吳 婕，張英杰，周華君，成 軍（.蚌埠醫(yī)學院檢驗醫(yī)學院，安徽蚌埠 33000；.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇三醫(yī)院，杭州 3003）

在全球范圍內，慢性乙型肝炎感染者約有2.57億人[1]，每年死于乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染及其相關性疾病的約有88.7 萬人，我國屬于HBV 中高度流行區(qū)。乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBsAg）作為HBV感染者血清中率先出現的病毒蛋白標志物，國內外專家一致認為：當患者血清HBsAg 完全清除或出現血清學轉換即為慢性HBV感染理想的治療終點[2]。慢性HBV感染者中存在著一部分血清持續(xù)低水平HBsAg表達人群（經1年以上隨訪，血清HBsAg 檢測3 次以上，每次采樣間隔3 個月以上且檢測結果均在10.0 IU/ml 以下，呈持續(xù)低水平表達的一類慢性HBV感染者），其可能與病毒的清除、變異及隱匿性HBV感染密切相關。血清低水平的HBsAg 常反映出宿主對HBV 復制及細胞再感染具有較好的免疫抑制能力[3]，然而持續(xù)低水平的HBsAg 可能無法刺激機體產生免疫應答或低應答，長期的無應答或低應答狀態(tài)可能導致宿主針對持續(xù)低水平HBsAg表達形成免疫耐受，從而無法實現完全清除HBV?，F就近年來國內外血清持續(xù)低水平HBsAg表達的慢性HBV感染者其免疫耐受機制的研究進展進行綜述。

1 低水平HBsAg與免疫耐受

1.1 低水平HBsAg定義 有報道[4]使用酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）定義定量檢測血清HBsAg ＜50.0 IU/ml 為低水平HBsAg，但有研究顯示ELISA 檢測低水平HBsAg存在漏檢情況[5]。由于檢測方法、高靈敏度試劑盒的陸續(xù)開發(fā)，關于低水平HBsAg的定義不斷更新，然而根據研究內容的差異，實驗室對高水平HBsAg和低水平HBsAg 也有不同的分組標準。如劉立等[6]對低水平HBsAg 患者的肝臟組織病理變化的研究中，選用HBsAg 在0.05～1 400 IU/ml 為低水平組。熊洪海等[7]對干擾素聯合核苷類藥物治療HBV的研究中，定義HBsAg 定量低于4 000 ng/ml 為低水平組。JIN 等[8]在評估HBsAg/抗-HBs 共存的血清學模式與慢性HBV感染者肝細胞癌發(fā)生風險之間的關系中，將血清HBsAg水平＜1 000 IU/ml的樣本視為低水平組。而本實驗室采用化學發(fā)光微粒子免疫分析法代替?zhèn)鹘y的ELISA 定量檢測血清HBsAg，一般認為血清HBsAg 含量＜5.0 ng/ml 或＜10.0 IU/ml 為低水平HBsAg[9]，相較以往研究對低水平HBsAg 陽性的檢出率明顯提高，而低水平HBsAg 檢出是否存在假陽性，必要時可對其進行確認試驗，以保證實驗結果的準確度。

1.2 持續(xù)低水平HBsAg表達免疫耐受 血清持續(xù)低水平HBsAg表達的形成機制可能與多種因素有關，如基因突變致使病毒逃避免疫監(jiān)視（S 基因突變[10],Pre-S 基因突變[11],C 基因突變[12]），表觀遺傳學的改變導致HBsAg表達減少（HBV DNA 高度甲基化[13],microRNA 反饋機制[14],組蛋白低乙?；痆15]），宿主免疫系統功能紊亂形成免疫耐受（免疫因子IL-6,IL-10 等）[16-17]及循環(huán)免疫復合物（circulating immune complex,CIC）形成[18]等。血清持續(xù)低水平HBsAg表達為病毒與宿主清除在多種因素作用下，達到一種相對穩(wěn)定而復雜的動態(tài)平衡狀態(tài)[19]，其中HBV 免疫耐受研究被認為是持續(xù)低水平HBsAg 形成的關鍵因素，已成為持續(xù)低水平HBsAg表達形成機制研究的熱點和HBV 治療突破口。截至目前，臨床上針對HBV 治療不斷嘗試多種途徑來打破免疫耐受，從而激活免疫應答：如聯合核苷類藥物和干擾素提高HBsAg 轉陰率[7]，調控細胞因子（IFN-γ,IL-4 等）濃度進行非特異性免疫調節(jié)治療[20]，運用抗HBV 治療性疫苗進行特異性免疫治療[21]等，但效果卻差強人意。因此，深入研究持續(xù)低水平HBsAg表達免疫耐受的形成機制，將為HBV 臨床治療提供新思路。

