羊國根 程家森

（1. 安徽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，合肥 230036；2. 華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室 華中農(nóng)業(yè)大學湖北省作物病害監(jiān)測和安全控制重點實驗室，武漢 430070）

核盤菌（S. sclerotiorum（Lib.）de Bary）是一類世界性分布的重要植物病原真菌。在分類地位上，歸屬于真菌界（Fungi）、子囊菌門（Ascomycota）、錘舌菌綱（Leotiomycetes）、錘舌菌亞綱（Leotiomycetidae）、柔膜菌目（Helotiales）、核盤菌科（Sclerotiniaceae）、核盤菌屬（Sclerotinia）［1］。核盤菌可侵染75個科450多種植物，主要侵染雙子葉植物，如油菜、大豆、向日葵和番茄等；也可以侵染單子葉植物，如洋蔥和郁金香等［2］。核盤菌引起的植物病害稱為菌核病，也稱作白腐病、莖腐病和軟腐病等。核盤菌在侵染后期可形成菌核進行越夏越冬，菌核可以在土壤中存活很多年［3］。菌核病的病害循環(huán)復雜，菌核在適宜的溫度和濕度條件下，可萌發(fā)形成子囊盤，釋放子囊孢子侵染寄主，也可直接萌發(fā)成菌絲侵染植物［4］。核盤菌是典型的死體營養(yǎng)型植物病原真菌，致病機理復雜。已有報道仍主要集中研究核盤菌分泌的植物細胞壁降解酶類（Plant cell wall degrading enzymes，PCWDEs）和草酸（Oxalic acid，OA）等致病因子在侵染過程中的作用及其機制，而最近研究表明分泌蛋白也參與了核盤菌的致病過程并發(fā)揮重要功能。本文綜述了有關核盤菌致病機理的最新研究進展，可為核盤菌的分子致病機制研究和抗菌核病分子育種提供重要參考。

1 水解酶類（Hydrolase）

主要包括角質(zhì)酶（Cutinase）、細胞壁降解酶類和蛋白酶（Protease）類等。例如，核盤菌的角質(zhì)酶編碼基因SsCut在侵染葉片1 h后，表達量顯著上調(diào)［5］；重組蛋白SsCut可引起植物細胞壞死，誘導寄主植物產(chǎn)生抗性，并增強植物對核盤菌等病原菌的抗性［6］。核盤菌在侵染寄主植物時可分泌不同的植物細胞壁降解酶，包括纖維素酶（Cellulases）、半纖維素酶（Hemicellulose）、果膠酶（Pectinases）和木聚糖酶（Xylanases）等。核盤菌總共有183個植物細胞壁降解相關酶（包括木質(zhì)素酶），其中果膠降解酶類有33個，果膠酶類占比在所有死體營養(yǎng)型真菌中是較高的［7］，其研究報道也較多，尤以多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonases，PGs）為主，分別有5個內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶（endo-PGs）和5個外切多聚半乳糖醛酸酶（exo-PGs）［7-9］。endo-PGs在侵染植物時表達存在差異，次生代謝產(chǎn)物的積累和酸性pH環(huán)境可激活或者抑制不同endo-PGs的表達［9-10］。SsPG1參與了核盤菌早期侵染和病斑擴展，碳水化合物缺乏可以誘導Sspg1顯著表達，但半乳糖醛酸可以抑制該基因的表達［5］。SsPG3和SsPG6可以在擬南芥上引起依賴于光周期的細胞壞死，而體外真核表達的BnPGIP1重組蛋白可以抑制核盤菌SsPG6酶的活性［11］。其它植物細胞壁降解酶類的研究相對較少，Yu等［12］報道了一個編碼 endo-β-1，4-xylanase的基因SsXyl1，該基因與核盤菌菌絲生長、菌核形成及致病過程均密切相關。此外，植物細胞壁還含有豐富的蛋白質(zhì)，核盤菌可以分泌大量的蛋白酶，如天冬氨酸蛋白酶家族等，如SsAp1在核盤菌侵染油菜和菜豆的早期表達量顯著上升，推測其可能參與了核盤菌早期侵染過程［9，13］。

