馮潔， 尹艷艷， 廖芳， 孔德英，馬浩予， 唐嘉浩， 李關(guān)榮

1. 西南大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院， 重慶 400716； 2. 天津海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心， 天津 300461；3. 重慶海關(guān)技術(shù)中心， 重慶 401333

中藥丹參Salviamiltiorrhiza為唇形科鼠尾草屬多年生草本植物， 其根莖可入藥； 在中國(guó)、 日本、 美國(guó)和歐洲， 丹參已廣泛用于治療血管疾病， 包括動(dòng)脈粥樣硬化、 高血壓、 高血脂和中風(fēng)等[1-2]. 近些年的研究表明， 丹參還具有其他多種藥理活性， 如抗氧化、 神經(jīng)保護(hù)、 抗纖維化、 抗炎、 抗腫瘤等， 其臨床應(yīng)用為患者護(hù)理和人體健康做出了重要貢獻(xiàn)[3]. 丹參原產(chǎn)于中國(guó)， 在韓國(guó)、 越南、 澳大利亞等國(guó)家也被廣泛種植[4]. 國(guó)內(nèi)丹參的主要產(chǎn)區(qū)有河南、 山東、 陜西、 山西、 湖北、 安徽、 四川等地[5].

遺傳多樣性作為生物多樣性的核心部分， 是長(zhǎng)期進(jìn)化的產(chǎn)物， 對(duì)丹參藥材的利用具有重要意義， 也是藥用植物適應(yīng)生存和進(jìn)化的前提. 植物各種高產(chǎn)、 抗病、 抗逆等優(yōu)良性狀基因以及控制有效成分代謝途徑的基因構(gòu)成了其基因水平上的多樣性， 這些遺傳多樣性為我們收集、 保存、 利用、 評(píng)價(jià)植物資源提供了依據(jù)； 因此遺傳多樣性是中藥丹參種質(zhì)鑒定、 資源利用、 引種栽培、 資源保護(hù)的基礎(chǔ)[6]. 目前， 采用的丹參種源鑒定方法主要有來(lái)源鑒定法、 性狀鑒定法、 理化鑒定法和生物鑒定法[7]. 有學(xué)者研究了12種丹參的性狀、 顯微特征、 理化鑒別特征， 并通過(guò)化學(xué)成分定性定量及藥理實(shí)驗(yàn)比較分析， 評(píng)估了丹參種質(zhì)的質(zhì)量[8].

DNA標(biāo)記是研究植物遺傳多樣性的有力工具[9]， 主要有葉綠體和核基因標(biāo)記. 學(xué)者們?cè)捎秒S機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA[10-11]、 AFLP(擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性)[12-13]、 ISSR(簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增標(biāo)記)[14]、 葉綠體基因SSR(簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記)[15]、 EST-SSR(基于表達(dá)序列標(biāo)簽開(kāi)發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記)[16]對(duì)丹參遺傳多樣性進(jìn)行了研究. 高等植物細(xì)胞核核糖體DNA(Nuclear Ribosomal DNA， nrDNA)是高度重復(fù)的串聯(lián)序列單元， 包括1個(gè)單元段， 1個(gè)操縱子， 以及由外轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(External Transcribed Spacer， ETS)、 非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Non-Transcribed Spacer， NTS)、 18SrDNA、 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1(Internal Transcribed Spacer， ITS1)、 5.8SrDNA、 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(ITS2) 和28SrDNA組成的串聯(lián)重復(fù)序列[17].

nrDNA的非編碼區(qū)為高變區(qū)， 受選擇壓小， 序列差異主要表現(xiàn)在該區(qū)上， 在近緣類(lèi)群間的系統(tǒng)學(xué)、 雜交及居群進(jìn)化研究上具有一定的應(yīng)用潛力[18]. ETS重復(fù)序列較少， 進(jìn)化較快， 并且具有很高的多態(tài)性和可變性， 在遺傳變異、 分類(lèi)及系統(tǒng)發(fā)育研究中具有重要的應(yīng)用價(jià)值. 采用ETS序列對(duì)粟的起源與傳播進(jìn)行研究表明， 該區(qū)能很好地檢測(cè)種內(nèi)及種間多態(tài)性[19]. 藥水蘇核外轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ETS)的分析表明， 所有斯堪的納維亞種群都有一個(gè)自發(fā)的起源， 這些種群由該物種基因定義明確的亞群組成， 與來(lái)自北歐大陸鄰近地區(qū)的其他自發(fā)種群關(guān)系最密切[20]. Thell等[21]根據(jù)地理位置、 分類(lèi)學(xué)和遺傳采樣， 基于包括ETS的6種DNA分子標(biāo)記研究， 重建了東亞鼠尾草的系統(tǒng)關(guān)系.

