常 煦，謝再斌，劉廣新，李志軍，許引虎，陳 暉

（1.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443003；2.湖北省酵母功能重點實驗室，湖北宜昌 443003）

雜醇油是三個碳以上一元醇的總稱，是酒類行業(yè)長期以來非常關(guān)注的一個課題研究對象[1]。雜醇油是一類重要的風味物質(zhì)，白酒中適當?shù)碾s醇油可以豐富酒的風味；雜醇油也是很多白酒廠頭疼的一類物質(zhì)，有研究表明，高級醇對人體的中毒和麻醉作用比乙醇本身還強且代謝緩慢，在人體中停留時間長，是造成白酒苦澀、邪雜味以及影響飲后舒適感的一類物質(zhì)[2]。小曲白酒、麩曲白酒以及米酒等快速發(fā)酵酒類，雜醇油普遍較大曲白酒高。既要不丟失雜醇油自身給酒體帶來的風味，又不能讓雜醇油含量過高影響酒的飲后舒適度，通過合理的發(fā)酵調(diào)控實現(xiàn)雜醇油適量生成是酒行業(yè)的一個共性目標[3]。

事實上，對于雜醇油的研究已久，國外對于雜醇油的研究，尤其是啤酒和葡萄酒領(lǐng)域已經(jīng)積累了豐富的經(jīng)驗，對于雜醇油的形成機制已經(jīng)有相對透徹的闡述[4-6]。雜醇油是酵母在酒精發(fā)酵過程中伴隨產(chǎn)生的一類次級代謝產(chǎn)物，產(chǎn)生速率、累積量幾乎與酒精發(fā)酵過程一致[7]。酵母是目前產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用最好的一類微生物，尤其是在酒行業(yè)，無論白酒、啤酒還是葡萄酒都具備相對成熟的商用酵母產(chǎn)品體系，一般而言，對于商用酵母主要考慮酒度、酸度、溫度的耐受性以及相關(guān)風味體現(xiàn)[8-10]，商用酵母的雜醇油生成能力還較少有報道，本次研究在以大米為原料，米酒發(fā)酵基礎(chǔ)工藝為標準的環(huán)境下，探究不同商用酵母的雜醇油生成能力[11]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：糖化酶15 萬單位，湖南新鴻鷹生物工程有限公司；大米，采購自附近農(nóng)貿(mào)市場。

酵母：商用酵母A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M 共13 款酵母，均為安琪酵母已完成產(chǎn)業(yè)化進行市售酵母，酵母活細胞數(shù)均在150～200 億/g 的范圍。酒精及白酒使用5 款（A、B、C、D、E），葡萄酒及啤酒使用5 款（F、G、H、I、J），黃酒1 款（K），面用2款（L、M）。

儀器設(shè)備：恒溫生化培養(yǎng)箱HPX-11-400，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；小型白酒蒸餾器，自制；快速酒精檢測儀（DMA-35），奧地利安東帕；Agilent 8890 氣相色譜儀，美國安捷倫公司，配有氫火焰檢測器和7693A自動進樣器。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗體系建立方法

將100 g大米按照1∶1.1的比例加水置于500 mL三角瓶中浸泡1 h，上蒸鍋進行蒸煮，蒸鍋冒圓氣時計時30 min，米飯達到不粘、無硬心即可，將米飯攤晾、打散，添加酵母0.1 g，100 μL 糖化酶，補水150 mL，用移液槍進行補水定位，將最終料水比固定于1∶2.6，將三角瓶放入31 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱進行發(fā)酵。

1.2.2 實驗體系蒸餾處理方法

將發(fā)酵體系全部發(fā)酵液移入1 L 蒸餾三角燒瓶中，200 mL 純凈水洗凈原發(fā)酵三角瓶，并將該200 mL 水液并入蒸餾燒瓶中，蒸餾取酒200 mL后，待氣相檢測。

