趙榮生，孫錫南，王鑫，王宗成*

（1.湖南科技學(xué)院創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)學(xué)院，湖南 永州 425199；2.湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院湖南省生物質(zhì)資源綜合開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，湖南 永州 425199）

桑葉作為藥食同源的農(nóng)副產(chǎn)品，擁有極高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值[1-2]，桑葉采收、除質(zhì)、干燥后就可直接使用，具有降血糖、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化、抗炎、延緩衰老、抗腫瘤和免疫調(diào)理等功效[3-8]。桑葉中含有生物堿、黃酮等多種生物活性化學(xué)組分[9-14]，此外桑葉還含有較為豐富的桑葉蛋白，桑葉粗蛋白含量可達(dá)到22.21%～32.38%，且氨基酸組成比例較適合人體吸收利用[15-18]。當(dāng)前，國內(nèi)對(duì)桑葉蛋白提取的研究報(bào)道較多，一般采用微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、纖維素酶輔助提取法、浸提法等方法提取桑葉蛋白[19-22]，但是桑葉蛋白的得率普遍不高，并且存在提取時(shí)間長、溶劑消耗大等問題[19-22]，此外，除了桑葉蛋白飼料、桑葉蛋白飲料外，對(duì)桑葉蛋白開發(fā)應(yīng)用形成的產(chǎn)品不多[15-16，23]。當(dāng)前，關(guān)于超聲波細(xì)胞破碎法提取桑葉蛋白和通過酶解桑葉蛋白研究酶解蛋白的抗氧化活性研究鮮見。而超聲波細(xì)胞破碎法可以快速破碎植物細(xì)胞，有助于有效成分的溶出，能高效、快速地提取有效成分[24]，因此，為了提高桑葉蛋白的得率和探索桑葉酶解蛋白的抗氧化活性，本研究采用超聲波細(xì)胞破碎法提取桑葉蛋白，采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝條件，采用木瓜蛋白酶酶解桑葉蛋白，并研究了桑葉酶解蛋白的抗氧化活性，為桑葉蛋白資源進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葉：采摘于湖南科技學(xué)院種植的桑科植物的葉片，自然晾干，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，得桑葉粉。牛血清白蛋白、木瓜蛋白酶（化學(xué)純）：上海金穗生物科技有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、考馬斯亮藍(lán)G-250、95%乙醇、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 [1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH]、亞鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯乙酸、三氯化鐵（均為分析純）：上海泰坦科技股份有限公司；試驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

離心機(jī)（TG16G）：湖南凱達(dá)儀器有限公司；恒溫水浴鍋（HWS28）：上海一恒科技有限公司；超聲波細(xì)胞破碎儀（JYD-1200L）：上海之信儀器有限公司；紫外-可見分光光度計(jì)（UV1900）：青島聚創(chuàng)環(huán)保設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葉蛋白的提取

精確稱取桑葉粉10 g，用濃度為0.5%NaOH溶液作為桑葉蛋白提取的浸提液，按照一定的液料比，用0.5%稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)浸提液的pH值，經(jīng)超聲細(xì)胞破碎儀破碎提取后，再經(jīng)過一定時(shí)間的水浴加熱浸提[24]，將浸提液離心，過濾，收集上清液定容，得桑葉蛋白提取液。

1.3.2 桑葉蛋白的含量測定

精確稱取10 mg牛血清蛋白粉末置于100 mL容量瓶中，加去離子水使其完全溶解，再加去離子水定容至刻度，得100 mg/mL的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。取6支具塞試管分別編號(hào)后，在試管中分別精確移取牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別加蒸餾水 1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL，配制成濃度為 0、20、40、60、80、100 μg/mL的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后在各支試管中分別加入5.0 mL濃度為100 μg/mL的考馬斯亮藍(lán)G250溶液，搖勻，放置2 min后在595 nm波長處測定吸光度，以牛血清白蛋白含量（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，制作牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線[25]，得到線性方程：y=0.007 2x-0.003 3（R2=0.997 9）。取稀釋的桑葉蛋白提取液1.0 mL，按照牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)步驟，測定桑葉蛋白含量，根據(jù)公式（1）計(jì)算桑葉蛋白的提取得率。

式中：C為蛋白含量，μg/mL；V為提取液體積，mL；N為稀釋的倍數(shù)；M為桑葉粉質(zhì)量，g。

1.3.3 桑葉蛋白提取工藝的單因素試驗(yàn)

