呂 鑫，王宇慧，劉全蘭

(青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院，山東青島 266042)

在農(nóng)業(yè)上，幾百年前就有植物接種有益微生物的記錄。隨著科學(xué)的發(fā)展，這些有益微生物被稱為植物促生菌，即PGPB(plant growth promoting bacteria)，它們被界定為在一定條件下有利于植物生長的自由生活在土壤、根際、根表、葉際的細(xì)菌[1]。植物促生菌促進(jìn)植物生長是以微生物的代謝潛力為基礎(chǔ)，代謝產(chǎn)物包含能夠產(chǎn)生直接促進(jìn)植物生長的植物激素[2]，或者通過產(chǎn)生抗生素、誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性、分泌溶菌酶等生物防控手段，減少各種病原菌對(duì)植物生長和發(fā)育的抑制效應(yīng)等方式間接促進(jìn)植物生長[3]。植物促生菌多以合成微生物群落的方式作為一種植物生長調(diào)節(jié)劑，更好地適應(yīng)植物、土壤、病害等生物和非生物因素，它們在代謝上分工協(xié)作，催化更為復(fù)雜的反應(yīng)以促進(jìn)植物生長[4-5]。目前，已鑒定出多種植物促生菌菌株，其中主要種類包括芽孢桿菌屬(Bacillus)和假單孢菌屬(Pseudomonas)。該研究挑選了在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用的固氮菌如芽孢桿菌、根瘤菌和乳酸菌如戊糖片球菌、植物乳桿菌等菌株，可以顯著提升種子的萌發(fā)率，并提高農(nóng)作物的產(chǎn)量[6]。

“十四五”規(guī)劃明確指出，要圍繞種業(yè)振興重點(diǎn)任務(wù)，聚焦資源保護(hù)、育種創(chuàng)新、測試評(píng)價(jià)和良種繁育四大環(huán)節(jié)。在蔬菜、花卉和一些大田作物中，種子預(yù)處理是一種有用且被推薦的做法，這有助于保護(hù)種質(zhì)資源，提高種子發(fā)芽率、幼苗活力和產(chǎn)量[7-9]。隨著生活質(zhì)量的提高，食品安全問題受到人們廣泛的關(guān)注，綠色無公害蔬菜生產(chǎn)成為蔬菜栽培技術(shù)推廣的重要部分，培育綠色無公害種苗也成為蔬菜栽培中的重要技術(shù)。采用植物促生菌處理植物種子是一種被倡導(dǎo)的種苗培育措施。植物促生菌可在種苗和其栽培土壤中定殖，調(diào)節(jié)植物生長，增強(qiáng)植物抗性，抑制病原菌生長，培育綠色無公害抗病種苗。

黃瓜(Cucumissativus)又稱胡瓜、青瓜，是葫蘆科黃瓜屬草本植物，在我國多地區(qū)廣泛種植[10]。黃瓜種子在種植過程中經(jīng)常面臨發(fā)芽率低、長勢不一致等問題。筆者采用植物促生菌合成的微生物群落處理黃瓜種子以提高種子萌發(fā)率，旨在篩選出對(duì)黃瓜種子萌發(fā)生長最具有促進(jìn)作用的微生物群落組合，以助力黃瓜育苗的生產(chǎn)需要[11-12]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料選自由山東魯壽種業(yè)有限公司提供且在當(dāng)?shù)貜V泛種植的黃瓜種子。供試植物促生菌分別為蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)、戊糖片球菌(pentosaceus)、腸桿菌(Enterobactersoli)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、根瘤菌(Rhizobium)。以上供試菌株由青島科技大學(xué)劉全蘭老師課題組提供。這些菌株形成3種合成微生物群落的組合，組合一包括蘇云金芽孢桿菌、戊糖片球菌、腸桿菌，組合二包括植物乳桿菌、戊糖片球菌、腸桿菌，單一菌三只有根瘤菌。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1菌懸液的制備。將蘇云金芽孢桿菌、腸桿菌、根瘤菌分別接種在YMA液體培養(yǎng)基上，戊糖片球菌、植物乳桿菌分別接種在MRS液體培養(yǎng)基上35 ℃振蕩培養(yǎng)12 h后，以8 000 r/min 離心8 min后，倒掉上清液并收集菌體，用無菌水將菌體稀釋至OD600=2.5×108CFU/mL，再用無菌水稀釋10倍。將稀釋后的菌懸液以相同比例混合成組合一、組合二和單一菌三。

1.2.2種子催芽處理。挑選籽粒飽滿的“511”“518”“519”3個(gè)品種黃瓜種子各480粒并分成4份分別放入培養(yǎng)皿中。將每個(gè)品種的黃瓜分別用稀釋后的組合一、組合二、單一菌三在培養(yǎng)皿中浸泡40 min，空白用清水浸泡。浸泡完成后用紗布包裹并放回培養(yǎng)皿中，紗布保持表面濕潤。最后將培養(yǎng)皿統(tǒng)一放入托盤內(nèi)。用薄膜將托盤封閉保濕后，放入組培箱內(nèi)，28 ℃黑暗條件下催芽24 h。

