李洪梅， 姜恩平，裴軼勁，孫艷芹，尹金寶

（廣東醫(yī)科大學(xué)1. 病理學(xué)系2. 生理學(xué)教研室，廣東 東莞 523808）

陽(yáng)離子脂質(zhì)體是被公認(rèn)的有研發(fā)前景的基因傳遞載體。其結(jié)構(gòu)可分為三部分，即帶正電荷的陽(yáng)離子頭部、連接鍵和疏水尾部[1]，其介導(dǎo)核酸（本文以質(zhì)粒DNA 為例）進(jìn)入細(xì)胞的過程主要分為以下三步：1）陽(yáng)離子脂質(zhì)體帶正電荷的頭部與帶負(fù)電荷的質(zhì)粒DNA 通過靜電作用結(jié)合，形成脂質(zhì)體-DNA 復(fù)合物[2]。其中質(zhì)粒DNA 因被包裹在復(fù)合物內(nèi)部而受到保護(hù)，其所帶負(fù)電荷被屏蔽，而陽(yáng)離子分布在復(fù)合物表面，故所形成的復(fù)合物表面帶正電荷[3]。2）表面帶正電荷的陽(yáng)離子脂質(zhì)體-DNA 復(fù)合物通過靜電作用吸附于表面帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜表面[3]，繼之復(fù)合物被內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。隨后DNA 被釋放至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)[4]。3）極少一部分被釋放的DNA 可進(jìn)入細(xì)胞核，得以轉(zhuǎn)錄表達(dá)[4-5]?；谏鲜鲫?yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)核酸進(jìn)入細(xì)胞的過程，本文從六個(gè)方面對(duì)某些學(xué)者及筆者自身優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件的經(jīng)驗(yàn)加以總結(jié)。

1 靶細(xì)胞的類型、狀態(tài)及密度

靶細(xì)胞的類型不同，應(yīng)用同種轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染的效率也會(huì)有所不同[4]。轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞應(yīng)處于單層、生長(zhǎng)旺盛的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。細(xì)胞傳代次數(shù)不宜過多，一般復(fù)蘇后傳至第2 或第3代即應(yīng)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；復(fù)蘇但尚未傳代的細(xì)胞，一般不應(yīng)使用，轉(zhuǎn)染效率會(huì)很低。另外，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的融合度一般以60% ～85% 為宜。

2 陽(yáng)離子脂質(zhì)體與核酸的比例

為提高轉(zhuǎn)染效率，陽(yáng)離子脂質(zhì)體與核酸的比例應(yīng)盡可能符合最佳電荷比[6-7]。陽(yáng)離子脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA 的電荷比越高，毒性越強(qiáng)[8]。若質(zhì)粒DNA 的用量過多，將造成陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，或質(zhì)粒DNA 在所形成的脂質(zhì)體-DNA 復(fù)合物中不能很好地被包裹和保護(hù)，或產(chǎn)生過強(qiáng)的毒性，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低下[5,9]；在陽(yáng)離子脂質(zhì)體的濃度超過一定范圍后，濃度越高，毒性也將越強(qiáng)，轉(zhuǎn)染效率也將大幅度下降。

3 核酸的純度

鹽離子、蛋白、多糖和內(nèi)毒素存在于質(zhì)粒DNA 溶液中均會(huì)影響脂質(zhì)體-DNA 復(fù)合物的形成效率，并會(huì)帶給細(xì)胞較強(qiáng)的毒性，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)染效率，降低細(xì)胞存活率[10]。故制備質(zhì)粒時(shí)，應(yīng)盡可能提高純度。

4 時(shí)間

若想確保轉(zhuǎn)染成功，需要注意優(yōu)化以下時(shí)間：1）陽(yáng)離子脂質(zhì)體- 質(zhì)粒DNA 復(fù)合物形成時(shí)間。若上述形成時(shí)間過短，將影響轉(zhuǎn)染效率[8]。2）轉(zhuǎn)染時(shí)的孵育時(shí)間。在一定的時(shí)間范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率會(huì)隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而升高。若孵育時(shí)間過短，脂質(zhì)體-DNA 復(fù)合物尚未充分通過細(xì)胞膜，轉(zhuǎn)染效率將會(huì)很低；若孵育時(shí)間過長(zhǎng)，脂質(zhì)體、質(zhì)粒DNA 或其中所混有的某些物質(zhì)就會(huì)對(duì)細(xì)胞造成毒性，從而影響轉(zhuǎn)染效率。3）檢測(cè)轉(zhuǎn)染是否成功的時(shí)間。若檢測(cè)時(shí)間過早，轉(zhuǎn)染的核酸可能尚未表達(dá)或表達(dá)量過?。ㄟM(jìn)入胞漿中的質(zhì)粒DNA，其僅約有1/1000 的幾率能進(jìn)入細(xì)胞核[5]）。

5 血清

在應(yīng)用某些陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（例如Lipofectamine）進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的過程中，血清的存在會(huì)降低稀釋脂質(zhì)體或質(zhì)粒DNA、脂質(zhì)體-DNA 復(fù)合物形成及轉(zhuǎn)染時(shí)孵育的效率[11-12]。

6 抗生素

在培養(yǎng)細(xì)胞的過程中，為防止污染，常會(huì)添加抗生素。但抗生素的存在有時(shí)也會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率。有學(xué)者指出，應(yīng)用Lipofectamine 等轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的過程中，在轉(zhuǎn)染前細(xì)胞鋪板時(shí)、稀釋轉(zhuǎn)染試劑或質(zhì)粒DNA 時(shí)及進(jìn)行轉(zhuǎn)染孵育時(shí)，均應(yīng)盡量避免使用抗生素。

7 結(jié)語(yǔ)

總之，為了獲得良好的轉(zhuǎn)染效率，需要綜合考慮各種可能影響轉(zhuǎn)染效率的因素并加以優(yōu)化。當(dāng)然，嚴(yán)格的無菌操作是成功轉(zhuǎn)染所必不可少的先決條件。