陳燕芳 張建鋒 劉浩飛

(1鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校臨床醫(yī)學(xué)系內(nèi)兒教研室，河南 鄭州 450064；2河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎病科)

2型糖尿病(T2DM)的患病率持續(xù)增長，且經(jīng)常誘發(fā)或者伴發(fā)心血管疾病(CVD)〔1～3〕。與T2DM和CVD相關(guān)的關(guān)鍵事件之一是血管功能障礙的發(fā)展，特別是導(dǎo)致T2DM相關(guān)CVD的血管功能障礙的兩個(gè)組成部分：動(dòng)脈僵硬和內(nèi)皮功能障礙〔4～6〕，因此探究其機(jī)制成為目前的研究熱點(diǎn)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是代謝的重要調(diào)節(jié)器。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的功能障礙，廣義上稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，導(dǎo)致未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)，這是一種旨在恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的適應(yīng)性途徑〔7〕。盡管UPR是抵抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的防線，但UPR有可能在持續(xù)刺激中慢性激活，繼而誘發(fā)細(xì)胞功能障礙〔8,9〕。?；侨パ跄懰?TDCA)已被證明可以緩解與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的心臟代謝疾病〔10,11〕。然而，很少有研究探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在糖尿病內(nèi)皮功能障礙中的作用，本研究探討TDCA對(duì)T2DM小鼠內(nèi)皮功能障礙和動(dòng)脈僵硬度的影響。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象和分組干預(yù) 選取30只體重23～25 g的健康雄性SPF級(jí)C57BL/6J小鼠隨機(jī)平均分為空白對(duì)照(CON)組、模型(MD)組和TDCA干預(yù)(MD+TDCA)組。3組小鼠均飼養(yǎng)在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，光照時(shí)間為12 h，溫度為(25±5)℃，相對(duì)濕度為50%～60%，每天正常進(jìn)食飲水，自由活動(dòng)。每組小鼠具體干預(yù)方法為：(1)CON組用普通飼料喂養(yǎng)。(2)MD組構(gòu)建T2DM小鼠模型，用高熱量飼料喂養(yǎng)小鼠4 w后，靜脈注射濃度為1%的鏈脲佐菌素30 mg/kg溶液(該溶液用0.1 mol/L、pH=4.2的檸檬酸鹽緩沖液配制而成)，在用藥時(shí)間達(dá)到1 w后取空腹小鼠尾部血液測空腹血糖水平，當(dāng)空腹血糖≥16.7 mmol/L時(shí)則判斷為造模成功。在建模過程中，CON組小鼠則通過尾部靜脈注射等量的鏈脈佐菌素溶液。(3)MD+TDCA組中T2DM小鼠模型構(gòu)建方法同MD組，在鏈脲佐菌素用藥1 w后經(jīng)腹腔注射TDCA，劑量為250 mg/(kg·d)，連續(xù)注射4 w，待小鼠長至6個(gè)月時(shí)通過心臟穿刺抽血法將其致死。

1.2觀察指標(biāo)

1.2.1標(biāo)本的制備 首先配制pH=7.4的冰凍生理鹽水〔含0.185 g乙二胺四乙酸(EDTA)〕備用。在小鼠斷頭臺(tái)處用異氟烷將所有小鼠麻醉，通過心臟穿刺抽血法將其致死，液氮速凍。其中頸動(dòng)脈和二級(jí)腸系膜動(dòng)脈均需要在配制好的冰凍生理鹽水中完成切除。

1.2.2血清生化指標(biāo) 各組小鼠均在喂養(yǎng)4 w后稱量體重，然后取尾部靜脈血液，用放射免疫法測定血清胰島素水平；通過生化分析儀測定空腹血糖水平；胰島素抵抗指數(shù)(ISI)計(jì)算公式為：ISI=In〔1/(空腹血糖×空腹血清胰島素)〕。