2 持續(xù)低水平HBsAg表達免疫耐受形成機制

2.1 病毒自身適應性變異與免疫逃逸 HBV 屬嗜肝DNA 病毒科，由于病毒基因組特殊的共價閉合環(huán)狀DNA 結構，致使現有的治療策略仍無法徹底根除HBV[22]，只要有少量DNA 殘留即可作為模板進行病毒復制，極易引起HBV 復發(fā)。慢性HBV感染者體內存在大量的HBV 顆粒和病毒蛋白，病毒蛋白和免疫系統之間能發(fā)生多種相互作用，有研究表明[23]，HBV 通過RNA 中間體完成復制，其過程易出錯，導致迅速產生密切相關但不完全相同的病毒變異株，包括可以逃脫宿主免疫應答和抗病毒治療的病毒變異株。HBsAg 由單個開放閱讀框(open reading frame,ORF)編碼，該閱讀框被Pre-S1,Pre-S2和S 區(qū)域中的三個框內起始密碼子分開[24]，張凱等[25]研究發(fā)現Pre-S2 缺失突變使病毒缺失免疫反應相關表位，影響T 細胞對抗原的識別，病毒逃避宿主免疫監(jiān)視，使其在體內呈現低水平復制；另外，HBV 變異株的基因組中易發(fā)生大量缺失突變可以進一步增加慢性HBV感染的復雜性，并且HBV 有完整的蛋白質外殼及很強的自我保護能力，一般藥物難以清除，而且HBV 由于免疫逃逸產生變異，當藥物持續(xù)作用于特定部位，導致該部位堿基發(fā)生改變，極易產生耐藥性，進而使原有針對HBV 治療的敏感藥物失效。KIRDAR 等[26]研究發(fā)現，部分接受核苷/核苷酸類似物治療的慢性HBV感染者，HBV pol/S 基因產生耐藥性突變，這種HBV自身適應性變異可能使病毒發(fā)生免疫逃逸，形成免疫耐受。

2.2 病毒感染靶細胞 HBV 主要在肝細胞內完成復制，如果要徹底抑制HBV 復制，藥物需進入肝細胞內才能發(fā)揮作用。肝臟誘導免疫耐受的功能具有獨特性[27]，呈現持續(xù)性表達的抗原常會誘導肝臟針對該抗原產生局部或全身性的免疫耐受而非免疫應答。肝臟的生理結構、細胞組成等特性為肝臟誘導免疫耐受提供時間、空間基礎，從而通過誘導T 細胞克隆清除、克隆無能、免疫偏離及誘導免疫負調控細胞等多種機制實現系統性免疫耐受[28-29]，同時HBV 利用肝臟的免疫耐受環(huán)境，可能導致病毒持續(xù)感染和癌癥快速發(fā)展[30]。也有研究結果表明適應性免疫細胞在肝臟中比其他器官更易耐受[31]，且適應性免疫反應與肝耐受性微環(huán)境之間存在關系[32]。這種具有耐受力的微環(huán)境會導致肝臟T 細胞功能障礙，包括克隆缺失、無反應、衰老、偏離和衰竭[30]。肝臟擁有大量的肝細胞、非實質細胞和淋巴細胞，這些細胞之間復雜的相互作用有助于在肝臟中誘導適應性免疫耐受[33]。還有報道[34]稱肝外組織如腎、脾、胰等檢測發(fā)現HBV DNA，這些部位因無法引起有效的免疫應答，逃避宿主免疫性清除，導致病毒反復被釋放，形成肝外病毒儲存庫，反復感染肝細胞而致慢性化感染。

