陳浩宇 徐瑞濤 程志翔 高強(qiáng) 張健

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

黑曲霉是一種重要的工業(yè)發(fā)酵微生物，可為人類創(chuàng)造價(jià)值［1］；黑曲霉也是一種腐生真菌，可侵染農(nóng)產(chǎn)品和食品，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。某些黑曲霉菌株還能夠產(chǎn)生真菌毒素，直接威脅人類健康［2-3］。為了有效地控制黑曲霉的生長(zhǎng)與產(chǎn)毒，有必要深入研究環(huán)境脅迫條件下黑曲霉的生長(zhǎng)代謝情況。

在氧化脅迫條件下，黑曲霉會(huì)產(chǎn)生過多的活性氧自由基（Reaetive oxygen speeies，ROS），如超氧陰離子（·）、羥基自由基（·HO）和過氧化氫（H2O2），這會(huì)對(duì)菌體細(xì)胞的許多重要生物大分子發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的氧化損傷，使核酸、蛋白質(zhì)、膜多不飽和脂肪酸等出現(xiàn)交聯(lián)或斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，甚至引起細(xì)胞死亡［4-7］。為了能在氧化脅迫下不受傷害，黑曲霉會(huì)通過表達(dá)抗氧化酶和產(chǎn)生小分子抗氧化物有效地清除活性氧自由基?？寡趸钢饕ǔ趸锲缁福⊿OD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）；而小分子抗氧化物很多都是真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物［8-10］。

真菌毒素是常見的次級(jí)代謝產(chǎn)物［11］，關(guān)于“真菌為何要合成真菌毒素”有多種解釋。真菌在氧化脅迫條件下通過產(chǎn)生真菌毒素來(lái)清除活性氧自由基，保持細(xì)胞內(nèi)氧化平衡就是其中的一種，因?yàn)楹芏嗾婢舅氐暮铣啥加写罅垦踉拥膮⑴c［12］。Cresposempere等［13］研究表明，氧化脅迫可抑制炭黑曲霉的生長(zhǎng)并且刺激真菌毒素的產(chǎn)生，如在培養(yǎng)基中加入甲萘醌可以導(dǎo)致炭黑曲霉生長(zhǎng)變緩，且產(chǎn)生更多的赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）；Fountain等［14］發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中加入H2O2可以導(dǎo)致黃曲霉生長(zhǎng)變緩，且產(chǎn)生更多的黃曲霉毒素。這些研究均表明氧化脅迫確實(shí)能夠促進(jìn)真菌毒素的合成。

黑曲霉在工業(yè)生產(chǎn)上有重要價(jià)值，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中也可能造成巨大危害［15］。然而，關(guān)于氧脅迫對(duì)黑曲霉生長(zhǎng)和OTA生物合成的影響卻鮮有報(bào)道。為了探究黑曲霉合成OTA的目的，也為了控制黑曲霉的侵染和產(chǎn)毒。本研究以H2O2作為外源活性氧來(lái)源，探究黑曲霉的氧化應(yīng)激響應(yīng)，主要包括菌體的生長(zhǎng)、OTA的合成，胞內(nèi)活性氧和脂質(zhì)過氧化，以及抗氧化酶活性的變化，旨在為黑曲霉侵染和產(chǎn)毒的控制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基 黑曲霉1062（具有產(chǎn)OTA的能力）為實(shí)驗(yàn)室保存菌株。培養(yǎng)黑曲霉所用的PDA培養(yǎng)基，察氏酵母膏瓊脂培養(yǎng)基（CYA）的配制參考文獻(xiàn)［16］。

1.1.2 主要試劑與儀器 OTA標(biāo)品購(gòu)于Fermentas公司，色譜甲醇，色譜乙腈購(gòu)于Fisher公司，冰乙酸（分析純）購(gòu)于天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠，H2O2（30%），硫代巴比妥酸（TBA），考馬斯亮藍(lán)G-250，氮藍(lán)四唑（NBT），核黃素等購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；GPX酶試劑盒購(gòu)于南京建成生物試劑有限公司；高效液相色譜儀Agilent1100，購(gòu)自美國(guó)安捷倫科技有限公司；恒溫式電熱水浴鍋H1650-W購(gòu)于天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司；高速離心機(jī)5418購(gòu)于美國(guó)Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 H2O2對(duì)黑曲霉1062生長(zhǎng)影響 將PDA斜面上生長(zhǎng)5 d的黑曲霉1062孢子利用無(wú)菌水洗下，并通過血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，得到105個(gè)/mL的孢懸液，取5 μL分別加到含有0 mmol/L，5 mmol/L，10 mmol/L H2O2的CYA固體培養(yǎng)基上（H2O2過膜后在培養(yǎng)基未凝之前添加）。25℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落生長(zhǎng)情況并測(cè)定菌落直徑。

1.2.2 HPLC-FLD檢測(cè)黑曲霉1062 OTA產(chǎn)量 25℃培養(yǎng)箱中取出0 mmol/L，5 mmol/L，10 mmol/L H2O2的CYA平板上生長(zhǎng)3-7 d黑曲霉菌株，使用直徑為6 mm的打孔器從菌落邊緣到中心依次取出3塊含有菌體的瓊脂塊，加入500 μL甲醇，避光靜置2 h，使用孔徑為2 μm有機(jī)濾膜過濾，HPLC-FLD進(jìn)行檢測(cè)OTA。HPLC-FLD檢測(cè)OTA條件見文獻(xiàn)［17］。

1.2.3 粗提液的制備及蛋白含量的測(cè)定 將平板上生長(zhǎng)3-7 d的菌體刮下，稱取0.5 g，液氮研磨至粉末狀，使用5 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH7.0）提取；4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清液，用于測(cè)定·產(chǎn)生速率，H2O2及MDA含量和SOD，CAT，GPX酶活性。蛋白質(zhì)含量參照Bradford法測(cè)定，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 黑曲霉胞內(nèi)活性氧指標(biāo)測(cè)定 （1）H2O2含量測(cè)定：取粗提液1 mL，加1 mL預(yù)冷的丙酮，0.1 mL 5%硫酸化鈦和0.2 mL的濃氨水溶液，混勻后靜置5 min，4℃ 12 000 r/ min離心5 min，棄上清留沉淀。加入2 mL 2 mol/L硫酸溶解沉淀，沉淀完全溶解后在412 nm下測(cè)定吸光度。同時(shí)利用H2O2制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中HO的含量。（2）·22產(chǎn)生速率的測(cè)定：取1.0 mL粗提液加1.0 mL鹽酸羥胺，混勻后30℃水浴30 min，再加入1.0 mL對(duì)氨基苯磺酸和1.0 mL α-萘胺，30℃水浴15 min，12 000 r/min離心10 min，在530 nm下測(cè)定吸光度。以NaNO2制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過測(cè)定反應(yīng)液中生成濃度從而得出·的產(chǎn)生速率，具體參照王愛國(guó)等［18］的方法。

1.2.5 丙二醛（MDA）含量的測(cè)定 取1 mL待測(cè)液，加入3 mL 0.5% TBA，沸水浴20 min，迅速冷卻，12 000 r/min，離心10 min，分別測(cè)定上清液A450、A532和A600；按照如下公式進(jìn)行計(jì)算MDA含量：c（μmol/L）= 6.45 ×（A532-A600）-0.56×A450。 其 中A450，A532，A600分別為在 450，532，600 nm 下吸光值。1.2.6 黑曲霉胞內(nèi)抗氧化酶活性測(cè)定 （1）SOD 活性的測(cè)定：采用氮藍(lán)四唑比色法。酶活性單位采用抑制光化還原NBT 50%為一個(gè)酶活性單位。（2）CAT 活性測(cè)定：參照Aebi法［19］，略加改進(jìn)。反應(yīng)體系包括：50 mmol /L 磷酸緩沖液（pH 7.0）、20 mmol/L H2O2和100 μL酶提取液。以緩沖液作對(duì)照，加酶液后立即測(cè)定1 min內(nèi)A240。以1 min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個(gè)酶活單位。（3）GPX活性測(cè)定參照“谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）試劑盒”的方法。

2 結(jié)果

2.1 H2O2對(duì)黑曲霉1062生長(zhǎng)的影響

為了研究H2O2對(duì)黑曲霉生長(zhǎng)的影響，采用5 mmol/L和10 mmol/L的 H2O2對(duì)黑曲霉進(jìn)行脅迫培養(yǎng)。通過測(cè)定菌落生長(zhǎng)直徑發(fā)現(xiàn)5 mmol/L、10 mmol/L H2O2處理下的黑曲霉菌株在1-7 d菌落直徑明顯小于對(duì)照組（0 mmol/L H2O2），且10 mmol/L處理下的黑曲霉菌株菌落直徑總體小于5 mmol/L；另外，10 mmol/L處理下的黑曲霉在1-2 d內(nèi)無(wú)菌落產(chǎn)生，5 mmol/L處理下的黑曲霉在第1天無(wú)菌落產(chǎn)生，說(shuō)明隨著H2O2含量的增加，對(duì)黑曲霉菌落生長(zhǎng)的抑制作用愈加明顯（圖1）。

2.2 H2O2對(duì)黑曲霉產(chǎn)OTA的影響

為了驗(yàn)證OTA的生物合成是否與氧脅迫有關(guān)，本研究對(duì)不同濃度H2O2脅迫下的黑曲霉合成OTA的水平進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果如圖2所示，總體上菌體產(chǎn)OTA在第4天達(dá)到最大值，此后逐漸減少，原因可能是由于OTA被降解。H2O2的添加促進(jìn)了菌體合成OTA，尤其是第4天，10 mmol/L H2O2處理組OTA產(chǎn)量達(dá)到3.64 ng/mm2，是對(duì)照組OTA產(chǎn)量的2.3倍；5 mmol/L H2O2處理組OTA產(chǎn)量達(dá)到2.42 ng/mm2，是對(duì)照組OTA產(chǎn)量的1.55倍。這說(shuō)明過氧化氫能夠刺激菌體產(chǎn)毒。

圖1 H2O2的添加對(duì)黑曲霉1062生長(zhǎng)的影響

圖2 H2O2的添加對(duì)黑曲霉1062 OTA產(chǎn)量的影響

2.3 H2O2脅迫下黑曲霉1062胞內(nèi)活性氧水平分析

2.3.1 H2O2對(duì)黑曲霉1062胞內(nèi)H2O2含量的影響 H2O2是反應(yīng)胞內(nèi)活性氧的重要指標(biāo)，通過測(cè)定黑曲霉胞內(nèi)H2O2含量發(fā)現(xiàn)對(duì)照組在黑曲霉生長(zhǎng)的3-7 d過程中整體趨于穩(wěn)定態(tài)勢(shì)，而處理組胞內(nèi)H2O2波動(dòng)較大，圖3顯示在第3天時(shí)處理組明顯高于正常生長(zhǎng)的對(duì)照組，此時(shí)經(jīng)5 mmol/L H2O2脅迫生長(zhǎng)的黑曲霉胞內(nèi)H2O2含量為對(duì)照組的3.67倍，經(jīng)10 mmol/L H2O2脅迫生長(zhǎng)的黑曲霉胞內(nèi)H2O2含量為對(duì)照組的4.19倍；這說(shuō)明H2O2的添加明顯提高了胞內(nèi)H2O2的含量，此后呈現(xiàn)降低并趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，這可能是由于胞內(nèi)抗氧化酶的作用降低了胞內(nèi)H2O2的含量。

圖3 外源H2O2的添加對(duì)黑曲霉1062胞內(nèi)H2O2含量的影響

22響 圖4顯示處理組在生長(zhǎng)的3-7 d中，胞內(nèi)·產(chǎn)生速率呈現(xiàn)波動(dòng)狀態(tài)，且整體高于對(duì)照組，其中在生長(zhǎng)第3 天時(shí)最為顯著，經(jīng)5 mmol/L H2O2脅迫生長(zhǎng)的處理組·產(chǎn)生速率是對(duì)照組的1.62 倍，10 mmol/L H2O2脅迫生長(zhǎng)的處理組·產(chǎn)生速率是對(duì)照組的1.89 倍；以上結(jié)果可知由于外源H2O2脅迫作用，造成內(nèi)源性活性氧物質(zhì)H2O2以及·的產(chǎn)生在菌體生長(zhǎng)前期均有明顯升高。

圖4 外源H2O2的添加對(duì)黑曲霉1062·產(chǎn)生速率的影響

2.4 H2O2對(duì)黑曲霉胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化的影響

圖5反映了不同濃度H2O2脅迫下，黑曲霉胞內(nèi)MDA的變化情況。對(duì)照組MDA含量呈現(xiàn)逐漸升高并在生長(zhǎng)第7天略有減少的態(tài)勢(shì)，這可能與菌體胞內(nèi)抗氧化酶活性及菌體生長(zhǎng)代謝狀態(tài)相關(guān)；黑曲霉胞內(nèi)MDA含量測(cè)定結(jié)果顯示處理組在生長(zhǎng)第3 天顯著高于對(duì)照組，此時(shí)5 mmol/L H2O2脅迫生長(zhǎng)的黑曲霉胞內(nèi)MDA在第3 天為對(duì)照組的2.37 倍，10 mmol/L H2O2脅迫生長(zhǎng)的黑曲霉胞內(nèi)MDA為對(duì)照組的2.71倍，此后與對(duì)照組的差異逐漸減小。

圖5 外源H2O2的添加對(duì)黑曲霉1062胞內(nèi)MDA含量的影響

2.5 H2O2脅迫下黑曲霉胞內(nèi)抗氧化酶活性分析

2.5.1 H2O2對(duì)CAT酶活性的影響 H2O2脅迫生長(zhǎng)7 d測(cè)定胞內(nèi)CAT活性結(jié)果（圖6）顯示處理組CAT活性均高于對(duì)照組，隨著生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，黑曲霉酶活整體呈現(xiàn)出先增長(zhǎng)，后期降低的趨勢(shì)，且在第5 d CAT酶活達(dá)到最高，此時(shí)5 mmol/L H2O2脅迫生長(zhǎng)的黑曲霉的CAT酶活是對(duì)照組約1.53倍，10 mmol/L H2O2脅迫生長(zhǎng)的黑曲霉的CAT酶活是對(duì)照組約1.83倍?？梢娫贖2O2的脅迫下，黑曲霉為了適應(yīng)生存而提升了CAT酶活性來(lái)平衡胞內(nèi)過多的H2O2。

圖6 外源H2O2的添加對(duì)黑曲霉1062 CAT酶活的影響

2.5.2 H2O2對(duì)SOD酶活性的影響 黑曲霉菌體生長(zhǎng)的3-7 d過程中，胞內(nèi)SOD的酶活呈現(xiàn)與CAT酶活相似的變化趨勢(shì)，即：前期增長(zhǎng)，后期降低，且在第5 天達(dá)到最大值；但是5 mmol/L和10 mmol/L H2O2處理的黑曲霉與對(duì)照組相比，整體差異不大（圖7）；以上結(jié)果表明對(duì)于外源H2O2來(lái)說(shuō)，黑曲霉CAT對(duì)氧化脅迫響應(yīng)表現(xiàn)的更為強(qiáng)烈，而胞內(nèi)的SOD酶的活性升高較為緩慢。

圖7 外源H2O2的添加對(duì)黑曲霉1062 SOD酶活的影響

2.5.3 H2O2對(duì)GPX酶活性的影響 在整個(gè)黑曲霉生長(zhǎng)過程，經(jīng)H2O2處理的黑曲霉GPX酶活性整體高于對(duì)照組。且在第6 天達(dá)到最高值，此時(shí)5 mmol/L H2O2脅迫生長(zhǎng)的黑曲霉GPX酶活為對(duì)照組的1.51倍，經(jīng)10 mmol/L H2O2脅迫生長(zhǎng)的黑曲霉GPX酶活為對(duì)照組的1.57倍（圖8）；CAT酶雖能將H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O和O2，但是胞質(zhì)中的O2如果超過一定量后，會(huì)產(chǎn)生過氧化物，所以仍需GPX協(xié)助才能徹底清除H2O2。

圖8 外源H2O2的添加對(duì)黑曲霉1062 GPX酶活的影響

GPX 酶活性的升高有助于清除 H2O2以及由ROS誘發(fā)的脂類過氧化物，從而減輕對(duì)細(xì)胞的損傷。

3 討論

黑曲霉是一種重要的真核微生物，它在生長(zhǎng)過程中會(huì)面臨各種各樣的脅迫，氧化脅迫是最主要的脅迫之一［20-21］。H2O2作為強(qiáng)氧化劑，能夠穿過細(xì)胞膜在細(xì)胞內(nèi)自由移動(dòng)，并且能夠透過細(xì)胞器膜，使其在細(xì)胞內(nèi)的毒性擴(kuò)展，進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致自由基的產(chǎn)生與積累，造成細(xì)胞內(nèi)的氧化損傷，甚至引起細(xì)胞死亡［22］。本文以H2O2來(lái)創(chuàng)造氧脅迫條件，系統(tǒng)地研究了黑曲霉在此條件下的應(yīng)激響應(yīng)。從表型看，氧脅迫會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)，且具有顯著的劑量依賴性；氧脅迫會(huì)促進(jìn)黑曲霉合成OTA，且OTA的合成與氧脅迫程度具有相關(guān)性，但是氧脅迫不會(huì)造成OTA合成與代謝的動(dòng)力學(xué)趨勢(shì)變化。分析胞內(nèi)的H2O2水平，可以看出其與外部的H2O2添加水平是一致的，明顯高于對(duì)照組，證明其可以滲透進(jìn)細(xì)胞膜，且H2O2添加劑量尚未完全氧化破壞細(xì)胞膜。胞內(nèi)·O2-的含量在氧脅迫條件下有顯著增加，但由于其代謝途徑復(fù)雜，其含量與H2O2添加量的相關(guān)性并不明顯，尤其是黑曲霉生長(zhǎng)5 d以后，添加5 mmol/L 和10 mmol/L的H2O2對(duì)胞內(nèi)·O2-含量的影響趨于一致。H2O2脅迫下·O2

-產(chǎn)生速率的加快和黑曲霉胞內(nèi)H2O2含量的增加是導(dǎo)致MDA水平增加的主要原因［23-24］。在黑曲霉生長(zhǎng)7 d的過程中，外部的H2O2添加對(duì)MDA水平的影響與對(duì)照組相比逐漸趨于一致。這說(shuō)明黑曲霉在隨著生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，遭受氧化脅迫損傷程度在逐漸減弱直至與對(duì)照組一致。SOD是特異清除·O2

-的抗氧化酶，而CAT能以H2O2為底物催化其分解［25］，GPX則能催化H2O2以及脂質(zhì)過氧化物［26-27］。CAT，SOD及GPX相互配合能夠有效清除過量的有毒活性氧，是黑曲霉抗氧化防御體系的主要抗氧化酶［28］。在H2O2脅迫生長(zhǎng)7 d過程中，抗氧化酶均有不同程度的升高，是黑曲霉胞內(nèi)ROS含量在生長(zhǎng)5-7 d過程中逐漸趨于對(duì)照組的主要原因。黑曲霉OTA合成在ROS含量增加期間明顯升高說(shuō)明次級(jí)代謝也是排泄胞內(nèi)活性氧的有效途徑。