1.2.3主動(dòng)脈僵硬度 使用脈搏分析系統(tǒng)分析主動(dòng)脈僵硬程度，指標(biāo)包括主動(dòng)脈脈搏波速度(aPWV)、主動(dòng)脈膨脹度和主動(dòng)脈脈搏波增強(qiáng)指數(shù)。具體操作步驟如下：用濃度為2%的異氟烷將小鼠麻醉后將其仰臥置于加熱板上，用心電圖電極將小鼠腿部完全固定，隨時(shí)監(jiān)測小鼠的心率處于450次/min左右，并根據(jù)心率大小調(diào)整異氟烷濃度。采用多普勒探針完成上述各指標(biāo)的測定，其中aPWV=探頭間距離(cm)/時(shí)間差(胸部和腹部預(yù)注射間，s)。

1.2.4血管內(nèi)皮功能 根據(jù)每條動(dòng)脈的最大管腔直徑計(jì)算擴(kuò)張百分比，指標(biāo)包括肱動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能(EDD)和肱動(dòng)脈非內(nèi)皮依賴性舒張功能(EID)。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) Trizol(Life Technologies公司，美國)分離主動(dòng)脈和PVAT RNA。用iScript(Bio-Rad,Hercules公司，美國)從0.25 μg/μl RNA中合成cDNA，反應(yīng)20 μl。使用icycle和iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad,Hercules公司，美國)進(jìn)行兩步擴(kuò)增(95℃ 10 s，60℃退火30 s)，共40個(gè)循環(huán)。采用數(shù)據(jù)歸一化法計(jì)算mRNA相關(guān)基因的表達(dá)水平，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)上游引物：5′-CGGTCGCTTCAGTCGTCAG-3′，下游：5′-ATGTTCGGCTTCCCATTCTCC-3′；GAPDH上游引物：5′-ACAGTCGAGATGGGATACCCTTACCATTACT-3′，下游：5′-CTGCTGACGTCGAGTGGGC-AA-3′。

1.2.6eNOS蛋白表達(dá)水平測定 從小鼠主動(dòng)脈中提取總蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)法測定eNOS蛋白表達(dá)水平，取30 μg蛋白置于聚丙烯酰胺凝膠上完成電泳實(shí)驗(yàn)，然后經(jīng)過電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在常溫下將封閉1 h，然后在4℃的(1∶200)一抗中培養(yǎng)過夜。用TRIS-BU在鹽水中清洗0.1%的Twin-20，與二級(jí)抗體(1∶500)在室溫下孵育1 h，然后通過成像儀檢測光密度，通過Western印跡對(duì)比分析各條帶的灰度值，分析eNOS蛋白表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組胸主動(dòng)脈形態(tài)學(xué) CON組主動(dòng)脈組織完整且內(nèi)膜光滑，不存在缺損的現(xiàn)象，并且中膜層的平滑肌細(xì)胞排列有序，染色后顯而易見，不存在增生的現(xiàn)象。與CON組相比，MD組主動(dòng)脈組織受損嚴(yán)重，尤其是內(nèi)膜更為顯著，內(nèi)皮細(xì)胞體積增大，中膜層的平滑肌細(xì)胞排列無序。MD+TDCA組主動(dòng)脈組織的各層細(xì)胞的排列較MD組整齊，且組織受損情況得到了有效緩解。見圖1。

2.2各組體重、空腹血糖、空腹血清胰島素水平和ISI測定 CON組體重和ISI值高于MD組，空腹血糖和空腹血清胰島素則低于MD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而MD+TDCA組與CON組比較，體重及空腹血清胰島素水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，空腹血糖升高、ISI降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.3各組反映主動(dòng)脈僵硬度指標(biāo)比較 CON組主動(dòng)脈脈搏波增強(qiáng)指數(shù)和aPWV介于MD組和MD+TDCA組之間，主動(dòng)脈膨脹度則顯著低于MD組和MD+TDCA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MD組主動(dòng)脈膨脹度、主動(dòng)脈搏動(dòng)增強(qiáng)指數(shù)和aPWV均高于MD+TDCA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.4各組血管內(nèi)皮功能評(píng)估結(jié)果 CON組EDD〔(23.23±2.41)%〕小于MD組〔(35.12±2.13)%〕和MD+TDCA組〔(26.61±3.04)%〕，EID〔(26.42±7.11)%〕高于MD組〔(22.69±3.32)%〕和MD+TDCA組〔(23.35±6.60)%〕，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而MD組EDD顯著高于MD+TDCA組，EID顯著低于MD+TDCA組(P<0.05)。

