲發(fā)育異常， 其前端出現(xiàn)短而多的分叉， 且呈彎曲生長， GFP信號也減弱(圖2c). 培養(yǎng)7 d后， 對峙培養(yǎng)中的核盤菌菌核數(shù)量比對照降低了73.38%(圖3a)， 干質(zhì)量降低了64.16%(圖3b). 印度梨形孢在PDA培養(yǎng)基上菌落生長致密， 其菌絲可能會占據(jù)核盤菌的生長空間， 進(jìn)而抑制核盤菌生長. 印度梨形孢在改良PNM培養(yǎng)基上形成的菌落稀疏， 并不會造成核盤菌生長空間受阻(圖4). 為此， 本研究又在改良PNM培養(yǎng)基上進(jìn)行印度梨形孢與核盤菌的對峙培養(yǎng)， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)核盤菌菌落生長仍然受到抑制(圖4)， 進(jìn)一步表明印度梨形孢對核盤菌的抑制作用不僅僅源于生長空間競爭.

a圖中對照組(S.s)僅在平板左側(cè)接種核盤菌“1980-GFP”； 處理組(S.s/P.i)平板左側(cè)接種核盤菌“1980-GFP”， 右側(cè)接種印度梨形孢. c圖中對照組(S.s)為正常生長的核盤菌“1980-GFP”菌絲形態(tài)及熒光信號； 處理組(S.s/P.i)為對峙培養(yǎng)48 h時抑菌帶部位核盤菌“1980-GFP”菌絲形態(tài)及熒光信號.圖2 PDA平板上印度梨形孢對核盤菌的抑制

核盤菌菌絲塊在液體培養(yǎng)基中會形成菌絲球. 利用不同的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)核盤菌時， 我們發(fā)現(xiàn)其菌絲球在PDB培養(yǎng)液中生長最旺盛， 在1/2 PDB培養(yǎng)液中次之， 但均比在印度梨形孢發(fā)酵培養(yǎng)液中的旺盛(圖5a). 將各處理的菌絲球烘干稱量， 發(fā)現(xiàn)在印度梨形孢發(fā)酵培養(yǎng)液中的核盤菌菌體干質(zhì)量較PDB和1/2PDB培養(yǎng)液中均顯著降低(p<0.05)， 降低量分別為52.01%和25.52%(圖5b).

2.3 印度梨形孢對核盤菌生長發(fā)育與逆境響應(yīng)關(guān)鍵基因表達(dá)水平的影響

為研究對峙培養(yǎng)下印度梨形孢對核盤菌抑制的機(jī)理， 我們用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了與核盤菌菌落生長、 菌核形成及逆境響應(yīng)相關(guān)基因Sssod1，Sssmk1，Ssshk1及SsITL的相對表達(dá)水平.

小寫字母不同表示p<0.05， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義.圖3 PDA平板上印度梨形孢對核盤菌菌核發(fā)育的抑制

圖4 改良PNM平板上印度梨形孢對核盤菌的抑制

Sssod1與核盤菌菌核萌發(fā)以及抗逆反應(yīng)密切相關(guān)[32]. 在對峙培養(yǎng)早期，Sssod1顯著上調(diào)(p<0.05)， 并于72 h達(dá)最高表達(dá)量， 上調(diào)量為對照的2.78倍， 隨后表達(dá)量迅速降低， 96 h時下調(diào)了94.53%(圖6a). 結(jié)果表明， 印度梨形孢會誘導(dǎo)核盤菌的早期防御反應(yīng)， 在后期則會影響核盤菌菌核發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)， 印證了對峙培養(yǎng)對核盤菌菌核數(shù)量和質(zhì)量的抑制作用.

