陳譽尹， 趙淑云， 王瑞， 伍紫蕊， 李玉佳， 文興慧， 瞿佳麗， 黃官友**

(1.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 生殖中心， 貴州 貴陽 550004； 2.畢節(jié)市中醫(yī)院 婦產(chǎn)科， 貴州 畢節(jié) 551700)

哺乳動物的子宮是孕育胚胎的場所，可為胚胎提供充足的養(yǎng)分，并對胚胎進行保護；子宮又是母體與胎兒緊密接觸場所，孕體中一半的基因來自父親，發(fā)育中的胚胎和胎盤被認為是半移植物 ，胎兒容易成為免疫系統(tǒng)攻擊的潛在目標，如果沒有強有力的免疫抑制，這種半移植物很快會被識別并產(chǎn)生排斥。在整個妊娠期，母體的免疫系統(tǒng)將胎兒視為暫時的自我，而不予以攻擊[1]，母胎耐受是保護胎兒不被母體免疫系統(tǒng)攻擊的主要原因[1-3]。研究表明，在母胎界面(母體和胎兒的接觸面，主要包括絨毛及蛻膜組織)中輔助型T細胞2(T helper 2 cell，Th2)型細胞因子如白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)和吲哚胺2,3-雙加氧酶 (indoleamine2,3-dioxygenase，IDO) 是維持母胎耐受的兩個主要因子[4-7]。目前有關IL-6在母胎耐受中機制的研究較少，既往的研究表明，IL-6可上調(diào)早孕絨毛及蛻膜組織中IDO的表達[8]，本研究主要探討母胎界面中IL-6調(diào)控IDO表達的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與器材

蛋白酶抑制劑( P8340) 和 RIPA Buffer購自Sigma公司，BCA-100 蛋白定量測定制劑盒 、一抗和二抗去除液購自碧云天公司，兔抗IDO、兔抗信號轉導及轉錄激活子-1(signal transducerand activator of transcription 1，STAT1) 抗體、兔抗蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶-1(src-homology domain 2-containing protein tyrosine phosphatase-1， SHP-1)抗體、兔抗蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶-2(Src-homology domain 2-containing protein tyrosine phosphatase-2，SHP-2)抗體、GAPDH兔單克隆抗體、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的山羊抗兔免疫球蛋白(immune globulin，IgG)及10×TBST購自Cell Signaling Technology 公司,PVDF 膜及ECL 試劑盒購自 PerkinElmer 公司，5×SDS-PACE 蛋白上樣緩沖液及預染蛋白相對分子質(zhì)量(Mr) Marker 購自 Biosharp 公司，SDS-PACE 制備試劑盒購北京SOLARBIO公司，重組人IL-6細胞因子購自PEPROTECH公司， F- 12/DMEM及FBS購自Invitrogen 公司。保溫箱為美國Thermo公司產(chǎn)品。

1.2 研究方法

1.2.1標本來源、收集及處理 選擇行人工流產(chǎn)終止妊娠的37例正常早孕(孕周6～8周)婦女，妊娠期間未服用任何藥物，并排除全身性疾病、稽留流產(chǎn)、接受過人流前處理( 如孕酮和米非司酮)的患者[8]。本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準(2020倫審第023號)，將研究實施目的與方法過程告知受試者，均同意表示自愿配合研究，并簽署同意書。 收集所有受試者的子宮絨毛及蛻膜組織，操作過程嚴格遵循無菌原則，采用無菌磷酸鹽緩沖液( phosphate buffer saline pH7. 2，PBS pH7. 2)對絨毛和蛻膜組織進行清洗，去除紅細胞。