1.2.3 雜醇油分析方法

采用氣相色譜法，載氣為氮氣，柱流速1.3 mL/min；初始柱溫40 ℃，保持5 min，然后以6 ℃/min 升至52 ℃，再以12 ℃/min 升至130 ℃，以25 ℃/min升至240 ℃，保持10 min；進樣量1 μL，采用分流進樣，分流比40∶1，進樣口溫度250 ℃。檢測異戊醇、異丁醇采用外標法進行含量計算，雜醇油含量折60%vol白酒進行計算，采用如下公式：

2 結(jié)果與分析

2.1 不同商用酵母的異戊醇、異丁醇、酒精度情況

本次實驗重點對不同商用酵母發(fā)酵后得到的酒樣中的異戊醇、異丁醇以及酒精度進行檢測。異戊醇、異丁醇表示酵母在特定發(fā)酵條件下雜醇油的生成能力，酒精度表示在特定條件下，酵母的酒精發(fā)酵性能，具體檢測指標見表1。

表1 蒸餾酒液中異戊醇、異丁醇、酒精度檢測結(jié)果

從檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用于不同領(lǐng)域的商用酵母，在發(fā)酵最終結(jié)果上存在特異性差異。從所有商用酵母特定條件發(fā)酵結(jié)果上看，異戊醇高于異丁醇，且酵母間異戊醇的變化幅度比異丁醇大，是影響雜醇油總體含量的主要因素[12]。

在最終產(chǎn)酒方面不同的商用酵母也存在差異。白酒及酒精酵母的產(chǎn)酒功能性都達到了相對比較高的水平，尤其酵母C 體現(xiàn)了最大產(chǎn)酒力。F、G、H、I、J 主要用于葡萄酒啤酒發(fā)酵的酵母，在本次實驗條件下出現(xiàn)了明顯的發(fā)酵差異，F(xiàn)、G、H 主要應(yīng)用于果酒發(fā)酵，在糧食中的發(fā)酵狀態(tài)出現(xiàn)明顯不足；I 和J 酵母在糧食發(fā)酵上具備很好的發(fā)酵活力。K 應(yīng)用于黃酒較多，其酒精耐受性等特殊性能無法在本次實驗中體現(xiàn)。L 和M 酵母不應(yīng)用于釀造領(lǐng)域，在酒的發(fā)酵上與酒精、白酒酵母存在明顯差異。從本次結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵性能上，酒精和白酒酵母整體存在優(yōu)勢，一些啤酒、果酒酵母在發(fā)酵性能上，也可以滿足白酒領(lǐng)域的發(fā)酵能力要求。

2.2 不同商用酵母產(chǎn)雜醇油能力結(jié)果

根據(jù)1.2.3 所述的雜醇油計算方法，不同的酵母在雜醇油的產(chǎn)生能力上有明顯差異，檢測結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同酵母蒸餾酒液雜醇油生成表

在雜醇油的生成能力上，不同的商用酵母在本次發(fā)酵條件下表現(xiàn)出差異性，主要體現(xiàn)在如下幾個方面。

（1）酵母功能篩分差異。所有酵母在篩分之初都有一定的特定選擇范圍，比如酵母的高耐受性、產(chǎn)香特性、產(chǎn)氣特性等，通過定向選育，最終實現(xiàn)不同酵母在不同領(lǐng)域的商業(yè)化和應(yīng)用。本次實驗情況表明，在特定條件下不同酵母產(chǎn)雜醇油能力有較大的差異。相比較，白酒和酒精用酵母，整體產(chǎn)雜醇油能力適中，C、E 產(chǎn)雜醇油能力較弱；葡啤酒類酵母，由于更多的關(guān)注點在香氣產(chǎn)生以及發(fā)酵香氣復(fù)合性上，一些酵母的產(chǎn)雜醇油能力強，一些酵母適中；面用酵母L 在此次發(fā)酵中，表現(xiàn)出最高的雜醇油生成量，而另一種面用酵母展現(xiàn)了較少的雜醇油生成能力，說明酵母功能定向篩分，酵母在生物代謝方面存在差異。在本次實驗中，發(fā)現(xiàn)一株啤酒酵母具備不錯的酒精發(fā)酵性能和低產(chǎn)雜醇油性能，可以作為后續(xù)在白酒領(lǐng)域進行該酵母應(yīng)用的指導(dǎo)。