1.2.3種子移栽。在育苗穴盤內(nèi)鋪上一層營養(yǎng)土，24 h后將初步萌發(fā)的黃瓜種子從培養(yǎng)皿中取出，不同處理的黃瓜芽分別撒在育苗穴盤的營養(yǎng)土上，再鋪上一層營養(yǎng)土使種子被營養(yǎng)土覆蓋，澆適量的水，使?fàn)I養(yǎng)土濕潤。每個(gè)穴盤種植40粒黃瓜種子，重復(fù)3次，每天記錄種子發(fā)芽數(shù)量并計(jì)算其發(fā)芽率。

發(fā)芽率=發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

1.3 數(shù)據(jù)分析利用SPSS 26軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析、顯著檢驗(yàn)并用Origin 2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物促生菌對(duì)“511”萌發(fā)的影響從圖1可以看出，黃瓜種子種植3 d后普遍萌發(fā)，其中組合二和單一菌三處理過的黃瓜種子萌發(fā)率一直比空白高。組合二、單一菌三處理組的黃瓜種子在5 d后萌發(fā)率接近平穩(wěn)；組合一的黃瓜種子一直處于持續(xù)增長狀態(tài)。萌發(fā)率最高的為組合二處理，最終萌發(fā)率為96.67%;其次是單一菌三，為91.67%；組合一為90.83%；空白為84.17%。萌發(fā)率組合二比空白提高了12.5百分點(diǎn)，效果最顯著。

圖1 “511”黃瓜品種萌發(fā)率

2.2 植物促生菌對(duì)“518”萌發(fā)的影響從圖2可以看出，植物促生菌對(duì)“518”品種的黃瓜種子萌發(fā)率隨時(shí)間而不同。3 d時(shí)，空白萌發(fā)率最高；4 d時(shí)，組合一的萌發(fā)率超過空白；6 d后組合二超過空白；8 d后，單一菌三處理超過空白；最終3個(gè)處理組的萌發(fā)率都比空白高。空白、組合一、單一菌三的黃瓜種子在5 d后萌發(fā)率接近平穩(wěn)，組合二在6 d后萌發(fā)率接近平穩(wěn)。萌發(fā)率最高的為組合二，最終萌發(fā)率為89.17%；其次是組合一，為88.33%；單一菌三為84.17%；空白為81.67%。組合二萌發(fā)率比空白顯著提升7.5百分點(diǎn)。

圖2 “518”黃瓜品種萌發(fā)率

2.3 植物促生菌對(duì)“519”萌發(fā)的影響從圖3可以看出，最終萌發(fā)率最高的為組合一，萌發(fā)率為86.67%；其次是組合二，為85.83%；空白為85.00%；單一菌三為84.17%。對(duì)“519”黃瓜品種萌發(fā)率提升最高的為組合一，萌發(fā)率比空白提升1.67百分點(diǎn)，提升效果不顯著。“519”品種用菌液處理后，組合一和組合二的黃瓜種子萌發(fā)率比空白稍高，單一菌三的萌發(fā)率比空白低，總體來看萌發(fā)率未顯著提升(P>0.05)，這3個(gè)處理對(duì)“519”品種的萌發(fā)率沒有明顯的提升作用。

圖3 “519”黃瓜品種萌發(fā)率

3 結(jié)論與討論

目前對(duì)植物促生菌的研究集中在促進(jìn)植物生長和抑制或減輕某些植物病害對(duì)植物生長發(fā)育和產(chǎn)量的不良影響上，對(duì)提高種子萌發(fā)率的研究相對(duì)較少。該研究通過構(gòu)建合成微生物群落探究了不同組合處理對(duì)黃瓜種子萌發(fā)的影響。確定了不同黃瓜品種種子萌發(fā)所需的最優(yōu)植物促生菌不同，組合二對(duì)“511”和“518”黃瓜品種種子萌發(fā)率的提升最大，分別提升12.5和7.5百分點(diǎn)，組合一對(duì)“519”品種黃瓜種子萌發(fā)的提升率高于其他2種組合，為1.67百分點(diǎn)。

種子發(fā)芽是黃瓜生長的第一步，而提高發(fā)芽率是培育良好性狀植株的基礎(chǔ)，直接關(guān)系到黃瓜的產(chǎn)量。該研究發(fā)現(xiàn)，組合一和組合二對(duì)黃瓜種子萌發(fā)的提升最大，可能是因?yàn)檫@2種組合中都含有固氮菌和乳酸菌。目前，固氮菌是研究最深入的植物促生菌。曹毅等[13]發(fā)現(xiàn)用固氮菌菌劑浸種對(duì)刺黃瓜種子出苗率有明顯的提高。乳酸菌是一種廣泛分布的細(xì)菌，占據(jù)不同的生態(tài)位，也被稱為對(duì)人體健康有益的微生物。Limanska等[14]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌可以釋放活性物質(zhì)來促進(jìn)種子萌發(fā)。該研究創(chuàng)新性地將固氮菌與乳酸菌構(gòu)建合成微生物菌落，并應(yīng)用于黃瓜種子萌發(fā)，使黃瓜種子的萌發(fā)率得到了較大的提升。

種子萌發(fā)是一個(gè)復(fù)雜的過程，用植物促生菌處理黃瓜種子，對(duì)其萌發(fā)率進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，對(duì)后續(xù)的黃瓜生產(chǎn)具有重要意義，也為植物促生菌的開發(fā)利用提供了新思路。植物促生菌與植物之間的互作關(guān)系復(fù)雜，植物促生菌與植物內(nèi)部的酶活性和激素之間如何互作來調(diào)控種子萌發(fā)的分子機(jī)制，還有待于進(jìn)一步深入研究。