Fountain等［29］通過體外添加H2O2誘導(dǎo)氧化脅迫研究其對(duì)黃曲霉次級(jí)代謝生物合成及抗氧化酶的影響，經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素生物合成基因及抗氧化酶基因等均有不同程度的上調(diào)，這說(shuō)明真菌產(chǎn)毒及抗氧化基因的表達(dá)與菌體遭受氧化脅迫有很大的相關(guān)性，這與本研究結(jié)果顯示的OTA產(chǎn)量和抗氧化酶如CAT，SOD以及GPX酶活的升高相吻合。Jayashree等［30］通過比較寄生曲霉產(chǎn)毒菌株與不產(chǎn)毒菌株對(duì)氧的需求以及體內(nèi)氧化脅迫和抗氧化酶狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)毒菌株在顯示出更高的需氧量的同時(shí)，抗氧化酶酶活及氧化脅迫程度均高于不產(chǎn)毒菌株，由此得出毒素的產(chǎn)生可能是氧化脅迫的增加提升了脂質(zhì)過氧化及ROS的結(jié)果。本研究通過增加H2O2加入量來(lái)提升氧化脅迫的程度，結(jié)果顯示毒素的產(chǎn)量與氧化脅迫的程度成正相關(guān)，較好闡述了氧化脅迫可能是毒素產(chǎn)生的主要原因，這也與Zaccaria等［31］研究的結(jié)論一致。這些研究報(bào)道都說(shuō)明了氧化脅迫在提升菌體抗氧化防御能力的同時(shí)也影響了菌體的生長(zhǎng)及次級(jí)代謝，本研究也很好的證實(shí)了這一點(diǎn)。

正常生物體內(nèi)的自由基的產(chǎn)生和清除是處在動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)各種外源或內(nèi)源性因素引起的ROS超過體內(nèi)的清除能力時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致ROS水平升高，引起氧化應(yīng)激，氧化細(xì)胞內(nèi)不飽和脂、蛋白質(zhì)和DNA等大分子結(jié)構(gòu)，從而破壞他們的生物學(xué)功能［32］。體外H2O2可透過細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)，使胞內(nèi)H2O2含量增加的同時(shí)提高了·O2-的含量，造成脂質(zhì)過氧化和多種氧化損傷；為了減輕和修復(fù)氧化損傷，細(xì)胞通過自身抗氧化系統(tǒng)和增強(qiáng)次級(jí)代謝來(lái)對(duì)體內(nèi)多余的活性氧自由基進(jìn)行“解毒”與“排泄”［33-34］。

本研究的結(jié)果較好地解釋了上述現(xiàn)象，抗氧化酶的表達(dá)和次級(jí)代謝物OTA的合成可能都是黑曲霉在氧脅迫條件下生存的應(yīng)激響應(yīng)。為了排除H2O2對(duì)黑曲霉菌體除氧化脅迫外的其它影響，可以通過采用除H2O2外其他氧脅迫試劑來(lái)創(chuàng)造氧化脅迫的環(huán)境，從而驗(yàn)證黑曲霉的應(yīng)激響應(yīng)。本研究結(jié)果對(duì)控制黑曲霉的侵染和OTA的合成提供了新的思路，對(duì)以黑曲霉為細(xì)胞工廠的工業(yè)生產(chǎn)和以黑曲霉為主要侵染菌的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的健康發(fā)展有重要意義。

4 結(jié)論

通過5 mmol/L 和10 mmol/L H2O2對(duì)黑曲霉1062脅迫生長(zhǎng)7 d過程中，隨著H2O2濃度增加，菌體胞內(nèi)ROS及 MDA含量在生長(zhǎng)前期明顯升高，菌體生長(zhǎng)亦隨之遲緩，菌落直徑減少，這說(shuō)明H2O2能夠加重黑曲霉胞內(nèi)氧化脅迫水平從而抑制菌體的生長(zhǎng)；菌體在氧脅迫下，通過提升抗氧化酶活性，增加毒素的合成來(lái)有效的緩解活性氧的毒害，這也與 ROS及 MDA含量在生長(zhǎng)5-7 d逐漸與對(duì)照組趨于一致相符合。

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