2.3 宿主免疫

2.3.1 樹突狀細胞（DC）介導：DC 作為一種抗原呈遞細胞(antigen-presenting cells,APC)，能攝取、加工、處理HBsAg，并分泌多種細胞因子參與慢性HBV感染者免疫耐受和免疫應答作用的調節(jié)[35]。同時，肝臟中包含不同的非實質細胞群，這些細胞群也可以作為APC，在效應T 細胞啟動效率低下時，傾向于誘導T 細胞耐受而非T 細胞活化[36]。有報道稱血清較高水平HBsAg的慢性HBV感染者外周血中DC 發(fā)育功能障礙，IFN-α,IL-6 等細胞因子水平均有不同程度的降低[37]，并且有缺陷的DC與CD56-NK 細胞相互作用可能導致抗病毒免疫反應無效，形成免疫耐受[38]。另外，SHAO 等[39]研究表明細胞因子IL-35 調節(jié)慢性HBV感染期間調節(jié)性T 細胞(T-reg)和CD8+T 細胞的功能，這可能有助于免疫耐受和病毒持久性。因此，在慢性HBV感染，DC 功能受損的情況下，低水平HBsAg 乙肝感染者體內病毒可能發(fā)生免疫逃逸，DC 無法成功攝取、加工、處理低水平的HBsAg，致使機體對低水平的HBsAg 無法產生有效的免疫應答，形成免疫耐受[40]。

2.3.2 T/B 淋巴細胞介導：慢性HBV感染與T 細胞耗竭有關[41]，表現為共抑制性受體的持續(xù)表達和細胞因子產生受損，如程序性死亡受體-1（PD-1），自然殺傷細胞受體2B4(CD244)，細胞毒性T 淋巴細胞相關抗原-4（CTLA-4），T 細胞免疫球蛋白和黏蛋白-3（TIM-3），細胞因子CD160 等，血清高水平的HBsAg 可以誘導共抑制性受體上調，多種共抑制性受體的持續(xù)表達維持T 細胞的功能性衰竭。DOLINA 等[42]人發(fā)現，在慢性HBV感染中，通過高遷移率家族蛋白-1（HMGB-1）識別操作的病毒特異性TIM-3+和CD8+T 細胞可能會抑制肝臟微環(huán)境中的T 細胞反應，繼而促進HBV 持續(xù)感染。同時，T-reg 作為CD4+T 細胞的特殊亞群，在HBV感染宿主時，通過分泌多種效應分子如IL-10,TGF-β 等，直接或間接抑制T 細胞反應，從而維持免疫耐受[43]。然而，有研究顯示血清低水平HBsAg 患者較血清高水平HBsAg 患者而言，雖然CD4+T 細胞上能觀察到較低的PD-1表達，但同時報道又指出CD4+T 細胞上的2B4表達沒有明顯差異[44]。所以，低水平HBsAg的慢性HBV感染者呈現非活動性HBsAg 攜帶狀態(tài)，雖然機體內部分共抑制性受體較低，但T 細胞耗竭可能仍然存在，導致T 細胞功能未完全恢復，對低水平HBsAg 不能執(zhí)行正常應答，形成免疫耐受，從而無法完全清除HBV。還有報道[40]指出當大量病毒感染宿主時，如果T 細胞應答不是非常強烈，那么，即使宿主產生抗病毒細胞因子，細胞毒性T 淋巴細胞也不能完全滅活HBV，最終仍會導致病毒呈現持續(xù)感染狀態(tài)。也就是說，在T 細胞應答不全的情況下，低水平HBsAg 可能會逃脫免疫監(jiān)視，致使宿主仍然存在較弱的病毒基因表達，從而HBV 不能被完全清除。另外，與功能障礙和衰竭相關的B 細胞也表達一系列共抑制性受體，包括Fc 受體樣4（FcRL4）,PD-1和PD-L1 等，且血清低水平HBsAg 組和血清高水平HBsAg 組表達的受體無明顯差異，這也可以說明低水平HBsAg乙肝感染者B細胞功能受損，可能形成免疫耐受[44]。所以，綜上所述，低水平的HBsAg 可能誘導宿主T,B 淋巴細胞產生完全或不完全的免疫耐受[45]。

