楊陽 郭金雙,2 鄭秀娥 崔濤 王玉 陳洪忠 夏文龍＊

1 山東省食品藥品審評查驗中心 （山東 濟南 250014）

2 山東政法學(xué)院 （山東 濟南 250014）

內(nèi)容提要： 類風濕因子檢測試劑是用于體外定量檢測人體樣本中類風濕因子濃度的試劑，臨床上主要用于類風濕關(guān)節(jié)炎的輔助診斷。文章重點對類風濕因子檢測試劑注冊技術(shù)審評要點進行探討和詳細解析，旨在為注冊申請人提供建議和參考。

自身抗體是人體針對自身組織、細胞或蛋白質(zhì)等自身抗原產(chǎn)生的抗體。在正常情況下，人體具有完整的自身免疫耐受機制，對自身組分不產(chǎn)生或僅產(chǎn)生微弱的免疫應(yīng)答，不會引發(fā)疾病。當自身免疫耐受機制遭到破壞時，人體產(chǎn)生的自身抗體超過某一水平，就可能導(dǎo)致自身組織損傷而引起自身免疫性疾病。類風濕因子是針對人變性免疫球蛋白G分子Fc片段的一種自身抗體，主要存在于類風濕關(guān)節(jié)炎患者血液中，是診斷類風濕關(guān)節(jié)炎最早使用的血清學(xué)指標。類風濕因子有五種亞型，分別是IgM、IgG、IgA、IgD和IgE，臨床上對類風濕關(guān)節(jié)炎的診斷、分型和療效觀察通常以檢測IgM型類風濕因子為主。

類風濕因子檢測試劑是臨床輔助診斷類風濕關(guān)節(jié)炎的重要工具之一，目前國內(nèi)類風因子檢測用相關(guān)試劑產(chǎn)品注冊證有200余張，但由于法規(guī)更新和產(chǎn)品的更新迭代，該產(chǎn)品注冊申報過程中仍存在一些問題，本文根據(jù)體外診斷試劑注冊相關(guān)法規(guī)和類風濕因子檢測試劑注冊申報現(xiàn)狀對注冊技術(shù)審評要點進行探討和詳細解析，旨在為注冊申請人提供建議和參考。

1.適用范圍

目前已上市的類風濕因子檢測試劑的方法學(xué)有免疫比濁法、膠體金免疫層析法、化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫吸附法等，其中免疫比濁法占比87%，為臨床上主要使用的檢驗方法。本文所指類風濕因子檢測試劑是以免疫比濁法為基本原理，利用生化分析儀等分析儀器體外定量檢測人體血清或血漿樣本中類風濕因子含量的試劑。

2.分析性能評估

2.1 分析性能總體要求

類風濕因子檢測試劑分析性能評估主要包括樣本穩(wěn)定性，空白限、檢出限及定量限，準確度，精密度，分析特異性，高劑量鉤狀效應(yīng)，測量區(qū)間，校準品量值溯源和質(zhì)控品賦值等項目的研究資料。申請人需用多批產(chǎn)品進行分析性能研究，如申報產(chǎn)品適用于多個適用機型應(yīng)在各個機型上分別進行研究，如申報產(chǎn)品有不同的包裝規(guī)格應(yīng)對各包裝規(guī)格進行分析或驗證。用于分析性能評估的產(chǎn)品應(yīng)該是在原材料和生產(chǎn)工藝經(jīng)過選擇和確認、質(zhì)量管理體系有效控制并且保證產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定的基礎(chǔ)上生產(chǎn)的[1]。分析性能評估時應(yīng)包含所選用的校準品、質(zhì)控品以評估整個系統(tǒng)的性能。

2.2 空白限、檢出限、定量限

空白限、檢出限、定量限是針對類風濕因子檢測試劑對樣本濃度下限檢出能力的評價指標。空白限是指空白樣本的檢測上限，一般通過檢測空白樣本來確定。檢出限是可持續(xù)檢出待測物的最低濃度，可通過對已知濃度的樣本進行系列稀釋后重復(fù)檢測獲得。定量限是指達到預(yù)設(shè)準確度要求時可測量的最低待測物濃度，需考慮正確度和精密度的要求。