Sssmk1是核盤菌中信號傳遞的關(guān)鍵基因， 同時與核盤菌菌落延伸、 菌核發(fā)育相關(guān)[33]. 在對峙培養(yǎng)前期，Ssmk1表達(dá)量顯著上調(diào)(p<0.05)， 48 h時上調(diào)3.89倍， 后期恢復(fù)正常表達(dá)水平(圖6b). 結(jié)果表明， 印度梨形孢影響了核盤菌的早期信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑， 激活了核盤菌逆境脅迫反應(yīng)， 并有可能加速了菌核的形成.

SsITL基因編碼核盤菌的一個毒性分泌蛋白， 對菌株的致病力、 菌絲生長、 菌核形成具有多效性[34]. 本試驗中SsITL的表達(dá)與Sssod1極為類似， 在對峙培養(yǎng)24～72 h內(nèi)相對表達(dá)量顯著上調(diào)(p<0.05). 上調(diào)量達(dá)2.94～4.71倍(圖6c). 印度梨形孢與核盤菌對峙培養(yǎng)過程中核盤菌菌落延伸受阻可能是該基因前期上調(diào)表達(dá)的原因之一， 而后期該基因表達(dá)受到抑制則可能影響了核盤菌菌核的形成.

Ssshk1是一種組氨酸激酶， 與核盤菌菌絲形態(tài)、 菌落延伸以及對外界環(huán)境的適應(yīng)力有關(guān)[35]. 在對峙培養(yǎng)初期，Ssshk1的表達(dá)水平與對照持平， 中后期顯著下調(diào)(p<0.05)， 下調(diào)量為20.81%～28.55%(圖6d). 結(jié)果表明， 對峙培養(yǎng)過程中， 印度梨形孢抑制了核盤菌Ssshk1基因的表達(dá)， 可能導(dǎo)致了核盤菌菌絲形態(tài)異常， 并在一定程度上影響了核盤菌對外界刺激的反應(yīng).

小寫字母不同表示p<0.05， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義.圖6 對峙培養(yǎng)時印度梨形孢對核盤菌生長發(fā)育及逆境響應(yīng)關(guān)鍵基因表達(dá)模式的影響

3 討論

對峙培養(yǎng)時， 核盤菌與印度梨形孢接觸部分產(chǎn)生了抑菌帶， 此后菌落延伸速度大幅下降， 并在兩菌接觸邊界形成氣生菌絲， 這與盾殼霉與核盤菌對峙培養(yǎng)時的現(xiàn)象類似[36]. 印度梨形孢與部分其他病原菌的對峙培養(yǎng)結(jié)果也與本研究類似. 印度梨形孢能夠抑制灰霉病菌的生長[23]； 當(dāng)在平板上優(yōu)先培養(yǎng)印度梨形孢時能夠抑制鏈格孢菌的生長[30]； Ghahfarokihi等[37]用印度梨形孢與小麥全蝕病菌(Gaeumannomycesgraminisvar. tritici)對峙培養(yǎng)時， 發(fā)現(xiàn)印度梨形孢與小麥全蝕病菌之間也會形成抑菌帶， 并且印度梨形孢會抑制小麥全蝕病菌菌絲的生長； 印度梨形孢與黃萎病菌對峙培養(yǎng)時， 發(fā)現(xiàn)其對黃萎病菌有直接的拮抗作用[21]. Moharam等[38]發(fā)現(xiàn)， 平板對峙培養(yǎng)時， 印度梨形孢并未對尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)產(chǎn)生明顯的拮抗作用， 但其發(fā)酵培養(yǎng)液卻能夠顯著抑制尖孢鐮刀菌的生長. 印度梨形孢在生長過程中會產(chǎn)生種類繁多的次生代謝物， 包括分泌蛋白、 激素以及異羥肟酸(Hydroxamicacids)等[39-40]. 由異羥肟酸合成的衍生物N-甲酰羥胺BB-3497(N-formyl hydroxylamine BB-3497)是重要的抗菌劑， 能夠抑制部分病原真菌的生長[41]； 環(huán)異羥肟酸(Cyclic hydroxamic acid)能夠增強(qiáng)植物對病原微生物的抗性[42]. 本研究收集了印度梨形孢的PDB培養(yǎng)液用以培養(yǎng)核盤菌， 發(fā)現(xiàn)在印度梨形孢培養(yǎng)液中的菌絲球大小和干質(zhì)量均顯著小于以PDB和1/2PDB培養(yǎng)液培養(yǎng)的核盤菌菌絲球， 表明印度梨形孢發(fā)酵培養(yǎng)液能抑制核盤菌的生長， 但其具體抑制因子還有待進(jìn)一步分析鑒定.