根據(jù)桑葉蛋白的提取方法，按照以下單因素試驗(yàn)進(jìn)行桑葉蛋白提?。嚎疾旖嵋旱?pH 值（2、4、6、8、10、12）、液料比 [8∶1、10∶1、12∶1、14∶1、16∶1、18∶1（mL/g）]、超聲功率（100、200、300、400、500、600 W）、破碎時(shí)間（1、2、3、4、5、6 min）、浸提溫度（20、30、40、50、60、70 ℃）、浸提時(shí)間（5、10、15、20、25、30 min）、浸提次數(shù)（1、2、3、4）對(duì)桑葉蛋白得率的影響。

1.3.4 桑葉蛋白提取工藝的正交試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，通過考察各單因素對(duì)桑葉蛋白得率的影響以及各單因素水平對(duì)桑葉蛋白得率顯著性差異，綜合考慮選出對(duì)桑葉蛋白提取得率影響較大的4個(gè)因素，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，研究超聲細(xì)胞破碎法提取桑葉蛋白的4個(gè)要素相互作用的影響，優(yōu)化桑葉蛋白提取工藝，確定最優(yōu)提取條件。

1.3.5 桑葉酶解蛋白抗氧化活性研究

1.3.5.1 桑葉酶解蛋白的制備

參照文獻(xiàn)[26]，將桑葉蛋白提取液調(diào)節(jié)pH值到等電點(diǎn)5[27]，靜置，于8 000 r/min離心15 min，過濾，水洗，干燥得桑葉蛋白。稱取桑葉蛋白樣品0.5 g，用適量蒸餾水溶解，加入木瓜蛋白酶0.04 g，充分溶解混勻，定容至50 mL，置于55℃水浴下保溫酶解反應(yīng)3 h，取出于沸水中煮2 min，放置至室溫，作為桑葉酶解蛋白。

1.3.5.2 DPPH自由基清除率的測定

參考田格等[28]的方法，精確量取2 mL不同濃度桑葉酶解蛋白溶液于試管中，加入4mL濃度為0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液，輕輕搖晃一下瓶身使其充分混勻，室溫避光保存30 min后測定517 nm處吸光值A(chǔ)1；以2 mL樣品溶液和4 mL去離子水混合作為對(duì)照組，測定其吸光值A(chǔ)2；以2 mL去離子水加入4 mL濃度為0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液混合作為空白溶液，測定吸光值A(chǔ)0。用相同濃度的未酶解桑葉蛋白和維生素C作對(duì)照。DPPH自由基清除率計(jì)算公式見式（2）。

1.3.5.3 總還原能力的測定

參考辛小麗等[29]的方法。采用普魯士藍(lán)還原法，準(zhǔn)確量取2.5 mL不同濃度桑葉酶解蛋白溶液于離心管中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%亞鐵氰化鉀溶液2.5 mL和pH值為6.6的磷酸鹽緩沖液1.5 mL，均勻混合在50℃下放置20 min，量取2.5 mL濃度為10%的三氯乙酸溶液混合，之后放入4 500 r/min離心機(jī)內(nèi)離心10 min，取上清液2.5 mL，加入去離子水2.5 mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的FeCl3溶液2.5 mL，充分混勻均勻，放置10 min，在700 nm處測定吸光度，吸光度越大說明總還原能力越強(qiáng)。用相同濃度的未酶解桑葉蛋白和維生素C作對(duì)照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，以平均值作為結(jié)果；數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理；用Origin 2018軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同pH值的浸提液對(duì)桑葉蛋白得率的影響浸提液的pH值對(duì)桑葉蛋白得率的影響如圖1。

圖1 浸提液的pH值對(duì)桑葉蛋白得率的影響Fig.1 Effects of pH value of extracted liquid on the yield of mulberry leaf protein

由圖1可知，當(dāng)pH值為2～8時(shí)，桑葉蛋白的得率逐漸增加P＜0.05），pH值超過8時(shí)，桑葉蛋白的得率減少，在浸提液的pH值為8時(shí)，蛋白質(zhì)的得率最高。桑葉蛋白的等電點(diǎn)在pH5附近[27]，偏離等電點(diǎn)蛋白質(zhì)溶解更完全，但是pH值過高，浸提液黏度增加，影響蛋白質(zhì)等電點(diǎn)沉降[30]，因此，綜合考慮選擇浸提液的pH值為8。

2.1.2 不同液料比對(duì)桑葉蛋白得率的影響

液料比對(duì)桑葉蛋白得率的影響如圖2。

圖2 液料比對(duì)桑葉蛋白得率的影響Fig.2 Effects of ratio of liquid to material on the yield of mulberry leaf protein

