于秋鴻，曾黎，宋希云，李軍

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 青島 266109)

干旱和鹽漬是制約作物產(chǎn)量、品質(zhì)和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要影響因素[1]。研究表明，在遭受干旱、鹽脅迫等逆境時，植物細(xì)胞會積累過量的甲基乙二醛(methylglyoxal，MG)[2，3]。MG在低濃度下可作為一種信號分子，參與種子萌發(fā)、根發(fā)育、莖形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞凋亡和脅迫耐受等多種生物學(xué)過程[4－8]，但在高濃度下對細(xì)胞內(nèi)的多種成分(如蛋白質(zhì)、DNA、RNA和脂質(zhì))具有高度反應(yīng)活性，導(dǎo)致它們不可逆地修飾或形成交聯(lián)復(fù)合物，引發(fā)細(xì)胞毒害[9]。

乙二醛酶系統(tǒng)(Gly1、Gly2和Gly3)在MG的降解清除中發(fā)揮著極為重要的作用。Gly1和Gly2需要還原型谷胱甘肽(GSH)作輔助因子將MG降解為無毒的乳酸，而Gly3可以不依賴GSH的協(xié)助完成對MG的直接降解[10]。目前普遍認(rèn)為Gly1－Gly2途徑在MG降解過程中是最有效的，如過表達(dá)Gly1和Gly2的轉(zhuǎn)基因煙草、水稻和擬南芥均表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽和抗旱能力[11－14]。但Gly1－Gly2途徑需要GSH和金屬離子作為其活性的輔助因子，因此當(dāng)GSH不足時，Gly3才能在MG降解中發(fā)揮作用[2]。Gly3廣泛存在于大腸桿菌[15]、裂殖酵母[16]和真核生物[17，18]中。已有證據(jù)表明，Gly3也可參與植物對生物和非生物逆境的應(yīng)答[10，18－20]。

玉米是一種重要的糧飼兼用作物，生長過程中經(jīng)常遭受干旱脅迫，而且近年來因全球氣候變暖導(dǎo)致的熱旱害日趨嚴(yán)重[21]。土壤鹽漬化也在一定程度上限制了玉米的種植和推廣。為此，我們從NCBI網(wǎng)站(https://preview.ncbi.nlm.nih.gov)檢索到了玉米Gly3蛋白的編碼基因(命名為ZmGly3)，利用生物信息學(xué)和分子遺傳學(xué)方法對ZmGly3的編碼蛋白理化性質(zhì)、空間結(jié)構(gòu)和表達(dá)時空特異性等進(jìn)行解析，以期找出該基因在玉米應(yīng)答干旱和鹽脅迫中的作用，為玉米抗旱耐鹽育種提供可用的基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理方法

供試玉米品種為鄭單958。將種子播于含有營養(yǎng)土和蛭石(體積比為3∶1)的花盆中，每盆1粒，置于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)智能溫室內(nèi)(25℃)培養(yǎng)；待幼苗長至三葉期時分別用20% PEG600和125 mmol/L NaCl溶液進(jìn)行模擬干旱和鹽脅迫處理，每處理5株幼苗，重復(fù)3次。分別于處理0、12、24、48 h后選取玉米幼苗的根、莖和葉，快速置于液氮中，于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑

RNA提取試劑盒購自TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；引物由北京擎科生物科技有限公司合成(表1)。

表1 qRT－PCR引物

1.3 生物信息學(xué)分析

從NCBI網(wǎng)站(https://preview.ncbi.nlm.nih.gov)檢索到ZmGly3(登錄號NM＿001153455.1)；用ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam)軟件分析ZmGly3編碼蛋白的理化性質(zhì)；用TMHMM Server 2.0軟件進(jìn)行蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測；用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr)和SWISS－MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)分析；用MEGA 7.0軟件對ZmGly3進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

1.4 總RNA提取、cDNA合成和表達(dá)模式分析

按照RNA提取試劑盒操作說明提取總RNA；用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA；用qRT－PCR分析表達(dá)模式，以Actin作為內(nèi)參基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmGly3的理化性質(zhì)分析

用ProtParam tool軟件分析發(fā)現(xiàn)，ZmGly3全長cDNA序列為1164 bp，編碼387個氨基酸，理論分子量為41.2 kD，等電點為5.37。對氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn)，帶負(fù)電荷的氨基酸(Asp＋Glu)殘基總數(shù)為43，帶正電荷的氨基酸(Arg＋Lys)殘基總數(shù)為31；Ala含量最高，占11.9%；Trp含量最少，占0.9%。蛋白不穩(wěn)定系數(shù)較低，為31.70，屬于穩(wěn)定蛋白。用ProtScale分析發(fā)現(xiàn)，此蛋白整體為親水性蛋白，在第127個氨基酸殘基處的數(shù)值為2.38，疏水性最高，在第251個氨基酸殘基處的數(shù)值為－2.344，親水性最高(圖1a)。TMHMM Server分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu)域(圖1b)，為細(xì)胞質(zhì)蛋白。用CD－Search分析發(fā)現(xiàn)，ZmGly3含有兩個DJ－1/Pfp1結(jié)構(gòu)域，屬于谷氨酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶(GAT－1)超家族(圖1c)。

