許 玲，董喬娟，于文娟，于盼盼，姜明慧，白秀彬，趙紀(jì)文

（山東扳倒井股份有限公司，山東高青 256300）

醬香型白酒是中國(guó)最具有代表性的蒸餾酒，以獨(dú)特的釀造工藝形成醬香突出、酒體醇厚、空杯留香等獨(dú)特的風(fēng)格體系[1]。發(fā)酵酒醅中的微生物結(jié)構(gòu)直接決定著酒的產(chǎn)質(zhì)量與酒體風(fēng)味。細(xì)菌在發(fā)酵過(guò)程中主要是分泌風(fēng)味型酶、代謝產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)、調(diào)節(jié)發(fā)酵過(guò)程微生態(tài)結(jié)構(gòu)等。因此，研究醬香型白酒發(fā)酵過(guò)程的細(xì)菌菌群多樣性及其結(jié)構(gòu)對(duì)解析醬香型白酒獨(dú)特風(fēng)味的形成具有重要意義[2]。

醬香型白酒釀造工藝復(fù)雜，高溫堆積是醬香型白酒獨(dú)特而又關(guān)鍵的工藝環(huán)節(jié)之一。堆積過(guò)程是物系、酶系、菌系平衡的過(guò)程，有的行業(yè)專家稱其為“二次制曲”。本研究以國(guó)井不同輪次醬香堆積發(fā)酵后的酒醅為樣本，分析細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)特征，即厭氧發(fā)酵的菌系底盤。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品采集

樣品采自山東扳倒井股份有限公司7 個(gè)不同輪次醬香堆積發(fā)酵后的酒醅，采樣點(diǎn)如圖1 所示，每堆酒醅按照升溫情況，在中軸斷面分為五個(gè)層次，每個(gè)層次分別取樣，取樣時(shí)在每個(gè)溫度層均勻取樣，最后將五個(gè)層次的樣品混合，四分法取樣，即可代表本輪次堆積酒醅。每輪次樣品采集完后及時(shí)將樣品轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱密封保存。

圖1 扳倒井大醬堆積發(fā)酵酒醅樣品采樣點(diǎn)

1.2 試驗(yàn)方法

采用高通量測(cè)序方法對(duì)樣品的微生物多樣性進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)操作及數(shù)據(jù)報(bào)告出具由上海生工完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同輪次的細(xì)菌群落Alpha多樣性

2.1.1 基于可操作分類單元（OTU）聚類分析

利用擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)分析國(guó)井醬香型白酒7個(gè)不同輪次堆積發(fā)酵酒醅中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性及演替規(guī)律，共獲得1784438 條高質(zhì)量序列。對(duì)不同輪次堆積發(fā)酵酒醅樣品利用Rarefaction curve進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果表明，每個(gè)樣本的序列數(shù)均超過(guò)了30000，且樣本的稀釋曲線與Shannon 指數(shù)曲線均趨于平坦，充分說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)微生物的多樣性信息。

2.1.2 多樣性分析

Alpha 多樣性分析可揭示堆積發(fā)酵酒醅中微生物群落的豐富度和多樣性。Shannon指數(shù)反應(yīng)微生物群落的物種多樣性，Coverage 指數(shù)反應(yīng)微生物群落覆蓋度。

圖2 不同輪次細(xì)菌的稀釋曲線

圖3 不同輪次細(xì)菌的Shannon曲線

由表1 可知，不同輪次堆積酒醅樣本共得到OTU 數(shù)1410，其中第2 輪次樣本中的OTU 數(shù)最高（251 個(gè)），下沙輪次最低（137 個(gè)）。Chao 和Ace 值越高，說(shuō)明群落越豐富；Shannon 和Simpson 值表示群落多樣性，Shannon值越高，說(shuō)明群落多樣性越明顯，Simpson 值越高，說(shuō)明群落多樣性越低。第2 輪次樣本中的Chao和Ace值最高，下沙輪次最低;第5輪次的Shannon 值最高，第2 輪次的Shannon 值最低。各個(gè)樣本的覆蓋率都在99.90 %以上，說(shuō)明各樣品文庫(kù)的覆蓋率足夠大，測(cè)序結(jié)果可體現(xiàn)堆積酒醅樣本細(xì)菌群落多樣性的真實(shí)情況。