2.3.3 單核細胞/NK 細胞介導：NK 細胞和單核細胞介導的宿主免疫是先天免疫應答過程中的兩個重要環(huán)節(jié)。有研究發(fā)現血清高水平HBsAg 慢性HBV感染者NK細胞功能缺陷，呈現失活狀態(tài)[46]。LI等[47]人觀察到HBV 可通過多種信號通路利用HBsAg 誘導產生抑制性單核細胞，這些抑制性單核細胞表達的人類白細胞抗原-E（HLA-E）和PD-L1 能夠進一步誘導NK 細胞產生IL-10，這樣的NK 細胞能夠抑制宿主自身CD4+和CD8+T 細胞活化，并且HBV 也能通過單核細胞誘導調節(jié)性NK 細胞（NKreg）下調T 細胞的免疫反應，同時有報道證實慢性HBV感染者的NK 細胞可介導免疫耐受或免疫損傷[48]。還有一些研究表明[49-50]：HBsAg 可通過干擾單核細胞/巨噬細胞中的Toll 樣受體（toll-like receptors,TLR）信號途徑來抑制細胞因子的釋放，這可能有助于建立慢性感染。然而，KIM 等[44]人研究顯示血清低水平HBsAg 組和血清高水平HBsAg 組中單核細胞、NK 細胞等免疫細胞的組成無明顯差異，所以，低水平HBsAg 乙肝感染者由于長期的HBV感染可能也會導致單核細胞、NK 細胞功能缺陷，同時血清HBsAg 濃度較低，可能誘使單核細胞及NK 細胞正常的識別、殺傷作用受限，從而無法有效釋放抗病毒性的炎性因子及徹底抑制HBV。

2.4 年齡等其他因素 已有研究發(fā)現[51]：低水平HBsAg的HBV感染者年齡相對較高(＞50 歲)，持續(xù)低水平的HBsAg表達可能與非活動性的HBV 攜帶者狀態(tài)有關，并隨著年齡的增長而發(fā)生。YUEN等[52]也表明HBV 變異與年齡增加及HBsAg水平降低有關，HBV 多樣性的增加可能導致病毒逃避免疫監(jiān)視，形成免疫耐受。此外，ALLAIN 等[53]人研究表明低收入和中等收入國家，由于在資源獲取方面落后于發(fā)達國家，HBV的檢測及診斷技術受限，導致數十年由于醫(yī)療缺乏形成免疫耐受；雖然目前實施HBV 疫苗已降低了HBV的發(fā)病率，但仍會導致該地區(qū)HBV的垂直傳播，所以，這些地區(qū)慢性HBV感染者的低水平HBsAg表達可能更易形成免疫耐受。

3 結論與展望

綜上所述，慢性HBV感染者持續(xù)低水平HBsAg表達免疫耐受形成的原因多樣，可能是在病毒自身適應性變異與免疫逃逸、病毒感染靶細胞、宿主免疫及其他多種因素作用下，導致機體無法完全清除低水平HBsAg。目前，有關如何打破慢性HBV感染者持續(xù)低水平HBsAg表達免疫耐受狀態(tài)的研究報道甚少，但隨著HBV 診療技術不斷發(fā)展，低水平HBsAg 人群愈來愈引起肝病學、傳染病學及流行病學等領域專家的關注。因此，通過研究低水平HBsAg 免疫耐受形成的機制，將為臨床治療中打破其免疫耐受狀態(tài)奠定基礎，從而為實現徹底清除HBV 拓展新思路。