2.5實(shí)時(shí)熒光定量-PCR CON組的eNOS mRNA表達(dá)水平(1.15±0.22)顯著高于MD組(0.53±0.05)和MD+TDCA組(1.01±0.03，P<0.05)。MD組eNOS mRNA 表達(dá)水平顯著低于MD+TDCA組(P<0.05)。見圖2。

2.6Western印跡檢測eNOS蛋白水平 CON組eNOS蛋白表達(dá)水平(1.02±0.16)顯著高于MD組(0.53±0.06)和MD+TDCA組(0.92±0.20，P<0.05)。MD組eNOS蛋白水平顯著低于MD+TDCA組(P<0.05)。見圖3。

3 討 論

有報(bào)道表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能是T2DM相關(guān)血管功能障礙的治療靶點(diǎn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激已經(jīng)成為肥胖和T2DM模型中代謝紊亂的新中介〔12～14〕。本研究結(jié)果顯示，相對(duì)于MD組主動(dòng)脈組織及內(nèi)膜受損較為嚴(yán)重，MD+TDCA組的主動(dòng)脈組織受損情況已獲得有效緩解。有研究也報(bào)道了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與TDCA之間的關(guān)系〔15～17〕，原因主要考慮是與TDCA的應(yīng)用產(chǎn)生了較好的干預(yù)效果有關(guān)〔18～20〕。TDCA可較好地對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生一定的抑制效果，其主要可能是通過對(duì)于T2DM小鼠機(jī)體內(nèi)的微炎癥反應(yīng)及胰島素相關(guān)信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白進(jìn)行活化影響而發(fā)揮作用〔21～23〕。同時(shí)，其優(yōu)化了小鼠機(jī)體的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，并對(duì)血管內(nèi)皮產(chǎn)生較好的改善作用，因此MD+TDCA組的主動(dòng)脈組織及內(nèi)膜均獲得了較好的修復(fù)緩解〔24～26〕。有報(bào)道證實(shí)，高脂飲食誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙和主動(dòng)脈內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激均可被TDCA給藥逆轉(zhuǎn)〔27～29〕。同時(shí)，本研究結(jié)果表明，MD+TDCA組的血糖控制水平及胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)得到明顯優(yōu)化，且主動(dòng)脈僵硬度及血管內(nèi)皮功能亦獲得了較好的緩解。究其原因，TDCA可有效抑制T2DM小鼠機(jī)體肝臟及脂肪組織中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并能改善其機(jī)體內(nèi)的葡萄糖耐受〔30～32〕。同時(shí)，TDCA能減少高胰島素血癥的發(fā)生概率，強(qiáng)化機(jī)體針對(duì)胰島素產(chǎn)生的敏感性，進(jìn)而優(yōu)化機(jī)體內(nèi)的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，并能夠抑制c-Jun氨基末端激酶等相關(guān)炎癥激酶的活化，從而使血管內(nèi)皮功能得到明顯地改善〔33～35〕。T2DM模型小鼠的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞存在廣泛的血管功能障礙，而TDCA可降低T2DM模型小鼠的動(dòng)脈僵硬度，這與本文的研究結(jié)論基本相符。此外，Dell′Aglio等〔36〕、Ni等〔37〕也有類似的報(bào)道可加以佐證。

綜上，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能是T2DM相關(guān)血管功能障礙的新原因和治療靶點(diǎn)，TDCA對(duì)T2DM小鼠的主動(dòng)脈僵硬度及內(nèi)皮功能障礙具有較好的改善效果。