丹參作為我國(guó)傳統(tǒng)的大宗藥材之一， 在臨床上發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用. 目前， 還未見(jiàn)有栽培丹參居群ETS序列的遺傳多樣性報(bào)道. 為了解不同栽培丹參居群的ETS序列遺傳多樣性， 為栽培丹參資源快速鑒定奠定基礎(chǔ)， 本研究對(duì)40個(gè)栽培丹參居群的ETS序列進(jìn)行了PCR擴(kuò)增、 序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建， 探明了不同栽培丹參居群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為來(lái)自國(guó)內(nèi)不同地區(qū)的40種栽培丹參居群(表1). 本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)種子形狀、 大小、 田間栽培或盆缽培育植物的葉片、 花形、 花色、 收獲種子等農(nóng)藝性狀進(jìn)行了鑒定， 確認(rèn)均為丹參材料.

表1 本研究使用的丹參材料

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組總DNA提取

采用十六烷基三甲基溴化銨(Cetyltrimethyl Ammonium Bromide， CTAB)法提取丹參基因組總DNA[22]， 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳確定其純度， 提取的DNA樣品置于-20 ℃冰箱中保存.

1.2.2 PCR擴(kuò)增

采用上游引物F(5′-ATAGAGCGCGTGAGTGGTG-3′)和下游引物R(5′-GACAAGCATATGACTGGATCAA-3′)[23]對(duì)丹參不同栽培居群的ETS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增. PCR擴(kuò)增體系為25 μL： 2×SanTaq PCR Mix 11 μL， F和R (10 μmol/L) 各1 μL， DNA模板1 μL， ddH2O 11 μL. PCR 擴(kuò)增程序： 94 ℃預(yù)變性5 min， 94 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s， 35個(gè)循環(huán)， 72 ℃延伸10 min. PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).

1.2.3 PCR產(chǎn)物測(cè)序

以回收、 純化的PCR產(chǎn)物為測(cè)序反應(yīng)模板， 通用引物為測(cè)序引物， 由四川成都生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序.

1.2.4 序列數(shù)據(jù)處理

在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information， NCBI)網(wǎng)站上將測(cè)得序列進(jìn)行 BLAST 同源比對(duì)確認(rèn)后， 使用BioEdit 7.09[24]和Vector NTI Advance 11.5.3[25]軟件對(duì)40個(gè)栽培丹參居群的ETS序列和 GenBank 中已登錄的丹參ETS序列(MG824345.1)進(jìn)行比對(duì)， 使用分子進(jìn)化遺傳分析軟件 MEGA 7.0進(jìn)行分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建[26]， 使用DNASP v5進(jìn)行多態(tài)性位點(diǎn)、 遺傳多樣性指數(shù)和中性檢測(cè)分析[27].

2 結(jié)果與分析

2.1 不同栽培丹參居群ETS序列的PCR擴(kuò)增

以丹參基因組總DNA為模板， 對(duì)其ETS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè). 結(jié)果顯示， ETS擴(kuò)增產(chǎn)物均為500 bp左右的單帶， 條帶清晰， 特異性好(圖1).

M： DL5000； 材料編號(hào)見(jiàn)表1.圖1 不同栽培丹參居群ETS 擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

2.2 丹參ETS序列特征

獲得的40份丹參材料的ETS序列經(jīng)比對(duì)整理后， 提交GenBank 獲得了相應(yīng)的收錄號(hào)(表2). 40個(gè)栽培丹參居群的ETS序列長(zhǎng)為421～433 bp， GC含量為56.8%～62.8%， 向GC方向偏斜. 其中， 居群B-GD-V-1和W-SD-V-1的長(zhǎng)度為421 bp， 居群B-SD-V-1和W-SCHY-W-2的長(zhǎng)度為423 bp， 居群W-GZ-V-1和W-GD-V-1的長(zhǎng)度為431 bp， 居群B-JS-V-1和W-JS-V-1的長(zhǎng)度為433 bp， 其余32個(gè)栽培丹參居群ETS序列長(zhǎng)度為422 bp； GC含量最高的是居群V-GSLX-V-2， 含量最低的是居群B-JS-V-1和W-JS-V-1， 其余栽培丹參居群GC含量在56.8%～62.8%范圍內(nèi)有細(xì)微差異(表2).

