孫穎，李宗澤，徐晉，孫京格，白雨禾，賀曉陽，韓冉，石磊

（天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457）

植物碳水化合物的范圍很廣，包括單糖、雙糖、低聚糖以及多糖。十多個、數(shù)百個或數(shù)千個單糖通過糖苷鍵連接組成的生物大分子通常稱為植物多糖[1]。近年來，相關研究表明植物多糖具有多種生物活性，并且能夠很好地與抗氧化劑、抗炎劑相互作用，從而具有促進細胞活力、免疫調節(jié)和抗腫瘤等功能[2]，因此被認為是一種對人類健康有益的天然抗氧化劑[3]。

一般來說，植物多糖是在細胞內產(chǎn)生和積累的，因此必須使細胞壁破裂才能進行多糖的提取[2]。超聲輔助提取法是基于超聲波在液體中空化作用的一種物理破碎過程，其具有耗能低、耗時短、操作簡單和不引入化學試劑等優(yōu)點。研究表明，檳榔多糖通過超聲輔助提取，多糖提取率可提升至6.10%[4]。相關研究一般使用超聲波清洗機作為輔助提取設備，其空化力量較為分散，更適用于脫氣和清洗。本文選取超聲波細胞破碎（ultrasonic cell crushing，UCC）法進行細胞破壁，其優(yōu)勢是使全部能量集中于探頭，可以在較低能量和較短時間內將具有高細胞壁硬度的細胞中的多糖進行溶解和釋放[5]。

番石榴葉為番石榴（Psidium guajava Linn.）的干燥葉及其帶葉嫩枝的統(tǒng)稱，其多分布于我國南方?，F(xiàn)代藥理研究表明番石榴葉含有多種活性物質，如黃酮類、多酚類、多糖類等[6]。已有研究表明番石榴葉多糖（guava leaf polysaccharide，GLP）能夠抑制 α-葡萄糖苷酶活性，有效地降低餐后血糖水平[7]。目前，相關研究主要集中在番石榴葉中的黃酮類和酚類化合物的提取和活性分析，對GLP的提取和活性的研究甚少[8]。本文采用UCC輔助提取GLP，利用Box-Behnken試驗設計優(yōu)化提取條件，探究一種更高效、節(jié)能、省時的提取方法，并對優(yōu)化提取后的GLP體外抗氧化活性進行評價。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

番石榴葉：廣西省玉林市；苯酚、三氯乙酸（均為分析純）：上海吉至生化科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海麥克林生化科技有限公司；3，5-二硝基水楊酸（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；三氯化鐵（分析純）：天津索羅門生物科技有限公司；鐵氰化鉀（純度98%，分析純）：南京草木源生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

超聲波細胞粉碎機（JY92-ⅡN）：寧波新芝生物科技股份有限公司；電子天平（BSA124S）：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；立式冷藏柜（SC-242D）：青島海爾特種電冰柜有限公司；鼓風干燥箱（DZF-6050）：上海一恒科學儀器有限公司；搖擺式粉碎機（HK-04B）：廣州市旭朗機械設備公司；高速冷凍離心機（J-25）：美國BECKMAN公司；全波長酶標儀（MULTISKANGO）：美國Thermo公司；實驗室pH計（Delta320）：瑞士梅特勒-托利多公司；超凈臺（HF-safe900）：上海力申科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 GLP的前處理

將番石榴葉于65℃真空干燥箱烘干（2 h～3 h）至恒重，磨碎過80目篩，密封保存。對番石榴葉進行基本成分測定：水分含量測定參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》；灰分含量測定參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》；蛋白質含量測定參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》；粗脂肪含量測定參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準食品中粗脂肪的測定》[9]。

1.3.2 GLP提取工藝流程

GLP的提取采用UCC輔助水提醇沉進行提取。精確稱量番石榴葉粉末2.00 g，按照一定的料液比加入蒸餾水攪拌均勻，超聲波細胞破碎8 min，熱水浸提，3 000 r/min離心10 min，收集上清液，加入9倍體積無水乙醇攪拌均勻，4℃冰箱靜置12 h，3 000 r/min離心10 min棄去上清液收集沉淀，60℃烘干，加蒸餾水復溶定容到25 mL，采用苯酚-硫酸法測定GLP含量。

1.3.3 番石榴葉多糖含量測定和得率計算

采用苯酚-硫酸法[10]測定GLP含量：移取待測多糖溶液100 μL置于試管中，依次加入100 μL苯酚溶液（6%）、500 μL 硫酸迅速混勻，沸水浴 20 min，冷卻至室溫，采用酶標儀測定490 nm處OD值。測定不同濃度梯度葡萄糖標準溶液在490 nm處的OD值，以葡萄糖濃度為橫坐標，OD值為縱坐標繪制標準曲線，其回歸方程為y=0.001 9x+0.004 2，R2=0.999。結合標準曲線計算多糖得率，公式如下。

式中：C為根據(jù)葡萄糖標準曲線計算得到的多糖濃度，μg/mL；V為多糖溶液的體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為番石榴葉粉末質量，μg。