由圖2可以看出，隨著液料比的增加，桑葉蛋白得率隨浸提液體積的增大先上升后下降，在液料比為14∶1（mL/g）時(shí)，桑葉蛋白得率最大。當(dāng)液料比超過14∶1（mL/g）時(shí)，過多的浸提液不僅浪費(fèi)原料，而且得到的桑葉蛋白濃度會(huì)下降，使一些雜質(zhì)被提取出來，導(dǎo)致得率下降[28]。因此，在考慮到生產(chǎn)成本和生產(chǎn)效率的基礎(chǔ)上，選擇最佳液料比為 14∶1（mL/g）。

2.1.3 不同超聲功率對(duì)桑葉蛋白得率的影響

超聲功率對(duì)桑葉蛋白得率的影響如圖3。

圖3 超聲功率對(duì)桑葉蛋白得率的影響Fig.3 Effects of ultrasonic power on the yield of mulberry leaf protein

由圖3可以看出，隨著超聲細(xì)胞破碎儀輸出功率的增大，桑葉蛋白的得率先顯著增高（P＜0.05），當(dāng)超聲細(xì)胞破碎儀輸出的功率超過300 W后，桑葉蛋白得率略有下降?？赡苁请S著超聲細(xì)胞破碎儀輸出功率的增加，超聲破碎效果增加，當(dāng)超聲功率超過300 W時(shí)，隨之熱效應(yīng)明顯，超聲溫度增加明顯，可能導(dǎo)致有部分桑葉蛋白被破壞，并且一些其他物質(zhì)同時(shí)溶出，桑葉蛋白得率有所下降[31]。因此，考慮到生產(chǎn)效率，超聲功率為300 W最佳。

2.1.4 不同破碎時(shí)間對(duì)桑葉中蛋白質(zhì)得率的影響

破碎時(shí)間對(duì)桑葉中蛋白質(zhì)得率的影響如圖4。

圖4 破碎時(shí)間對(duì)桑葉蛋白得率的影響Fig.4 Effects of crushing time on the yield of mulberry leaf protein

由圖4可以看出，隨著破碎時(shí)間的增加，桑葉蛋白得率不斷增大（P＜0.05），在破碎時(shí)間為5 min時(shí)，桑葉蛋白得率達(dá)到最高，超過5 min蛋白質(zhì)得率呈現(xiàn)下降的趨勢。破碎時(shí)間過短，桑葉蛋白還沒得到充分地釋放，當(dāng)提取達(dá)到飽和狀態(tài)后，增加提取時(shí)間并不會(huì)增大蛋白質(zhì)得率，反而有可能破壞桑葉蛋白[24]。因此，考慮到更好地提高生產(chǎn)效率、節(jié)省生產(chǎn)時(shí)間，選擇破碎時(shí)間為5 min。

2.1.5 不同浸提溫度對(duì)桑葉蛋白得率的影響

浸提溫度對(duì)桑葉蛋白得率的影響如圖5。

圖5 浸提溫度對(duì)桑葉蛋白得率的影響Fig.5 Effects of extraction temperature on the yield of mulberry leaf protein

由圖5可知，桑葉蛋白得率隨著浸提溫度的變化呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，當(dāng)浸提溫度為40℃時(shí)，桑葉蛋白得率達(dá)到最大值。在40℃之前，蛋白質(zhì)的溶解速率隨著溫度的升高而增加，當(dāng)浸提溫度超過40℃時(shí)，桑葉蛋白可能開始變性，桑葉蛋白得率逐漸降低[32]。因此，選擇浸提溫度為40℃。

2.1.6 不同浸提時(shí)間對(duì)桑葉蛋白得率的影響

浸提時(shí)間對(duì)桑葉蛋白得率的影響如圖6。

圖6 浸提時(shí)間對(duì)桑葉蛋白得率的影響Fig.6 Effects of extraction time on the yield of mulberry leaf protein

從圖6可以看出桑葉蛋白得率隨著浸提時(shí)間增加逐漸增加，當(dāng)浸提時(shí)間超過15 min時(shí)，桑葉蛋白得率變化不顯著（P＞0.05），可能隨著浸提時(shí)間的延長，桑葉蛋白已經(jīng)充分溶出。因此，為了節(jié)約時(shí)間，選擇浸提時(shí)間為15 min最合適。

2.1.7 不同浸提次數(shù)對(duì)桑葉蛋白得率的影響

浸提次數(shù)對(duì)桑葉蛋白得率的影響如圖7。

圖7 浸提次數(shù)對(duì)桑葉蛋白得率的影響Fig.7 Effects of extraction times on the yield of mulberry leaf protein

