秦丹 白雅靜

內(nèi)蒙古自治區(qū)呼倫貝爾市食品藥品檢驗(yàn)所，內(nèi)蒙古呼倫貝爾 021000

蒙藥甘露降糖丸由石榴、梔子、蘇木、牛蒡子、赤芍、人參、冬葵果、玉竹等十六味藥組成，具有降血糖、升清降濁的功效。其中主要藥效成分梔子味苦、性寒，具有瀉火除煩、涼血解毒的作用[1-2]。中藥梔子中有效成分是以梔子苷為代表的環(huán)烯醚萜苷類及有機(jī)酸脂類成分[3-4]，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、抗糖尿病等作用，應(yīng)用前景廣闊，故選擇梔子苷為指標(biāo)成分[5-6]。梔子苷的檢測(cè)方法有硅膠色譜法、高效液相色譜法及免疫學(xué)分析法等[7]。其中高效液相色譜法是目前在藥物成分測(cè)定中主流的分析方法，應(yīng)用廣泛，具有分辨率高、分析速度快、定性及定量檢測(cè)方面靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[8-9]。目前為止，甘露降糖丸無現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為了準(zhǔn)確控制制劑質(zhì)量，本研究建立測(cè)定梔子苷含量的高效液相色譜法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀（2998 PDA Detector）、UV-2450型紫外-可見分光光度計(jì)、Sartorius BSA224S型電子分析天平、KQ-500DE型超聲波清洗器。

1.2 試藥

梔子苷對(duì)照品（批號(hào)：110749-201919，中國食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用，純度為97.1%）；供試品：甘露降糖丸由內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院提供（批號(hào)：20190612、20200122）。乙腈為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：SHIMADZU Shim-pack GIST C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（15∶85）；流速：0.8 ml/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長：238 nm；進(jìn)樣量：10 μl[1，10-11]。理論板數(shù)不低于3 000，且分離度良好。高效液相色譜圖見圖1（保留時(shí)間為9.596 min）。

圖1 梔子苷高效液相色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品稱取梔子苷對(duì)照品，加50%甲醇制成濃度為60 μg/ml的溶液，即得[12-13]。

2.2.2 供試品取甘露降糖丸研細(xì)，精密稱取約0.5 g，置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇25 ml，稱重，超聲（功率300 W，頻率40 Hz）30 min，放冷后，再稱重，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液5 ml置10 ml容量瓶定容，即得[1，14]。

2.2.3 陰性供試品按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，制備陰性樣品溶液（不含梔子苷）。

2.3 專屬性試驗(yàn)

精密移取“2.2.3”項(xiàng)下的陰性樣品溶液進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，陰性樣品溶液在梔子苷對(duì)應(yīng)保留時(shí)間處無色譜峰（圖1）。表明方法專屬性強(qiáng)。

2.4 線性關(guān)系考察

稱取對(duì)照品約5 mg，置25 ml容量瓶中，以50%甲醇配制成0.196 9 mg/ml的梔子苷對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，以50%甲醇稀釋制成質(zhì)量濃度為19.69、29.54、39.38、49.23、59.08、68.92、78.77 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，測(cè)得梔子苷線性回歸方程Y=18 216X-4 696.6（r=0.999 8，n=14）。結(jié)果表明梔子苷在19.69～78.77 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

按“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液配制方法制備對(duì)照品，重復(fù)進(jìn)樣5次。結(jié)果顯示梔子苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.15%（n=5），表明精密度良好（表1）。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取供試品溶液，平行試驗(yàn)6份。結(jié)果顯示梔子苷含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.51%（n=6），表明重復(fù)性良好（表2）。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，分別于0、3、6、9、12 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.74%，表明供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定（表3）。

表3 穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.8 加樣回收試驗(yàn)

取本品（含量5.83 mg/g）9份，每3份為1組，每一組精密加入對(duì)照品（梔子苷濃度1.479 mg/ml）0.8、1.0、1.2 ml，按“2.2”項(xiàng)下方法制備，依法計(jì)算平均回收率為93.9%，RSD為1.52（n=9）（表4）。

表4 梔子苷加樣回收試樣結(jié)果

2.9 樣品含量測(cè)定

取甘露降糖丸樣品測(cè)定，結(jié)果顯示2批樣品平均含量為5.85 mg/g（表5）。

表5 樣品中梔子苷含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 提取條件

在樣品提取溶劑考察中，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[15-16]，梔子苷含量測(cè)定多用甲醇、70%甲醇或50%甲醇作為提取溶劑。本研究中考察了3種不同提取溶劑，結(jié)果顯示50%甲醇、70%甲醇提取含量基本一致，甲醇提取不完全，含量較低，故本法采用50%甲醇作為提取溶劑。提取效率考察結(jié)果顯示，超聲提取時(shí)間30、40 min時(shí)梔子苷含量基本穩(wěn)定不變，且高于提取20 min時(shí)，故最終選擇超聲提取時(shí)間為30 min。

3.2 耐用性

不同流動(dòng)相流速（0.8、1.0 ml/min）對(duì)溶液進(jìn)樣的考察：結(jié)果樣品溶液在流速1.0 ml/min時(shí)，隨著試驗(yàn)的進(jìn)行，色譜柱的柱壓逐漸升高，故選擇流動(dòng)相流速為0.8 ml/min。色譜柱選用兩種不同色譜柱（SHIMADZU Shim-pack GIST C18，SHIMADZU-GL WondaCract ODS-2）對(duì)梔子苷含量影響進(jìn)行考察，結(jié)果表明，梔子苷含量無明顯差異，且分離度、理論塔板數(shù)均能夠滿足要求，說明耐用性較好。

近年來，蒙醫(yī)藥因其療效好、副作用低等優(yōu)點(diǎn)得到廣泛認(rèn)可。隨著行業(yè)的快速發(fā)展，人們對(duì)藥品的安全性日益關(guān)注，質(zhì)量控制方面的要求也日益增加[17]。蒙藥方劑組分多、成分多，具有很高的醫(yī)療價(jià)值，與傳統(tǒng)中藥相比，其用藥特點(diǎn)及用藥方案不同[18]。蒙藥方劑在配伍及質(zhì)量控制方面處于初級(jí)階段，還有待提高[19]。高效液相色譜法準(zhǔn)確度高，雜質(zhì)峰無干擾[20]。本研究中首次建立高效液相色譜法對(duì)甘露降糖丸中梔子苷含量進(jìn)行測(cè)定，對(duì)制劑的質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)，操作簡便，準(zhǔn)確性高，專屬性強(qiáng)，為其質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。甘露降糖丸中藥材種類較多，成分復(fù)雜，方法的建立也為下一步增加組分含量測(cè)定奠定了理論基礎(chǔ)。