Sssod1是核盤菌超氧化物歧化酶(SOD)家族的重要成員[31]， 而Sssmk1通過核盤菌中信號傳導(dǎo)， 影響核盤菌菌落延伸、 菌絲形態(tài)和菌核形成[32]， 二者均與核盤菌的防御反應(yīng)與菌核形成密切相關(guān). 本研究中Sssod1，Sssmk1在對峙培養(yǎng)前期表達(dá)均顯著上調(diào)， 表明對峙培養(yǎng)過程中， 印度梨形孢激活了核盤菌的防御反應(yīng).SsITL編碼核盤菌的一個毒性分泌蛋白， 并與核盤菌菌核發(fā)育密切相關(guān)， 在核盤菌侵染前期或生長受阻后迅速上調(diào)[33]. 本研究對峙試驗表明， 印度梨形孢阻礙了核盤菌的菌落延伸，SsITL在前期表達(dá)上調(diào)可能是與印度梨形孢接觸后菌落延伸受阻所致. 然而，Sssod1與SsITL在對峙培養(yǎng)96 h時表達(dá)卻受到抑制， 印度梨形孢可能在對峙培養(yǎng)后期抑制了部分與核盤菌菌核發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)， 對峙培養(yǎng)中核盤菌菌核數(shù)量和質(zhì)量均較少也印證了該結(jié)果. 核盤菌菌核是由菌絲緊密交織而成的休眠體， 能夠幫助核盤菌抵御外界不良環(huán)境， 利于核盤菌繁殖與繼代[43]， 因此， 印度梨形孢可能對核盤菌的繁殖以及抵御逆境的能力有抑制效果.Ssshk1調(diào)控核盤菌的應(yīng)激反應(yīng)， 沉默表達(dá)Ssshk1的核盤菌菌絲形態(tài)異常， 菌落延伸緩慢， 并失去了對殺菌劑以及對外界脅迫的敏感性[34]. 本研究中， 兩菌接觸后， 核盤菌基因Ssshk1的表達(dá)有所降低， 可能與對峙培養(yǎng)過程中核盤菌菌落延伸緩慢、 菌絲形態(tài)異常密切相關(guān). 對峙培養(yǎng)過程中， 核盤菌基因Sssod1，Sssmk1，Ssshk1及SsITL的表達(dá)模式分析表明， 印度梨形孢與核盤菌之間有著較為復(fù)雜的互作機(jī)制， 有待進(jìn)一步研究.

定殖了印度梨形孢的小麥對莖腐病的抗性顯著提高， 但對布氏白粉病菌的抗性并未提高[20]； 然而Molitor等[44]發(fā)現(xiàn)大麥在定殖印度梨形孢后， 引起與大麥系統(tǒng)抗性相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)， 調(diào)控大麥的抗氧化能力進(jìn)而提高其對白粉病的抗性. 定殖印度梨形孢后， 番茄植株的黃萎病嚴(yán)重程度降低了30%以上[45]. 本研究在體外證實了印度梨形孢對核盤菌有抑制作用， 后續(xù)將驗證印度梨形孢定殖于油菜后是否能夠引起油菜菌核病抗性的改變， 并深入探討其相關(guān)機(jī)制.

4 結(jié)論

印度梨形孢對核盤菌有直接抑制作用， 能夠抑制核盤菌菌落延伸， 減少菌核數(shù)量與質(zhì)量， 并改變菌絲形態(tài)， 且能夠影響核盤菌防御反應(yīng)及生長發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá).