張晗 李興 趙樂 楊挲挲 韓鵬飛

1.黑龍江省牡丹江醫(yī)學院第一臨床醫(yī)學院，黑龍江牡丹江 157011；2.黑龍江省牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院檢驗科，黑龍江牡丹江 157011

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種慢性炎癥性疾病，特征為血管壁進行性增厚，它引起的冠心病、腦卒中和外周血管病等疾病，已成為世界人口死亡的首要原因[1]。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類不具有5′和3′末端閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，高通量測序和生物信息學方法分析發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于真核細胞轉(zhuǎn)錄組中[2]。circRNA CDR1as已被證明參與多種疾病的病理進展，如CDR1as能夠促進肝癌[3-4]、肺癌[5-6]等腫瘤的進展，同時也能夠抑制膀胱癌[7]和卵巢癌[8]等腫瘤的進展。然而CDR1as在AS中的作用尚不清楚。本研究通過檢測AS患者和健康人外周血單個核細胞中CDR1as的差異表達，探討其在AS病理過程中可能發(fā)揮的作用及其對AS的診斷價值，旨在為AS尋找新型分子標志物及潛在的防治靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年9月至2021年1月的牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院的20例AS患者及同期就診的20名健康體檢者作為研究對象。根據(jù)頸動脈超聲檢查結(jié)果是否形成動脈粥樣斑塊，將研究對象分為健康組和AS患者組。健康組20例，其中男9例，女11例；年齡47～64歲，平均（53.75±3.85）。AS患者組20例，其中男12例，女8例；年齡48～61歲，平均（55.50±4.02）歲。兩組年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），且為同時期和同地區(qū)收集，具有可比性。本研究經(jīng)牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（編號：202177），且研究對象均簽署知情同意書。AS患者組納入標準：①年齡45～65歲；②經(jīng)頸動脈超聲檢查診斷為動脈粥樣斑塊形成。排除標準：①有不穩(wěn)定型心絞痛、急性心肌梗死或其他心臟瓣膜疾病的患者；②惡性腫瘤或嚴重感染的患者；③有器官移植史的患者；④有免疫系統(tǒng)疾病的患者。健康組納入標準：①年齡45～65歲；②經(jīng)頸動脈超聲檢查確定無AS斑塊。排除標準同上。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑人全血單個核細胞分離液（Ficoll配置）（P9011）購自北京索萊寶科技有限公司；RNA提取試劑盒（R6812-02）購自美國OMEGA公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（04896866001）、SYBR Green Master Mix（04913 914001）購自美國Roche公司。

1.2.2 人全血單個核細胞分離向15 ml離心管中加入3 ml分離液，再緩慢加入1～2 ml全血，室溫，800×g，離心22 min；吸取單個核細胞層到另一15 ml離心管中，加入10 ml PBS緩沖液，混勻細胞，室溫，250×g，離心10 min；棄上清，以5 ml PBS緩沖液重懸細胞，室溫，250×g，離心10 min；重復上一步，棄上清后進行總RNA提取。

1.2.3 總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄RNA提取的整個操作過程嚴格按照OMEGA試劑盒說明書進行；使用Nanodrop 2000超微量分光光度計測定總RNA的濃度和純度，A260/280在1.8～2.2之間的樣本進行逆轉(zhuǎn)錄；使用Roche逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于-80℃冰箱保存。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction，RTqPCR）本研究采用SYBR Green染料法進行RTqPCR檢測，以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用公式2-ΔΔCt計算各樣品目的基因的相對表達量。擴增條件：95℃10 min（預變性），1個循環(huán)；95℃10 s（變性），60℃1 min（退火延伸），40個循環(huán)；使用儀器默認的熔解曲線分析程序。引物由廣州銳博生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成，CDR1as-F：5′-CAGTGTCTGCAATATCCAGGGTT-3′；CDR1as-R：5′-TTGGAAGACTTGAAGTCGCTGG-3′；GAPDH-F：5′-AACGGATTTGGTCGTATTGGG-3′；GAPDH-R：5′-GGCAACAATATCCACTTTACCAGA-3′。

1.3 觀察指標及評價標準

①比較健康組和AS患者組的外周血CDR1as的表達水平，采用公式2-ΔΔCt計算出兩組樣本中CDR1as相對表達量。②繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic curve，ROC）曲線，評估CDR1as對AS的診斷性能，包括靈敏度、特異度及截斷水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；采用ROC曲線分析CDR1as的診斷性能，以P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CDR1as在健康人群和AS患者中的表達