2.3 線性

線性是體外診斷試劑產(chǎn)品準確性評價的基礎(chǔ)，也是整個IVD產(chǎn)品質(zhì)量評價的關(guān)鍵[2]。評價線性通常采用高濃度樣本與低濃度樣本混合稀釋所得到的線性參考品，線性參考品濃度應(yīng)能覆蓋試劑宣稱的線性范圍，濃度點應(yīng)不少于5個，每個濃度檢測3次，求平均值。以理論濃度為自變量，以檢測濃度平均值為因變量求出線性回歸方程，計算相關(guān)系數(shù)（r）以及檢測均值與理論值的相對（或絕對）偏差。一般情況下，相關(guān)系數(shù)r應(yīng)≥0.990；線性區(qū)間內(nèi)的偏差可以分段以相對偏差或絕對偏差表達。

2.4 正確度

正確度由系統(tǒng)測量誤差決定，正確度的度量為偏倚[3]。申請人可根據(jù)參考物質(zhì)、比較測量程序等的可獲得性選擇合適的方法進行正確度評價。正確度研究方法通常有相對偏差法、回收試驗法、比對試驗法三種。相對偏差法是用待評價試劑檢測有證參考物質(zhì)（CRM）或其他公認的參考物質(zhì)、或由參考方法定值的不同濃度的人源樣品，計算相對偏差?；厥赵囼灧醇訕嘶厥眨峭ㄟ^在人體樣本中加入一定體積標準溶液或純品，用待評價試劑分別檢測加標樣本和基礎(chǔ)樣本，計算回收率。比對試驗法由申請人選取已上市的檢測系統(tǒng)作為比對方法，用待評價試劑和比對試劑分別檢測不少于40個在檢測濃度范圍內(nèi)不同濃度的樣本，計算兩組檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)及每個濃度點的相對偏差。

2.5 精密度

由操作者、測量儀器、試劑批次、環(huán)境條件等因素引起的隨機測量誤差決定了產(chǎn)品的精密度，精密度通常包含中間精密度、重復(fù)性、再現(xiàn)性，可用標準差、方差或變異系數(shù)表示。重復(fù)性通常是在短時間內(nèi)由同一操作者在同一測量系統(tǒng)、相同操作條件下對相同被測量進行重復(fù)測量的精密度。重復(fù)性應(yīng)至少研究兩個不同濃度水平樣本重復(fù)測試的變異系數(shù)，這兩個濃度水平樣本應(yīng)能夠代表正常人群和異常人群。再現(xiàn)性是在不同地點、不同操作者、不同測量系統(tǒng)的測量條件下對同一或相似被測對象重復(fù)測量的精密度。中間精密度是指在操作者、測量儀器、試劑批次、環(huán)境條件等條件中一個或幾個不同的情況下產(chǎn)生的精密度，它是介于重復(fù)性和再現(xiàn)性兩種極端精密度之間的情況。

2.6 分析特異性

分析特異性包括干擾試驗研究和交叉反應(yīng)研究。干擾物質(zhì)研究通常包括外源性干擾物質(zhì)研究和內(nèi)源性干擾物質(zhì)研究，常見的內(nèi)源性干擾物質(zhì)有甘油三酯、膽紅素、血紅蛋白、自身抗體、異嗜性抗體等；常見的外源性干擾物質(zhì)包括樣本抗凝劑、常用藥物及其代謝物、患者群體使用的藥物及其代謝物等，申請人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特點選擇潛在的干擾物質(zhì)研究，并明確干擾物質(zhì)不產(chǎn)生影響的最大濃度。交叉反應(yīng)研究應(yīng)對可能的交叉反應(yīng)物質(zhì)進行檢測，并對檢測結(jié)果設(shè)定合理的可接受范圍，如果超出可接受范圍，則認為該物質(zhì)產(chǎn)生交叉反應(yīng)，并進一步評估該物質(zhì)濃度與交叉程度之間的關(guān)系。如果檢測結(jié)果在接受范圍內(nèi)，則認為該濃度的物質(zhì)不產(chǎn)生交叉反應(yīng)，需明確不產(chǎn)生交叉反應(yīng)的物質(zhì)濃度上限。