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1 料液比對GLP得率的影響

稱量2.00 g番石榴葉粉末，以料液比為變量，進行單因素試驗。固定提取溫度60℃，提取時間20 min，超聲功率 120 W，考察料液比 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）對 GLP 得率的影響。

1.3.4.2 提取溫度對GLP得率的影響

稱量2.00 g番石榴葉粉末，以提取溫度為變量，進行單因素試驗。固定料液比1∶15（g/mL），提取時間20 min，超聲功率 120 W，考察提取溫度 60、70、80、90、100℃對GLP得率的影響。

1.3.4.3 提取時間對GLP得率的影響

稱量2.00g番石榴葉粉末，以提取時間為變量，進行單因素試驗。固定料液比1∶15（g/mL），提取溫度 80℃，超聲功率 120 W，考察提取時間 10、15、20、25、30 min 對GLP得率的影響。

1.3.4.4 超聲功率對GLP得率的影響

稱量2.00g番石榴葉粉末，以超聲功率為變量，進行單因素試驗。固定料液比1∶15（g/mL），提取溫度80℃，提取時間 15 min，考察超聲功率 60、120、180、240、300 W對GLP得率的影響。

1.3.5 響應面試驗設計

以單因素試驗結果為基礎，根據(jù)Box-Benhnken中心組合設計三因素三水平的響應面試驗，研究各個變量以及各個變量的交互作用對GLP得率的影響，得出UCC輔助提取GLP的最優(yōu)工藝條件。

1.3.6 抗氧化試驗

1.3.6.1 ·OH清除能力測定

采用Fenton反應體系法[3，11]測定·OH清除能力：試管中加入多糖溶液0.1 mL，再依次加入0.1 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液，0.1 mL 6 mmol/L的過氧化氫溶液，1 mL 6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液，37℃水浴1 h，在510 nm處測定OD值記為A1。用蒸餾水代替樣品溶液測定OD值記為A0，用蒸餾水代替H2O2溶液測定OD值記為A2，按照公式（1）計算·OH清除率。

1.3.6.2 DPPH自由基清除能力測定

試管中加入多糖溶液0.2 mL，接著加入0.2 mL DPPH-乙醇溶液（0.2 mmol/L），渦旋儀混勻，暗處放置30 min，517 nm處測定OD值記為A1。用無水乙醇代替DPPH-乙醇溶液，測定OD值記為A2，并測定0.2 mL DPPH-乙醇溶液和0.2 mL無水乙醇混合液的OD值記為A0[3]。以無水乙醇為參比，以VC作為對照，DPPH自由基清除率按公式（2）計算。

1.3.6.3 總還原力測定

樣品總還原力的測定采用普魯士藍法[12]，具體操作參照楊露等[13]的方法：準確吸取0.10 mL多糖溶液置于試管中，依次加入0.25 mL磷酸鹽緩沖溶液（pH6.6，0.2 mol/L）和0.25 mL 1%鐵氰化鉀溶液，50℃水浴20 min，然后加入0.25 mL 10%三氯乙酸溶液終止反應。3 000 r/min離心10 min，取上清液0.25 mL，加0.25 mL無水乙醇和0.05 mL 0.1%FeCl3溶液，渦旋儀振蕩，700 nm處測定OD值，平行測定3次，以VC作為對照。OD值越大說明多糖的總還原力越強。

1.3.6.4 O2-·的清除能力測定

參照鄰苯三酚自氧化法[11]并稍作修改。取pH8.2的0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液0.3mL，加入樣品0.1mL，在25℃下恒溫20 min后，加入同樣25℃預溫的25 mmol/L鄰苯三酚0.04 mL，混勻后準確反應4 min，用0.05 mL的濃HCl終止反應，作為試驗組A1。以蒸餾水代替樣品，作為空白組A0。以同樣預溫為25℃的蒸餾水0.04mL代替鄰苯三酚溶液作為對照組A2。每組進行3組平行試驗，8 000 r/min，4℃，離心 3 min，325 nm 處測OD值。按公式（3）計算O2-·的清除率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組試驗重復3次，結果采用平均值±標準差表示；使用Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析并繪制圖表，使用Design-Expert 12進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 番石榴葉基本成分

番石榴葉基本成分測定結果如表1所示。

表1 番石榴葉基本組分分析Table 1 Basic components of guava leaves%

表1結果顯示番石榴葉中主要成分為碳水化合物。

2.2 單因素試驗

2.2.1 料液比對GLP得率的影響

料液比對GLP得率的影響結果如圖1所示。

圖1 料液比對GLP得率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the yield of guava leaf polysaccharide

由圖1可知，隨著溶劑用量的增加，GLP的得率先增加后減少，在料液比1∶15（g/mL）處得到最大值，GLP得率為（1.05±0.03）%。料液比為 1∶10（g/mL）的條件下，溶液濃度較高，溶質不能均勻分散在溶劑中，導致GLP得率較低；隨著溶劑用量的增加，多糖濃度較低，醇沉不完全從而影響GLP得率。因此，選擇料液比1∶10、1∶15、1∶20（g/mL）進行后續(xù)試驗。