表1 不同輪次細(xì)菌群落多樣性指數(shù)

2.2 不同輪次的細(xì)菌物種與群落結(jié)構(gòu)分析

采用堆積柱形圖直觀呈現(xiàn)樣本中各細(xì)菌的相對(duì)豐度。對(duì)不同輪次醬香堆積發(fā)酵酒醅中細(xì)菌的16S rDNA基因V3—V4區(qū)序列進(jìn)行分析，研究其細(xì)菌物種和群落結(jié)構(gòu)，圖4 為不同輪次堆積發(fā)酵酒醅樣本在門水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成。

圖4 門水平的主要細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)

門水平上7 個(gè)輪次堆積酒醅中依次檢測(cè)出10個(gè)、10 個(gè)、19 個(gè)、12 個(gè)、15 個(gè)、14 個(gè)和19 個(gè)細(xì)菌門，共32個(gè)。

7 個(gè)輪次共有的細(xì)菌門為Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Cyanobacteria和Chloroflexi，各輪次中，這些門的總占比在98 %以上。各輪次優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為Firmicutes（13.4 %～96.8%）、Proteobacteria（2.7%～75.8%）、Actinobacteria（0.2 %～24.0 %），各輪次中，這些門的總占比在97%以上。其中，F(xiàn)irmicutes在下沙、造沙、一輪、四輪中相對(duì)豐度均高于50%，是7 個(gè)輪次堆積酒醅樣品中平均相對(duì)豐度（54.8 %）最高的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門；Proteobacteria 平均相對(duì)豐度（37.9 %）次之，在二輪、三輪、五輪中的相對(duì)豐度均高于50 %；Actinobacteria 平均相對(duì)豐度為7.36 %，在三輪中的相對(duì)豐度為23.96%。

王歡等[4]從醬香白酒機(jī)械化釀造1～7 輪次堆積發(fā)酵酒醅中檢出14 個(gè)細(xì)菌門類，結(jié)果顯示，Proteobacteria、Actinobacteria 和Firmicutes 為酒醅樣本中的優(yōu)勢(shì)菌門；任愛容等從茅臺(tái)鎮(zhèn)主釀區(qū)大曲樣本中檢測(cè)出21 個(gè)門，優(yōu)勢(shì)菌門分別是Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria 和Bacteroidetes；郭敏等[7]對(duì)醬香大曲制曲微生態(tài)多樣性進(jìn)行了研究，從曲胚中共檢出9 個(gè)細(xì)菌門，優(yōu)勢(shì)菌門主要為Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria。此外，F(xiàn)irmicutes 和Proteobacteria也被發(fā)現(xiàn)是是醬香及芝麻香型白酒釀造過(guò)程中的主要細(xì)菌門，說(shuō)明這2 個(gè)菌門種群是中國(guó)白酒發(fā)酵過(guò)程中的關(guān)鍵微生物[4]。

在細(xì)菌屬水平上，醬香型白酒7 個(gè)輪次堆積酒醅中依次檢出80個(gè)、204個(gè)、153個(gè)、204個(gè)、170、196個(gè)和258 個(gè)細(xì)菌屬，共檢測(cè)出706 個(gè)不同的細(xì)菌屬。相對(duì)豐度≥1%的細(xì)菌屬在7 個(gè)輪次中的分布數(shù)量依次為5、7、8、8、15、10、13，為各輪次堆積發(fā)酵酒醅中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，表征了各釀造輪次堆積發(fā)酵酒醅細(xì)菌結(jié)構(gòu)的特征。