2.7 鉤狀效應(yīng)

鉤狀效應(yīng)是由于抗原抗體比例不合適而導(dǎo)致的假陰性現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，在一定濃度的抗體溶液中加入不同濃度的抗原時，免疫復(fù)合物的生成量先是隨著抗原濃度的增加而逐步增加，在達到峰值后生成量隨著抗原濃度的進一步增加反而減少，從而導(dǎo)致檢測濃度值低于真實值[4]。在進行類風濕因子檢測試劑鉤狀效應(yīng)研究時可選擇濃度比較高的樣本梯度稀釋，由低到高進行檢測以確定不會產(chǎn)生鉤狀效應(yīng)的最高濃度點。

2.8 校準品及質(zhì)控品

試劑中如果包含校準品、質(zhì)控品，則應(yīng)參照GB/T 21415-2008、YY/T 1652-2019等相關(guān)標準的要求，提供校準品的量值溯源資料、質(zhì)控品的賦值資料。校準品溯源資料中應(yīng)包括溯源鏈、賦值程序、不確定度的研究及其評定要求。質(zhì)控品賦值研究除考慮不同的適用機型外，還應(yīng)考慮時間、地點、試劑批次和操作人員。校準品/質(zhì)控品基質(zhì)與臨床樣本不同時，還應(yīng)進行基質(zhì)效應(yīng)評估。

3.參考區(qū)間

試劑參考區(qū)間研究方案應(yīng)考慮年齡、性別、地域等因素，樣本例數(shù)必須符合統(tǒng)計學(xué)要求。參考區(qū)間研究資料中除包含研究方案、樣本來源、統(tǒng)計方法外，還應(yīng)包括參考區(qū)間確定人群的納入標準和排除標準。申請人可以通過參考文獻資料的方式確定參考區(qū)間，但應(yīng)采用擬申報產(chǎn)品對該區(qū)間進行驗證，驗證用樣本量也應(yīng)符合統(tǒng)計學(xué)要求，最后應(yīng)在試劑說明書中注明參考區(qū)間的研究結(jié)果。臨床上，在類風濕關(guān)節(jié)炎患者中類風濕因子陽性的概率大約在70%～80%，少數(shù)正常人也會出現(xiàn)類風濕因子陽性，此外，一些其他自身免疫病、肝炎、高球蛋白血癥以及肺結(jié)核等疾病患者類風濕因子也可能為陽性[5]。由于類風濕因子針對類風濕關(guān)節(jié)炎的非特異性，所以在類風濕因子檢測為陽性時還需結(jié)合其他檢查及臨床表現(xiàn)才能做出診斷。反之，如果類風濕因子檢測為陰性也不能排除患類風濕關(guān)節(jié)炎的可能，需結(jié)合臨床進一步檢查。

4.穩(wěn)定性研究

穩(wěn)定性研究是對產(chǎn)品使用、運輸以及長期儲存過程中產(chǎn)品性能是否穩(wěn)定的研究。開展穩(wěn)定性研究，申請人首先應(yīng)制定合理的研究方案，研究方案應(yīng)包括儲存條件、試劑信息、檢驗時間點的間隔、可接受標準等。開展長期穩(wěn)定性研究，應(yīng)使用三批以上的產(chǎn)品在規(guī)定條件下儲存至成品有效期后，最后對效期后產(chǎn)品的性能進行檢驗是否符合可接受標準。使用穩(wěn)定性是申報產(chǎn)品實際使用期間的穩(wěn)定性。除開封穩(wěn)定性外，還應(yīng)根據(jù)實際情況開展復(fù)溶穩(wěn)定性、機載穩(wěn)定性及凍融次數(shù)研究。如試劑盒包括校準品，還應(yīng)進行校準或校準頻率穩(wěn)定性研究。運輸穩(wěn)定性研究研究過程中，應(yīng)考慮產(chǎn)品運輸所需的正確環(huán)境條件、產(chǎn)品的包裝方式以及暴露的最差運輸條件。