2 草酸

Godoy等［14］在1990年報道核盤菌產(chǎn)生的草酸是其致病的決定因子，他們發(fā)現(xiàn)紫外誘變獲得的突變體A2不能產(chǎn)草酸，同時喪失了致病力；而在加入琥珀酸鈉后，突變體A2恢復了產(chǎn)草酸能力并可在大豆葉片上形成病斑。隨后更多研究表明草酸在核盤菌致病過程中的作用主要體現(xiàn)在以下幾個方面：（1）草酸可以螯合植物細胞中游離的Ca2+，形成草酸鈣結(jié)晶。植物細胞壁被降解后會產(chǎn)生游離的Ca2+，草酸可螯合這些Ca2+，保護侵染點區(qū)域的菌絲免受高濃度Ca2+的傷害［15］。核盤菌侵染油菜6 h和72 h時，侵染點的莖稈分別有46%和100%可見草酸鈣結(jié)晶［16］；（2）草酸使寄主植物保衛(wèi)細胞功能失調(diào)，阻止氣孔正常關閉。寄主植物被核盤菌侵染后，氣孔在夜間仍處于打開狀態(tài)，導致水分蒸發(fā)較快，從而引起植物葉片的萎蔫；草酸也可抑制脫落酸引起的氣孔關閉［17］；（3）草酸可抑制寄主植物的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）爆發(fā)。侵染早期，核盤菌分泌草酸抑制活性氧爆發(fā)和胼胝質(zhì)的積累，促進核盤菌菌絲的定殖；侵染后期，草酸又可刺激寄主植物產(chǎn)生大量的ROS，誘發(fā)植物組織的程序性細胞死亡（Programmed cell death，PCD），促進核盤菌侵染和擴展［18］；（4）草酸可抑制寄主植物的細胞自噬（Autophagy）［19］；（5）草酸可以降低周圍環(huán)境的pH值，從而有利于核盤菌的侵染。有研究表明是草酸導致的低pH環(huán)境，而不是草酸根本身，在核盤菌致病中發(fā)揮重要作用。核盤菌體內(nèi)存在著一個pH感應轉(zhuǎn)錄因子pacC/RIM1同源蛋白pac1，伴隨著環(huán)境pH值升高而積累量升高，激活pac1介導的下游信號轉(zhuǎn)導，有利于草酸的生物合成［20］。草酸缺失的核盤菌突變體可直接侵染葉片表面pH值低的豆科植物，而利用緩沖液降低葉片表面的pH值后，草酸缺失的核盤菌突變體也可成功侵染這些豆科植物［21］，進一步證實了草酸營造的低pH環(huán)境在核盤菌致病過程中發(fā)揮重要作用。

3 分泌蛋白

效應子（Effector）在活體營養(yǎng)型病原菌和半活體營養(yǎng)型病原菌與寄主植物互作中發(fā)揮著重要作用［22-23］；死體營養(yǎng)型病原真菌也可分泌效應子促進其侵染［24-26］。有研究者認為，核盤菌可能也存在短暫的活體營養(yǎng)階段，菌絲在侵染初期在植物細胞的質(zhì)外體空間生長而不穿透植物的細胞壁，通過分泌草酸和效應蛋白來抑制植物的免疫反應，促進核盤菌的侵染［27］。早期研究發(fā)現(xiàn)，核盤菌中存在一個類似整聯(lián)蛋白（Ss-Integrin-like，SSITL）的分泌蛋白，該蛋白有典型的整聯(lián)蛋白的FG-GAP重復結(jié)構域。SSITL基因在侵染早期表達急劇上升，該基因沉默后引起核盤菌致病力下降，而超表達SSITL的寄主植株也更加感病，進一步研究表明SSITL蛋白參與了核盤菌抑制JA/ET信號途徑介導的局部和系統(tǒng)性抗病反應，因此SSITL在核盤菌致病過程中發(fā)揮類似效應子的功能［28］。而核盤菌的分泌蛋白質(zhì)組分析結(jié)果表明，有486個植物誘導表達的小分泌蛋白參與了核盤菌與寄主植物的互作，其中78個被認為是候選的效應蛋白［29］。Derbyshire等［8］利用單分子實時測序和RNA-seq手段也鑒定到了70個候選效應蛋白，但與Guyon等［29］預測的有所不同。上述結(jié)果提示核盤菌中也存在大量的候選效應子并可能在其致病過程中發(fā)揮重要作用。