由圖7可以看出，隨著浸提次數(shù)的增加，桑葉蛋白的得率先明顯增加，后趨于平穩(wěn)。桑葉在2次的浸提后桑葉中的蛋白質(zhì)大部分都溶解出來，在浸提超過2次后，桑葉蛋白得率增加的幅度很少（P＞0.05），考慮到節(jié)約工藝的時(shí)間和材料成本，選擇浸提2次。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果綜合考慮，正交試驗(yàn)采取固定浸提液的pH值為8、浸提時(shí)間15 min、浸提2次的條件下，選擇破碎時(shí)間、液料比、超聲功率、浸提溫度4個(gè)單因素進(jìn)行四因素三水平L9（34）正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Orthogonal test result

由表1可知，桑葉蛋白提取的較優(yōu)組合方案是A2B3C3D3，即液料比為 16∶1（mL/g），400 W 超聲破碎處理5 min，浸提溫度為50℃。根據(jù)極差R的大小結(jié)果得知，4個(gè)單因素中對(duì)桑葉蛋白的提取得率影響大?。篈（破碎時(shí)間）＞B（液料比）＞D（浸提溫度）＞C（超聲功率）。

進(jìn)一步通過方差分析討論各因素對(duì)桑葉蛋白得率的影響，結(jié)果如表2所示。

表2 方差分析結(jié)果Table 2 Results of variance analysis

從正交試驗(yàn)的方差分析表中可以得到因素A（破碎時(shí)間）極顯著，對(duì)結(jié)果有顯著影響，其他因素對(duì)桑葉蛋白得率影響較小。因此，從經(jīng)濟(jì)角度出發(fā)，其他因素可以選擇較小的料液比、較低的超聲功率和較低的溫度，進(jìn)一步優(yōu)化提取組合方案為A2B1C1D1，即液料比為12∶1（mL/g），200 W 超聲破碎處理 5 min，浸提溫度為30℃。為了驗(yàn)證正交試驗(yàn)的可靠性，根據(jù)上述優(yōu)化的提取組合方案條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，得到桑葉蛋白的平均得率達(dá)到了9.85%。與傳統(tǒng)的提取方法相比，超聲細(xì)胞破碎法提取桑葉蛋白的得率更高，并且提取時(shí)間更短[19-22]。

2.3 酶解桑葉蛋白抗氧化活性研究

2.3.1 DPPH自由基清除能力

酶解桑葉蛋白對(duì)DPPH自由基清除能力如圖8所示。

圖8 桑葉蛋白對(duì)DPPH自由基清除能力Fig.8 Scavenging ability of mulberry leaf protein to DPPH free radical

由圖8中可以看出，桑葉酶解蛋白、未酶解桑葉蛋白和維生素C濃度對(duì)DPPH自由基清除能力均呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系。隨著濃度增加，對(duì)DPPH自由基清除能力不斷升高，說明桑葉酶解蛋白和未酶解桑葉蛋白都具有一定的DPPH自由基清除能力，并且桑葉酶解蛋白對(duì)DPPH自由基清除能力更強(qiáng)。當(dāng)桑葉酶解蛋白濃度為2 mg/mL時(shí)DPPH自由基清除率達(dá)到65.3%，雖然活性弱于維生素C，但是明顯強(qiáng)于同濃度下未酶解桑葉蛋白DPPH自由基清除率（35.6%），因此說明通過酶解可以提高桑葉蛋白的抗氧化活性，酶解桑葉蛋白對(duì)DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力。

2.3.2 總還原能力

酶解桑葉蛋白的總還原能力如圖9所示。

圖9 桑葉蛋白的總還原能力Fig.9 Total reducing capacity of mulberry leaf protein

由圖9可以看出，隨著桑葉酶解蛋白、未酶解桑葉蛋白和維生素C濃度的增加，總還原能力試驗(yàn)中吸光度越來越大，說明總還原能力越來越強(qiáng)，桑葉酶解蛋白和未酶解桑葉蛋白都具有一定的總還原能力，雖然桑葉酶解蛋白活性弱于維生素C，但是比未酶解桑葉蛋白具有更強(qiáng)的總還原能力。

3 結(jié)論

本研究采用超聲波細(xì)胞破碎法提取桑葉蛋白，考察了浸提液的pH值、液料比、超聲功率、破碎時(shí)間、浸提溫度、浸提時(shí)間、浸提次數(shù)7個(gè)因素對(duì)桑葉蛋白提取得率的影響。通過對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果的探究，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝條件，優(yōu)化后得出最佳提取工藝條件：浸提液的 pH 值為 8，液料比為 12∶1（mL/g），超聲功率200 W下處理5 min，在30℃下水浴15 min浸提2次，在此條件下，桑葉蛋白的得率為9.85%。此外，通過酶解可以提高桑葉蛋白的抗氧化活性，桑葉酶解蛋白不僅具有一定的還原能力，還對(duì)DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力，為桑葉蛋白資源開發(fā)提供理論依據(jù)。