5.臨床評價研究

類風濕因子檢測試劑已經(jīng)列入免臨床目錄中，根據(jù)《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》，該產(chǎn)品可選擇免于進行臨床試驗的臨床評價路徑，也可以選擇開展臨床試驗的路徑。免臨床試驗的臨床評價研究應(yīng)符合《免于臨床試驗的體外診斷試劑臨床評價技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，臨床試驗的開展應(yīng)符合《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》《醫(yī)療器械臨床試驗管理規(guī)范》的要求。

5.1 受試人群及樣本要求

臨床評價受試人群應(yīng)能代表產(chǎn)品預(yù)期用途所聲稱的適用人群的特征。所選取的樣本應(yīng)能評價產(chǎn)品臨床應(yīng)用過程的安全性、有效性，并能涵蓋預(yù)期用途和干擾因素。樣本量的計算應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特點、統(tǒng)計學(xué)分析模型等要素選擇合適的樣本量估算方法。

5.2 統(tǒng)計學(xué)分析

體外診斷試劑臨床評價的統(tǒng)計分析包括參數(shù)估計和假設(shè)檢驗。參數(shù)估計用于確認靈敏度、特異性、回歸系數(shù)和截距等評價指標的水平，假設(shè)檢驗是通過對統(tǒng)計學(xué)指標提出無效假設(shè)或備擇假設(shè)，進行相關(guān)統(tǒng)計學(xué)推斷。類風濕因子檢測試劑為定量檢測試劑，統(tǒng)計分析過程中，應(yīng)先根據(jù)臨床試驗數(shù)據(jù)的正/偏態(tài)分布情況，選擇合理的統(tǒng)計學(xué)方法進行分析，如：根據(jù)臨床試驗數(shù)據(jù)繪制散點圖，進行相關(guān)分析；采用Bland-Altman法，評價待評價試劑與比對試劑兩種檢測結(jié)果的一致性；通過回歸分析對兩種檢測系統(tǒng)的一致性進行評價，回歸分析時應(yīng)重點觀察回歸系數(shù)、回歸擬合方程（斜率和y軸截距）等，并計算回歸系數(shù)和截距的置信區(qū)間。最后需對所評價指標進行假設(shè)檢驗。

6.產(chǎn)品技術(shù)要求及檢驗報告

產(chǎn)品技術(shù)要求是對產(chǎn)品使用性能、理化性能、安全性能等方面提出的要求，體外診斷試劑產(chǎn)品技術(shù)要求主要包括性能指標及檢驗方法。

6.1 主要性能指標

性能指標主要是針對成品可客觀判定的功能性和安全性指標。定量檢測試劑主要包含物理指標（如：外觀、裝量），分析靈敏度指標（如：空白限、檢出限），準確度指標（如：正確度、精密度），以及線性、穩(wěn)定性等其他指標。如果試劑盒中包括校準品、質(zhì)控品，還應(yīng)針對性的制定相應(yīng)的指標，如校準品的物理性狀、正確度、水分含量、均勻性等，質(zhì)控品的物理性狀、可接受范圍、均勻性等。產(chǎn)品技術(shù)要求的制定可以參考YY/T 1255-2015、YY/T 1549-2017、YY/T 1662-2019、YY/T 1652-2019等行業(yè)標準的要求，建議產(chǎn)品技術(shù)要求不低于行業(yè)標準的要求。

6.2 檢驗方法

檢驗方法是用來驗證產(chǎn)品是否符合性能指標的具體操作方法。檢驗方法的建立應(yīng)優(yōu)先選擇已建立的標準方法。檢驗方法應(yīng)具備可重現(xiàn)性、可操作性，因此必須明確試驗的具體步驟、試驗的次數(shù)、最終計算方法和結(jié)果表述等，此外還應(yīng)明確檢驗中所采用的參考品/標準品、樣本等制備方法。