隨著研究的深入，更多分泌蛋白在核盤菌中的作用及其作用機制被闡述，為進一步理解核盤菌的致病機制提供了新的思路和視角。Lyu等［30］在核盤菌上分離鑒定了一個富含半胱氨酸的小分泌蛋白SsSSVP1，該蛋白不含任何已知保守結(jié)構域，編碼有163個氨基酸，其中有8個半胱氨酸殘基，半胱氨酸含量超過4%。SsSSVP1僅在核盤菌屬和灰葡萄孢屬中存在同源蛋白。SsSSVP1在核盤菌侵染早期（3 hpi）表達即明顯升高，該基因沉默后引起核盤菌的致病力下降。SsSSVP1瞬時表達可以引起煙草葉片的壞死，熒光定位及突變試驗證明從菌絲分泌后，SsSSVP1可以自主轉(zhuǎn)運至寄主植物的細胞質(zhì)中，進而劫持寄主植物的線粒體蛋白QCR8，干擾QCR8正常的亞細胞定位和功能，促進核盤菌的侵染，因此SsSSVP1在核盤菌侵染過程中發(fā)揮類似效應子的功能。核盤菌SsCP1是cerato-platanin（CP）蛋白家族的典型成員，被證實是一個可以被植物識別的PAMP，可引起依賴于水楊酸途徑的植物免疫反應，增加寄主植物對病原菌的抗性。但另一方面，SsCP1可在寄主植物的質(zhì)外體與PR1互作。菌絲分泌的SsCP1與PR1互作降低PR1對核盤菌菌絲的抑制作用，從而有利于核盤菌的侵染。與此同時，隨著侵染過程的發(fā)展和SsCP1的累積，高濃度的SsCP1可引起寄主植物細胞壞死，從而有利于死體營養(yǎng)型的核盤菌獲取營養(yǎng)物質(zhì)［31］。有趣的是，SsSSVP1和SSCP1兩個效應分子的互作蛋白QCR8和PR1均為植物中非常保守并且功能重要的蛋白，這與核盤菌的寄主范圍廣泛這一特性是相吻合的。

誘導寄主植物細胞死亡的效應子有利于死體營養(yǎng)型病原菌的侵染［32］。前述分泌蛋白SsSSVP1和SSCP1均可促進寄主植物細胞的死亡，與核盤菌死體營養(yǎng)型的特性是符合的。此外報道顯示核盤菌中其它一些分泌蛋白也可導致寄主植物細胞死亡，如核盤菌中有2個編碼壞死和乙烯誘導多肽（NEPs）的基因SsNep1和SsNep2，在本氏煙中瞬時表達均可誘導植物細胞壞死，同時SsNep2在壞死區(qū)域和侵染頂端的菌絲都能表達，并依賴于Ca2+和環(huán)磷酸腺苷的信號轉(zhuǎn)導［33］?；移咸焰叽罅糠置诘囊粋€類似IgE結(jié)合蛋白BcIEB1，BcIEB1可以引起植物的細胞死亡和抑制幼苗生長［34］；BcIEB1可以誘導植物產(chǎn)生PTI，同時可以與PR5（Osmotin）結(jié)合抑制PR5的抗真菌活性［35］。我們發(fā)現(xiàn)核盤菌的基因組中也存在著2個編碼IEB1的保守蛋白，并且其氨基酸序列基本一致，可能存在類似的功能［8］。子囊菌中特有的分泌蛋白SsCDI1，可以誘導本氏煙等茄科植物的細胞壞死，但不能在擬南芥、大豆等雙子葉植物以及單子葉植物上引起細胞壞死［36］。