（2）釀酒酵母與非釀酒酵母差異。在本次實驗采用的13種商用酵母中，酵母E為非釀酒酵母類酵母，其余12 種酵母均為釀酒酵母屬酵母。從檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，酵母E 無論是發(fā)酵酒精度還是雜醇油都有較好的表現(xiàn)，尤其是其雜醇油生成能力在所有酵母中屬于較低水平，普遍低于其他釀酒酵母?？梢酝茢喑鑫磥硪恍┓轻劸平湍笇俳湍割悜?yīng)用在一些特定需求上，或許可以更好的滿足發(fā)酵要求[13]。

（3）分子手段改進對于產(chǎn)雜醇油能力影響。酒精酵母C 為本次實驗最強酵母，是產(chǎn)乙醇最多的酵母，也是雜醇油產(chǎn)量最低的酵母，在本次考量的酵母性能上都處于最優(yōu)，這款酵母最大的特點是做過基因改造，主要用于二代纖維素乙醇行業(yè)，可以利用五碳糖發(fā)酵乙醇。由于基因改造特性以及行業(yè)應(yīng)用限制，目前這個酵母無法在國內(nèi)食品領(lǐng)域使用，從本次實驗結(jié)果可以說明，對酵母進行五碳糖發(fā)酵功能改進后，可影響酵母的某些代謝方式，增強了對于底物的適應(yīng)范圍，從某種程度上降低了雜醇的代謝，因此在此次實驗中得到了較好的結(jié)果。本次實驗采用市售酵母種類多，涉及酵母應(yīng)用范圍廣，可以清晰的得出通過分子改進的酵母在釀造領(lǐng)域的未來前景是很好的，隨著生物科技的進步以及生物安全防控的健全，未來通過分子生物學(xué)方法進行微生物改進和應(yīng)用潛力巨大[14]。

3 結(jié)論

在酵母菌株產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用之初，都針對特定領(lǐng)域或者方向進行了定向化篩選，但是并不排除酵母之間存在跨領(lǐng)域應(yīng)用的可能。在本次測試的13 個已產(chǎn)業(yè)化酵母中，由于篩選差異、菌種差異等，能判斷出，在產(chǎn)酒方面，白酒和酒精酵母具有較好的性能，一些特種發(fā)酵酵母如葡萄酒酵母、啤酒酵母在產(chǎn)醇能力上，具備較強的性能，這類酵母通常具有較好的風味發(fā)酵能力，可以嘗試在白酒工業(yè)中進行應(yīng)用；在雜醇油生成能力上，對于商業(yè)化酵母，可能存在的酵母菌種、生產(chǎn)發(fā)酵工藝以及酵母分子改造等都會影響到酵母的產(chǎn)雜醇油能力。在本次試驗中能確認的是，一些酵母在特定發(fā)酵環(huán)境下具有低產(chǎn)雜醇油的性能，通過對酵母進行分子改造，在雜醇油生成上出現(xiàn)明顯的降低，印證了一些學(xué)者前期所做的一些工作[15]。

影響酵母發(fā)酵性能，尤其是酵母產(chǎn)雜醇油的因子有很多，特別是在以固態(tài)發(fā)酵為主的中國白酒釀造產(chǎn)業(yè)[16]，從根本層面上，還是要解決微生物的問題。通過尋找到具有相關(guān)低產(chǎn)雜醇油能力的微生物，再輔之以合適的發(fā)酵條件，在一定程度上控制雜醇油的產(chǎn)出，達到產(chǎn)量與質(zhì)量的統(tǒng)一，是中國白酒發(fā)酵一條重要路徑。