表2 丹參ETS序列的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)

2.3 不同栽培丹參居群ETS序列的核苷酸變異分析

通過(guò)對(duì)40個(gè)栽培丹參居群ETS序列進(jìn)行排序， 經(jīng)Vector NTI Advance 11.5.3軟件比對(duì)及人工整理， 結(jié)果顯示： 40個(gè)栽培丹參居群ETS序列的相似度為95.5%， 一致性為41.0%(圖2). 存在241個(gè)SNP變異位點(diǎn)， 變異率高達(dá)54.8%； 有205個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)， 變異位點(diǎn)豐富.

橫軸為序列長(zhǎng)度， 縱軸為計(jì)算的分?jǐn)?shù).圖2 不同栽培丹參居群ETS相似(A)、 一致(B)及共有位點(diǎn)(C)分?jǐn)?shù)

丹參ETS序列中16個(gè)居群有核苷酸變異位點(diǎn)， 其余24個(gè)居群沒(méi)有核苷酸變異. 變異位點(diǎn)豐富(100個(gè)以上)的居群有W-GZ-V-1，V-SD-V-1W，W-GD-V-1，B-JS-V-1，W-JS-V-1和B-SD-V-1； 變異位點(diǎn)數(shù)中等(10～100個(gè))的居群有W-SD-V-1，B-GD-V-1，V-JXJA-V-2和W-SCHY-W-2； 變異位點(diǎn)較少(低于10個(gè))的居群有V-SC-V-1，V-GD-V-1，V-JS-V-1，W-YNLJ-V-2，V-GSLX-V-2和W-HBJM-V-2(表3).

表3 栽培丹參居群ETS序列核苷酸變異位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)MEGA軟件找到ETS序列的24個(gè)核苷酸替代模型， 分別為HKY+I，HKY+G，T92+I，HKY，HKY+G+I，TN93+I，T92+G，TN93，T92，TN93+G，T92+G+I，TN93+G+I，JC+G，JC+I，K2+G，K2+I，JC，JC+G+I，K2，K2+G+I，GTR+I，GTR+G，GTR和GTR+G+I. 根據(jù)貝葉斯準(zhǔn)則(Bayesian Information Criterion， BIC)， 其中HKY+I模型的BIC分?jǐn)?shù)最低， 為ETS序列的最佳替代模型. 栽培丹參居群ETS序列轉(zhuǎn)換率和顛換率分別為40.1%和59.9%， 其轉(zhuǎn)換率低于顛換率(圖3).

圖3 栽培丹參居群ETS序列核苷酸置換頻率

2.4 遺傳多樣性分析

通過(guò)DNASP軟件， 對(duì)40個(gè)栽培丹參居群的遺傳多樣性進(jìn)行分析獲得16種單倍型， 單倍型多樣性指數(shù)(Haplotype Diversity，Hd)為0.640， 核苷酸多樣性指數(shù)(Nucleotide Diversity Index，π)為0.112， 單倍型多樣性方差(Variance of Haplotype Diversity，Vh)為0.008， 單倍型多樣性標(biāo)準(zhǔn)差(Standard Deviation of Haplotype Diversity，Sh)為0.089. 中性檢驗(yàn)表明ETS序列在p>10%水平上均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， 符合中性進(jìn)化模型.

2.5 遺傳距離分析

利用最大似然法對(duì)ETS序列的遺傳距離進(jìn)行估算. 結(jié)果表明： 在標(biāo)準(zhǔn)誤估計(jì)值為0.052的情況下， 40個(gè)栽培丹參居群的總平均遺傳距離為0.151. 24個(gè)沒(méi)有核苷酸變異位點(diǎn)的居群用C24表示. 16個(gè)具有SNP指紋的栽培丹參居群及其之間的遺傳距離表明： 居群W-SD-V-1與居群B-JS-V-1和W-JS-V-1的遺傳距離最大， 達(dá)到0.648， 說(shuō)明居群W-SD-V-1與居群B-JS-V-1和W-JS-V-1的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)， 居群間遺傳多樣性高； 而居群W-JS-V-1與B-JS-V-1的遺傳距離最小， 數(shù)值為0， 說(shuō)明兩個(gè)居群間的親緣關(guān)系較近， 居群間遺傳多樣性低(表4).