RT-qPCR結(jié)果顯示，AS患者組外周血CDR1as表達水平為（0.993±0.165），低于健康組的（0.768±0.169），差異有統(tǒng)計學意義（t=4.258，P＜0.01，圖1）。

圖1 CDR1as在健康人和AS患者外周血中的表達差異

2.2 ROC曲線分析CDR1as對AS的診斷性能

通過ROC曲線對CDR1as作為AS診斷標志物的效率進行評估，結(jié)果顯示，CDR1as的AUC為0.827，靈敏度和特異度分別為70%和85%（圖2），通過計算約登指數(shù)求出CDR1as的截斷水平為0.835。

圖2 外周血CDR1as表達水平對AS診斷的ROC曲線

3 討論

AS早期病變小，往往無癥狀隱匿發(fā)展，患者很難在此期間發(fā)覺不適并就診，而它是多種心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)。因此，早期識別AS可以讓患者得到及時治療，改善預后。目前，影像學檢查在AS斑塊形成后的確定性診斷中靈敏度高、特異性強，但并不能提示斑塊形成前的高危狀態(tài)，不具有及時做出早期診斷的作用，因此發(fā)掘早期無創(chuàng)指標尤顯重要。

circRNA是一種特殊類型的非編碼RNA，不同于前體mRNA產(chǎn)生的線性RNA，circRNA不含5′端帽子結(jié)構(gòu)和3′端多聚腺苷尾結(jié)構(gòu)，它是通過反向剪接，由5′-3′磷酸二酯鍵連接形成的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的新型分子，不易被核酸外切酶降解，因此其具有高度穩(wěn)定性，檢測結(jié)果更為可靠[9]；同時，它能夠穩(wěn)定存在于人的多種體液中，如唾液、血液和外泌體，可以通過無創(chuàng)的方式收集并檢測[10]；此外，它還具有進化保守性和組織特異性[11]，這顯示出其作為生物標志物的優(yōu)勢。

circRNA與AS關(guān)系十分密切。已有研究表明[12]，circHIPK3可通過靶向miR-190b/ATG7信號通路激活細胞自噬，減少氧化型低密度脂蛋白誘導的血管內(nèi)皮細胞內(nèi)的脂質(zhì)含量，對AS脂質(zhì)代謝具有一定意義；circANRIL可通過控制rRNA成熟，阻止核糖體的生物發(fā)生以及活化p53基因，起到抗AS的作用[13]。一項基于臨床的研究顯示[14]，以AS為基礎(chǔ)的冠心病患者中共有624個circRNA顯著上調(diào)和171個circRNA顯著下調(diào)，這提示AS的發(fā)生發(fā)展可能由多種circRNA共同參與。

以往對于CDR1as的研究主要集中于惡性腫瘤，且標本類型大多為腫瘤組織和細胞，在心血管疾病以及血液樣本中的研究較少。例如，Li等[15]研究表明，與正常組織和細胞相比，在食管鱗癌組織和細胞系中CDR1as明顯上調(diào)，CDR1as與腫瘤分期有關(guān)，并預測食管鱗癌患者的預后不良。另有研究發(fā)現(xiàn)[16]，檢測外周血中的CDR1as水平對診斷類風濕性關(guān)節(jié)炎具有一定價值。鑒于此，本研究采集AS患者外周血標本進行檢測，結(jié)果顯示，AS患者組外周血CDR1as表達水平低于健康組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。這表明外周血中的CDR1as水平具有區(qū)分AS患者和健康人的能力，為無創(chuàng)診斷提供了可能性。此外，ROC曲線評估外周血CDR1as表達水平作為AS診斷標志物的能力的AUC為0.827（P＜0.05），靈敏度和特異度分別為70%和85%，以約登指數(shù)算得其截斷水平為0.835，證明外周血CDR1as水平診斷AS的性能尚可，具有作為早期診斷AS的無創(chuàng)生物標志物的潛力。本研究的不足之處在于樣本量較少，結(jié)果有待大樣本量進行進一步的研究驗證。

綜上所述，本研究證明AS患者外周血中circRNA CDR1as表達水平明顯低于健康人，對AS具有一定的診斷價值，這為其成為早期診斷AS的新型無創(chuàng)檢查指標提供了一種可能性。