1.2.2組織培養(yǎng) 絨毛和蛻膜組織在收集后40 min內(nèi)(去除紅細胞)處理完畢，具體步驟：將收集的絨毛的和蛻膜組織切成小塊( 濕重≤1 mg) ，用 F-12 /DMEM沖洗2次，離心5 min，在培養(yǎng)基中加入10% FBS 和1%青霉素，37 ℃保溫箱中培養(yǎng)，控制環(huán)境中CO2濃度為5%。后分別用含 0、50×10-6及100×10-6mg/L IL-6的培養(yǎng)基孵育24 h。

1.2.3Western blot檢測絨毛和蛻膜組織中IL-6、IDO 、SHP-1、SHP-2及 STAT1蛋白的表達 收集所需的絨毛和蛻膜組織，放置在液氮冷卻處理的研缽中，加入液氮后研磨，成粉末狀，加入蛋白酶抑制劑形成裂解效果，4 ℃、1 2000 r/min離心30 min，取上清液，用 BCA 測蛋白濃度；進而繼續(xù)在其中加入上樣緩沖液，加溫處理煮沸變性，加入聚丙烯酰胺凝膠中的電泳、轉膜，將蛋白轉至PVDF 膜上；用5%的脫脂奶粉封閉PVDF 膜 ，時間控制在2 h，一抗 4 ℃ 孵育過夜，洗膜后加入二抗，孵育后加入ECL 顯影，使用 Imagel J 軟件處理圖片，GAPDH 作為內(nèi)參對照。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 正常早孕絨毛及蛻膜組織中 IDO和STAT1蛋白的表達

Western blot 結果表明，早孕絨毛及蛻膜組織中均有 IDO和STAT1蛋白的表達(圖1A及圖2A)，且絨毛組織中IDO和STAT1蛋白的均高于蛻膜組織，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：A為Western Blot檢測在正常早孕蛻膜和絨毛組織中IDO蛋白的結果，B為正常早孕蛻膜和絨毛組織中IDO蛋白表達的定量結果；(1)與蛻膜組織比較，P<0.05。

注：A為Western Blot檢測在正常早孕蛻膜和絨毛組織中STAT1蛋白結果，B為正常早孕蛻膜和絨毛組織中STAT1蛋白表達的定量結果；(1)與蛻膜組織比較，P<0.05。

2.2 IL-6濃度與正常早孕絨毛和蛻膜組織中IDO、SHP-1、SHP-2及 STAT1蛋白的表達

Western blot結果顯示，在不同濃度IL-6培養(yǎng)的早孕絨毛和蛻膜組織中， IL-6的濃度與 IDO、SHP-1、SHP-2及 STAT1蛋白的表達呈正相關(絨毛：P=0.043 3、0.021 3、0.005 5及0.011 9，r=0.995 4、0.998 9、0.999 9、0.999 7；蛻膜：P=0.045 4，0.034 5，0.045 6、0.044 6，r=0.994 9、0.997 1、0.994 9、0.995 1)，IL-6上調(diào)IDO、SHP-1、SHP-2及 STAT1蛋白的表達(圖3A、圖3B、圖3C、圖4B)；IDO 蛋白與SHP-1、SHP-2及 STAT1蛋白的表達呈正相關(絨毛，圖3A和3C，P=0.001 1、0.046 8、0.022 6，r=0.802 2、0.735 9、0.547 5; 蛻膜，圖4A和4C，P=0.001 4、<0.000 1、<0.000 1，r=0.786 3、0.944 4、0.944 1)；STAT1蛋白與SHP-1、SHP-2蛋白的表達呈正相關(絨毛，圖3A和3D，P=0.009 1、0.414 0，r=0.645 1、0.228 3; 蛻膜，圖4A和4D，P=0.010 4、<0.000 1，r=0.632 3、0.918 7)。

注：A為Western Blot檢測在不同濃度IL-6 培養(yǎng)下正常早孕蛻膜組織中 IDO、SHP-1、SHP-2及STAT1蛋白的結果，B為正常早孕蛻膜組織中 IDO、SHP-1、SHP-2及STAT1蛋白與加入IL-6濃度的相關性分析，C為正常早孕蛻膜組織中 IDO與SHP-1、SHP-2及STAT1蛋白相關性分析，D為正常早孕蛻膜組織中STAT1與SHP-1、SHP-2蛋白相關性分析。