6.3 產(chǎn)品檢驗報告

申請人用于檢驗的產(chǎn)品應(yīng)該是在原材料以及生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的基礎(chǔ)上，在符合質(zhì)量管理體系要求的條件下生產(chǎn)的產(chǎn)品。申請注冊提交的檢驗報告可以是申請人的自檢報告，也可以是委托有資質(zhì)的醫(yī)療器械檢驗機構(gòu)出具的檢驗報告[6]。如果申請人注冊申請時提交自檢報告，應(yīng)按照《醫(yī)療器械自檢管理規(guī)定》提交資料，在注冊質(zhì)量管理體系核查時對企業(yè)的自檢能力進行檢查。

7.產(chǎn)品說明書

說明書是指導(dǎo)醫(yī)學(xué)實驗室人員正確操作、臨床醫(yī)生作出合理結(jié)果解釋的重要指南，是注冊申報中最重要的資料之一。說明書包含了產(chǎn)品預(yù)期用途、檢驗方法、樣本要求、檢測結(jié)果的解釋等重要信息，上述內(nèi)容均應(yīng)在研發(fā)過程中進行了相應(yīng)的研究論證。

7.1 產(chǎn)品名稱及預(yù)期用途

產(chǎn)品名稱通常為類風濕因子檢測試劑（免疫比濁法）。預(yù)期用途通常為用于體外定量測定人體樣本中類風濕因子的濃度，樣本類型可以為血清、血漿或全血，應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品研究實際進行描述。預(yù)期用途中還應(yīng)包含臨床適應(yīng)癥、背景情況以及常用檢驗方法。

7.2 檢驗原理及檢驗方法

本文所指類風濕因子檢測試劑的檢驗原理是基于抗原-抗體反應(yīng)，通過檢測類風濕因子抗原抗體復(fù)合物所引起的濁度變化進行定量測定類風濕因子的濃度。說明書中檢驗方法是指導(dǎo)臨床檢驗人員的操作方法，需詳細說明試驗條件（溫度、時間、儀器波長等）、操作步驟（試劑配制方法、試驗具體操作步驟）、結(jié)果計算方式以及試驗注意事項等。此外，還應(yīng)注明校準程序和質(zhì)控程序，包括：校準品/質(zhì)控品的使用方法、校準曲線的繪制、校準/質(zhì)控周期、對質(zhì)控結(jié)果的必要解釋等。

7.3 參考區(qū)間及檢驗結(jié)果的解釋

參考區(qū)間為指導(dǎo)臨床醫(yī)生作出臨床診斷的重要依據(jù)。說明書除需注明本試劑盒參考區(qū)間以外，還應(yīng)簡要說明參考區(qū)間確定所采用的樣本來源及確定方法，以供臨床醫(yī)生參考。同時，由于用于參考區(qū)間研究人群和研究樣本量的局限性，應(yīng)建議各實驗室建立自己的參考區(qū)間。由于類風濕因子并不是類風濕關(guān)節(jié)炎診斷的特異性指標，檢驗結(jié)果的解釋中應(yīng)提示該檢驗結(jié)果僅供臨床參考，不能單獨作為確診或排除病例的依據(jù)。同時應(yīng)說明可能對試驗結(jié)果產(chǎn)生影響的因素，說明該檢驗方法的局限性。

8.小結(jié)

本文根據(jù)現(xiàn)行法規(guī)和類風濕因子檢測試劑注冊申報情況，總結(jié)分析了類風濕因子檢測試劑注冊申報過程中的技術(shù)審評要點，對適用范圍、分析性能評估、參考區(qū)間研究、穩(wěn)定性研究、臨床評價研究、產(chǎn)品技術(shù)要求及檢驗報告、產(chǎn)品說明書等內(nèi)容進行重點解析，為注冊申報類風濕因子檢測試劑的相關(guān)企業(yè)在申報資料的準備、撰寫等實際操作層面提供工具和指南。