7 個(gè)輪次共有的細(xì)菌屬為L(zhǎng)actobacillus、Acetobacter、Kroppenstedtia、Bacillus、Weissella、Acinetobacter、Pseudomonas、Pediococcus、Staphylococcus、Thermoactinomyces、Saccharopolyspora，在 各 輪 次中，這些屬的總占比為50.1%～98.1%。其中，Lactobacillus（2.0 %～63.7 %）和Acetobacter（1.8 %～58.9%）是7 個(gè)輪次中的共有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，Lactobacillus在下沙、糙沙、一輪中相對(duì)豐度為39.3 %～63.7 %，是7 個(gè)輪次樣品中平均相對(duì)豐度（23.2 %）最高的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬；Acetobacter平均相對(duì)豐度22.1 %次之，在造沙、一輪、二輪、三輪中的相對(duì)豐度為15.9 %～58.9 %；Kroppenstedtia（1.5 %～22.6%）、Bacillus（1.2%～13.9%）和Staphylococcus（1.0 %～10.0 %）是至少4 個(gè)輪次中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，Kroppenstedtia在四輪中的相對(duì)豐度為22.6 %；Bacillus在下沙、四輪、五輪中的相對(duì)豐度均大于10 %，Staphylococcus在四輪中的相對(duì)豐度為10.0%。另外，Weissella在下沙輪次的相對(duì)豐度為33.7 %；Virgibacillus在四輪的相對(duì)豐度為29.1 %；Arthrobacters在三輪的相對(duì)豐度為17.8%；Acinetobacter在五輪的相對(duì)豐度為23.9 %；Pseudomonas在五輪的相對(duì)豐度為15.5%；Pediococcus在下沙輪的相對(duì)豐度為13.1%。

胡小霞等[5]基于高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)醬香型白酒堆積發(fā)酵過(guò)程優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬有Lactobacillus等13 個(gè)，其中Lactobacillus、Escherichia-Shigella和Virgibacillus占主導(dǎo)地位；張春林等[6]采用高通量測(cè)序技術(shù)分析醬香型白酒二輪次堆積發(fā)酵酒醅，共檢測(cè)出125個(gè)細(xì)菌屬，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌包括Bacillus、Lactobacillus、Oceanobacillus、Thermoactinomyces、Virgibacillus、Pediococcus等；郭敏[7]基于高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)醬香大曲中Kroppenstedtia、Oceanobacillus是其主要菌屬。

圖5 屬水平的主要細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)

通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)7 個(gè)輪次的共有細(xì)菌屬總含量在各輪次中占50%以上。由表2 可知，7 個(gè)輪次堆積發(fā)酵酒醅中的特有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為1～7 個(gè)屬類，第4 輪次堆積發(fā)酵酒醅中的特有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬類最多，為7 類，分別是Tuberibacillus、Cronobacter、Cerasibacillus、Anaerosalibacter、Aeribacillus、Geomicrobium、Caldibacillus，下沙輪次僅有Cellulosimicrobium。

表2 各輪次特有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬

結(jié)論表明，扳倒井各輪次醬香堆積發(fā)酵酒醅中的細(xì)菌群落在屬水平上種類豐富，是醬香白酒復(fù)雜風(fēng)味結(jié)構(gòu)形成的關(guān)鍵所在。各輪次堆積發(fā)酵酒醅微生物菌群結(jié)構(gòu)多樣性特征明顯，且各輪次堆積發(fā)酵酒醅的細(xì)菌屬結(jié)構(gòu)組成特征差異性大于共性，這也是不同釀造輪次的特征所在。

3 結(jié)論

對(duì)國(guó)井不同輪次醬香堆積發(fā)酵酒醅中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性及其特征進(jìn)行了系統(tǒng)研究。從7 個(gè)生產(chǎn)輪次的堆積發(fā)酵酒醅中共檢測(cè)出32 個(gè)細(xì)菌門，706 個(gè)細(xì)菌屬。優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為Firmicutes、Proteobacteria 和Actinobacteria；優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為L(zhǎng)actoba-cillus、Acetobacter、Kroppenstedtia和Bacillus。本研究進(jìn)一步揭示了扳倒井不同輪次醬香堆積發(fā)酵酒醅中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性及特征，為解析扳倒井醬香型白酒堆積發(fā)酵酒醅中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)及醬香型白酒高品質(zhì)釀造機(jī)制提供了一定的科學(xué)依據(jù)。