圖1 ZmGly3蛋白的親、疏水性(a)、跨膜結(jié)構(gòu)域(b)和保守區(qū)(c)分析

2.2 ZmGly3的結(jié)構(gòu)分析

用SOPMA軟件分析發(fā)現(xiàn)，ZmGly3蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要有α－螺旋、延伸鏈、β－折疊和無規(guī)則卷曲。其中，α－螺旋有124個氨基酸，占32.04%；延伸鏈有83個氨基酸，占21.45%；β－折疊有39個氨基酸，占10.08%；無規(guī)則卷曲有141個氨基酸，占36.43%(圖2a)。用SWISS－MODEL軟件分析發(fā)現(xiàn)，ZmGly3蛋白由三條鏈組成，無金屬結(jié)合位點(圖2b)。

圖2 ZmGly3蛋白的二級結(jié)構(gòu)(a)和空間結(jié)構(gòu)(b)

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

用BLAST程序從NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索了與ZmGly3蛋白同源的其他植物的氨基酸序列，選取氨基酸序列同源性≥60%的10種植物進(jìn)行進(jìn)化樹分析。結(jié)果表明，ZmGly3蛋白與馬蹄芒MlGly3同源性為95.09%，親緣關(guān)系最近；與茶樹CsGly3同源性為79.53%，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖3)。

圖3 ZmGly3同源序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

2.4 ZmGly3組織特異性表達(dá)

在正常生長條件下，ZmGly3在玉米根、莖和葉中均有表達(dá)，但在莖中最高，葉中次之，根中最低(圖4)。莖中ZmGly3的相對表達(dá)量分別是根和葉中表達(dá)量的7.2倍和2.9倍。

圖4 ZmGly3在玉米不同器官中的相對表達(dá)量

2.5 ZmGly3在干旱和鹽脅迫下的表達(dá)

在干旱脅迫下，ZmGly3在玉米幼苗根中的相對表達(dá)量隨處理時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，處理24 h相對表達(dá)量達(dá)到最高值，是對照(0 h)的3.6倍；干旱脅迫降低ZmGly3在莖中的相對表達(dá)量，處理48 h的相對表達(dá)量僅為對照的70%；在葉中的相對表達(dá)量總體呈現(xiàn)升高趨勢，處理48 h的相對表達(dá)量最高，是對照的2.2倍(圖5a)。鹽脅迫能促進(jìn)ZmGly3在玉米幼苗根、莖、葉中的相對表達(dá)量，且均隨處理時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，均在處理24 h達(dá)到最高值，分別是對照的2.0、1.3、1.8倍(圖5b)。

圖5 ZmGly3在干旱(a)和鹽(b)脅迫下的相對表達(dá)量

3 討論與結(jié)論

Gly3參與的MG降解途徑可以被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)GSH不足或匱乏時清除過量MG的替代途徑。Gly3的標(biāo)志性特征是具有DJ－1/PfpI結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域中保守的His－Cys－Glu/Asp是酶的活性位點，有MG降解活性但缺乏對GSH的結(jié)合親和力；當(dāng)Cys119定點突變?yōu)楸彼釙r，Gly3活性顯著降低[2，17]。Gly3普遍存在于從低等(苔蘚、石松)到高等(裸子、被子)的植物中[17]。另外，Gly3蛋白主要定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中[3，22]。我們利用生物信息學(xué)方法分析了玉米Gly3(ZmGly3)蛋白的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特點，結(jié)果表明，ZmGly3含有387個氨基酸，為穩(wěn)定的親水性蛋白；含有兩個DJ－1/Pfp1結(jié)構(gòu)域，是GAT－1超家族的成員；與Gly1和Gly2不同，ZmGly3沒有金屬結(jié)合位點；ZmGly3與馬蹄芒MlGly3同源性最高，親緣關(guān)系最近。

已有證據(jù)表明，Gly3參與了植物對逆境脅迫的應(yīng)答。Ghosh等[17]對多種脅迫條件下的水稻DJ－1轉(zhuǎn)錄本研究發(fā)現(xiàn)，OsDJ－1(即OsGly3)受外源MG的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，其中OsDJ－1C在不依賴于GSH的情況下將MG直接降解；OsDJ－1C在水稻的所有發(fā)育階段和組織中表現(xiàn)出較高水平的組成型表達(dá)。Manoj等[10]發(fā)現(xiàn)在干旱和鹽脅迫條件下抗性較強(qiáng)的野生近緣種甘蔗Gly3比商品種具有更高的表達(dá)水平。Meera等[19]研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下紅樹RmGly1和RmGly2的相對表達(dá)量明顯高于RmGly3。Mohanan等[20]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)EaGly3的甘蔗抗旱性增強(qiáng)。本研究結(jié)果表明，正常條件下，ZmGly3在玉米根、莖和葉中均有表達(dá)，但在莖中最高；在干旱和鹽脅迫條件下，ZmGly3在根和葉片中的表達(dá)量增加，但在莖中的表達(dá)受干旱和鹽脅迫影響不同，在干旱處理下降低而在鹽處理下增加。

可見，ZmGly3參與了玉米對干旱和鹽脅迫的應(yīng)答，但在不同器官中對不同脅迫條件的響應(yīng)并不完全一致。今后還需對其具體的生物學(xué)功能進(jìn)行進(jìn)一步解析。