3 討論

在妊娠早期，IDO是維持母-胎免疫耐受的主要蛋白之一[5,9-11]。本課題組既往的研究表明，早孕婦女絨毛和蛻膜中的雌激素通過下調(diào)細胞因子信號轉導抑制因子3(suppressors of cytokine signaling 3，SOCS3)[12]的表達和上調(diào)轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)的表達來上調(diào)IDO的表達，進而誘導母-胎耐受[13]。然而，母-胎界面調(diào)控IDO表達的具體機制仍然不清。

早期的研究表明，IL-6可以通過上調(diào)樹突狀細胞中(DCs)[14]中的SOCS3(而不是SHPS)來降低IDO的表達，但最近的研究表明，使用小片段干擾核糖核酸(small interfering RNA，siRNA)抑制IL-6可以減少SKOV-3和NCI-H596細胞[15]中IDO mRNA和蛋白的表達以及犬尿氨酸的形成。有研究表明，在早孕婦女的絨毛及蛻膜中，IL-6可上調(diào)IDO的表達，但其上調(diào)IDO表達的分子機制仍需要進一步的研究[8]。

本實驗對早孕婦女的絨毛及蛻膜組織進行檢測，結果表明，人早孕絨毛和蛻膜組織均表達 IDO蛋白，這與以往的報道的類似[10,16-17]。 有學者發(fā)現(xiàn)，STAT1蛋白可在正常足月胎盤組織的滋養(yǎng)細胞中表達，并與該細胞的活力和侵襲力有關[18-19]；本研究表明，STAT1 蛋白可在人的正常早孕絨毛和蛻膜組織表達。本研究中，在培養(yǎng)的正常早孕絨毛和蛻膜組織中，IL-6均能以劑量依賴性方式增加培養(yǎng)的絨毛和蛻膜中IDO和STAT1的表達，這與經(jīng)典的IL-6信號通路顯示的IL-6上調(diào)STAT1的表達一致[20-21]。人類IDO蛋白的組成成分較多，主要包括催化亞單位和非催化亞單位，分別為C 端和N 端，同時還包括一個對兩者進行連接的環(huán)。IDO非催化亞單位含有兩個功能性的免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs，ITIMs，基本結構為 I/V/L/SxYxxL/ V/F (I：Ile，V：Val，L：Leu ，S：Ser ，Y：Tyr，F(xiàn)：Phe)[22]。ITIM中的酪氨酸發(fā)生磷酸化后，可被含有SH2結構域的分子所結合[23]；IDO通過其ITIM與SHP-1/2[22](含1個SH2結構域的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶為SHP-1，含2個SH2結構域的蛋白酪氨酸磷酸酶為SHP-2)結合后，上調(diào)IDO自身的表達，SHP-1/2的表達越高，IDO的表達就越高。本研究表明，在早孕婦女的絨毛及蛻膜組織中，IL-6均能以劑量依賴性方式增加培養(yǎng)的絨毛和蛻膜中 SHP-1/2 的表達，且IDO的表達 與SHP-1、SHP-2及STAT1的表達呈正相關，STAT1的表達與SHP-1/2的表達呈正相關；提示IL-6同時上調(diào)IDO、SHP-1/2 和STAT1的表達，IL-6通過上調(diào) STAT1的表達來上調(diào)的IDO的表達?；赟TAT1可招募SHP-1/2并增加SHP1/2 的表達[24-25]；SHP-1/2與IDO 結合后上調(diào)IDO的表達[21]； 本研究推測，在正常早孕絨毛和蛻膜組織中，IL-6可能通過上調(diào)STAT1的表達來上調(diào)SHP-1/2表達，進而上調(diào)IDO的表達。