表4 栽培丹參居群間ETS序列的遺傳距離

2.6 基于丹參ETS序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

根據(jù)獲得的栽培丹參居群ETS序列， 以GenBank下載的湖北鼠尾草ETS序列(MG824345.1)為外群， 用鄰接法(NJ)、 最大似然法(ML)和最大簡(jiǎn)約法(MP)3種方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)， 考察其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系. 結(jié)果表明： 3種進(jìn)化樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)大致相同. 最大似然法和鄰近連接法構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)顯示， 40個(gè)栽培丹參居群聚類(lèi)在2個(gè)系支上， 相同的24個(gè)居群聚類(lèi)在一個(gè)系支上， 另外相同的、 具有變異位點(diǎn)的16個(gè)居群(表3)聚類(lèi)在另一系支上(圖4A， B)； 而最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)顯示， 40個(gè)栽培丹參居群聚在2個(gè)系支上， 27個(gè)居群聚類(lèi)在一個(gè)系支上， 另外13個(gè)居群聚類(lèi)在另一系支上(圖4C). 可見(jiàn)， 最大似然法和鄰近連接法更適合丹參ETS聚類(lèi)分析.

A： NJ聚類(lèi)圖； B： ML聚類(lèi)圖； C： MP聚類(lèi)圖.圖4 基于丹參ETS序列的系統(tǒng)樹(shù)

3 結(jié)論與討論

ETS序列進(jìn)化較快且具有較高的多態(tài)性和可變性， 在遺傳變異、 分類(lèi)及系統(tǒng)發(fā)育研究中有著重要的用途. 由于ETS序列難以找到合適的通用引物擴(kuò)增整個(gè)區(qū)域， 所以在系統(tǒng)學(xué)研究中的例子比較少[28]. 本研究采用應(yīng)用于辣椒的ETS引物[23]首次成功擴(kuò)增了丹參的ETS序列， 其長(zhǎng)度為421～433 bp， GC含量為56.8%～62.8%； 發(fā)現(xiàn)40個(gè)栽培丹參居群的ETS序列共有241個(gè)SNP變異位點(diǎn)， 變異率高達(dá)54.8%， 有205個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)， 與同屬唇形科植物的ETS研究結(jié)果相似[29-30]； 還發(fā)現(xiàn)基于ETS序列的SNP指紋可鑒定14個(gè)栽培丹參居群， 但不足以區(qū)別所有栽培丹參居群， 因此筆者認(rèn)為準(zhǔn)確可靠的分子鑒定可能依賴(lài)于從多種DNA分子標(biāo)記上尋找可靠的復(fù)合分子標(biāo)記.

本研究通過(guò)MEGA軟件找到ETS序列的最佳核苷酸替代模型為HKY+I， 發(fā)現(xiàn)核苷酸轉(zhuǎn)換率(40.1%)低于顛換率(59.9%)， 而相對(duì)較高的核苷酸置換率說(shuō)明丹參種間和種內(nèi)具有較高的遺傳變異性[31]； 丹參ETS序列的單倍體多樣性指數(shù)Hd為0.64(>0.5)， 表明栽培丹參的遺傳資源豐富， 這與基于EST-SSR標(biāo)記的丹參遺傳多樣性研究結(jié)果一致[16]. 中性檢驗(yàn)結(jié)果表明ETS序列在p>10%的水平不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， 符合中性進(jìn)化模型， 表明栽培丹參居群近期并沒(méi)有發(fā)生擴(kuò)張現(xiàn)象.

基于ETS序列的最大似然法、 鄰近連接法和最大簡(jiǎn)約法聚類(lèi)結(jié)果表明， 40個(gè)栽培丹參居群聚類(lèi)在兩個(gè)系支上， 3種進(jìn)化樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)大致相同， 最大似然法和鄰近連接法聚類(lèi)結(jié)果一致， 更適合丹參ETS聚類(lèi)分析. 研究結(jié)果為進(jìn)一步的栽培丹參分子系統(tǒng)學(xué)研究奠定了基礎(chǔ).