此外，有些分泌蛋白參與了核盤菌侵染墊的形成。例如，分泌蛋白Ss-Caf1含有EF-hand結(jié)構，在核盤菌侵染過程中發(fā)揮重要作用，Ss-Caf1的T-DNA插入突變體其草酸產(chǎn)量是野生型菌株的4倍，但突變體不能在健康葉片上致病，可以在有傷口的葉片上致病。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，突變體不能形成正常的侵染墊，表明侵染墊在核盤菌致病中有著重要作用［37］。具有Rhs重復結(jié)構的分泌蛋白Ss-Rhs1參與了復合侵染墊的形成，基因沉默突變體在擬南芥和油菜葉片上形成較小的病斑［38］。有研究表明核盤菌在SA類似物苯并噻二唑（BTH）預處理后的油菜上形成的病斑減少約40%，表達降解水楊酸的NahG擬南芥對核盤菌更加敏感，表明SA在植物抵抗核盤菌侵染中具有積極作用［39-40］。Kabbage等［27］也報道了在核盤菌中存在一個類似效應子的分泌型分支變位酶SsCm1，與玉米黑粉病菌的Cmu1高度同源，將分支酸轉(zhuǎn)化為預苯酸阻斷水楊酸的合成，從而抑制植物的免疫反應促進核盤菌的侵染［19，40-41］。還有一些分泌蛋白被證實與核盤菌的致病密切相關，但具體功能及作用機制需要進一步探討，如核盤菌的一個小分泌蛋白SsCVNH（Cyanovirin-N homology）在核盤菌致病和菌核發(fā)育同樣發(fā)揮著重要作用［42］；核盤菌發(fā)酵液中的蛋白激發(fā)子SCFE1，可以誘導植物產(chǎn)生依賴于受體蛋白RLP30的PTI，RLP30突變體對核盤菌更加感病，證實SCFE1有利于核盤菌的侵染［43］；編碼假定蛋白的ssv263缺失后，突變體的致病力顯著下降［44］。

4 其它致病相關蛋白

除分泌蛋白外，其它致病相關蛋白在核盤菌致病過程中也發(fā)揮重要作用，如核盤菌NADPH氧化酶（SsNOX1和SsNOX2）與ROS產(chǎn)生相關，Ssnox1沉默突變體中ROS水平降低，草酸產(chǎn)量下降，表明清除ROS或提高氧化激發(fā)的耐受力，在核盤菌侵染過程中也發(fā)揮作用［45］。編碼γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的Ss-Ggt1基因影響核盤菌侵染墊的形成，在沒有傷口的葉片上形成病斑的時間推遲，而在有傷口的葉片上沒有區(qū)別，Ss-Ggt1與核盤菌的早期侵染相關［46］。SsSOD1編碼一個Cu/Zn超氧化物歧化酶，基因破壞后不會影響核盤菌的菌絲生長，而突變體致病力受到影響，進一步研究表明SsSOD1是耐受ROS和氧化應激所必須的［47-48］。Ss-Bi1編碼一個凋亡相關的Bax抑制子，與核盤菌響應各種環(huán)境壓力相關，基因沉默后引起致病力下降，表明細胞凋亡的精細調(diào)控與致病力相關［49］。轉(zhuǎn)錄因子SsFKH1與核盤菌的致病力也密切相關，其基因沉默突變體在番茄葉片上的致病力顯著下降［50］。

5 展望

核盤菌寄主范圍廣泛，其引起的菌核病導致作物產(chǎn)量下降和品質(zhì)降低。由于缺乏有效的抗病品種，目前菌核病的防治主要依賴殺菌劑，但田間已出現(xiàn)了抗藥性菌株，導致化學防治效果不佳。因此，深入解析核盤菌的致病機理，開發(fā)和利用植物自身的抗病相關基因，將有助于發(fā)展菌核病綠色防控新策略。例如，草酸是核盤菌的重要致病因子，降解草酸是提高作物抗性的途徑之一。在大豆、油菜和煙草中表達來自外源的草酸氧化酶，可以大大提高作物對核盤菌的抗性［51-53］；表達草酸脫羧酶的大豆和番茄可降解草酸，也增強了對核盤菌的抗性［54-55］。過量表達病程相關蛋白也可提高寄主植物對核盤菌的抗性，如PR1具有結(jié)合甾醇和抑制病原菌生長的作用，過量表達PR1可提高寄主植物的抗性［31，56］。PR3（幾丁質(zhì)酶）和PGIP共同表達的油菜也增強了對核盤菌的抗性［57］。此外，利用植物自身的PTI也可提高植物對核盤菌的抗性納入受體蛋白RLP23特異性識別nlp20（NLPs的保守的20 aa），介導依賴于SOBIR1-BAK1的免疫反應，異源表達RLP23的番茄對核盤菌的抗性水平顯著提高［58］。

深入解析核盤菌的分子致病機理，有助于在植物中發(fā)現(xiàn)更多的抗病相關蛋白。利用基因組編輯技術進行基因定向改造，或精細調(diào)控抗病相關基因的表達，有望獲得具有一定抗性的品種應用于菌核病的安全防控。

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