2.2.2 提取溫度對GLP得率的影響

提取溫度對GLP得率的影響結果如圖2所示。

圖2 提取溫度對GLP得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of guava leaf polysaccharide

如圖2所示，隨著提取溫度的升高，GLP的得率先增加后減少，在80℃處達到最大值，GLP得率為（0.89±0.05）%。在60℃～80℃時，GLP得率增加的主要原因是隨著提取溫度不斷升高，溶液黏度逐漸減小，傳質速率越來越快，與此同時細胞破壞嚴重，番石榴葉細胞壁結構發(fā)生改變，變得疏松多孔，多糖更易溶出[7]；提取溫度超過80℃后，高溫破壞了多糖的結構，導致GLP得率降低。提取溫度對GLP得率影響相對較小，因此固定提取溫度為80℃。

2.2.3 提取時間對GLP得率的影響

提取時間對GLP得率的影響結果如圖3所示。

圖3 提取時間對GLP得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of guava leaf polysaccharide

如圖3所示，隨著提取時間的延長，GLP的得率先增加后減小，在15 min時達到最大值，GLP得率為（0.92±0.05）%。在 10 min～15 min時，隨著提取時間的延長，多糖逐步從細胞內溶出，GLP得率增加；隨著提取時間繼續(xù)延長，多糖分子中的五碳環(huán)或六碳環(huán)可能裂解成為可溶于乙醇的寡糖、低聚糖或單糖，造成多糖在醇沉過程中溶解損失增加[12]。因此，選擇提取時間10、15、20 min 進行后續(xù)試驗。

一線教師和科研人員大部分都有外出行業(yè)交流或出國深造之類的“放松”機會，而行政人員中80%表示從來沒有見過同校同行中有這種機會，高校也沒有組織過這種學習機會。

2.2.4 超聲功率對GLP得率的影響

超聲功率對GLP得率的影響結果如圖4所示。

圖4 超聲功率對GLP得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the yield of guava leaf polysaccharide

如圖4所示，隨著超聲功率的增加，GLP得率先增大后減小，在120 W時達到最大值，GLP得率為（0.96±0.03）%。這可能是由于超聲波產(chǎn)生的空化作用，加速破壞植物細胞壁，從而促進了傳質；但過高的超聲功率會導致多糖水解[6，13]，從而使GLP得率降低。因此，選擇超聲功率60、120、180 W進行后續(xù)試驗。

2.3 響應面試驗

2.3.1 模型方程的建立與顯著性檢驗

以單因素試驗結果為基礎，選擇料液比、提取時間和超聲功率這3個因素進行響應面試驗，通過Box-Benhnken法進行三因素三水平的響應面設計。因素和水平見表2，響應面試驗結果見表3。

表2 響應面試驗因素和水平Table 2 Factors and levels of response surface test

表3 響應面試驗結果Table 3 Results of response surface test

通過Design-Expert 12軟件對表3的數(shù)據(jù)進行分析，擬合得到料液比、超聲功率和提取時間對GLP得率的二元多次回歸方程：Y=1.98-0.291 1A+0.134 9B+0.143 1C-0.003 3AB+0.052 6AC+0.141 4BC-0.540 7A2-0.221 7B2-0.507 8C2。

方差分析結果見表4。

表4 回歸方程的顯著性和方差分析Table 4 Significance and variance analysis of regression equation

由表4可知，響應面回歸方程的模型是極顯著的，失擬項不顯著，說明模型的擬合性良好。A項、B項和C項P＜0.01，說明3個因素對GLP得率的影響均極顯著；BC項P＜0.05，說明超聲功率和提取時間的交互作用對GLP得率影響顯著；A2項、B2項和C2項P＜0.01，說明A2項、B2項和C2項對GLP得率影響極顯著。預測系數(shù)（R2=0.986 9）與調整系數(shù)（R2Adj=0.969 9）基本一致，說明本試驗擬合的模型與實際符合度高，誤差小，較易實現(xiàn)。F值大小體現(xiàn)了單個因素對GLP得率影響的大小，因此由F值可知，各因素對GLP得率的影響大小順序：A（料液比）＞C（提取時間）＞B（超聲功率）。

超聲功率與提取時間交互作用的響應面和等高線圖見圖5。

圖5 超聲功率與提取時間交互作用對GLP得率的影響Fig.5 Effect of interaction between ultrasonic power and extraction time on the yield of guava leaf polysaccharide

從圖5可以看出，超聲功率與提取時間交互作用的等高線圖呈現(xiàn)橢圓形，響應面圖坡度較為陡峭，說明超聲功率與提取時間的交互作用對GLP得率的影響顯著，與方差分析結果一致[14]。

通過響應面模型分析得知，GLP最優(yōu)提取工藝條件為料液比 1∶13.690（g/mL）、超聲功率 141.717 W、提取時間15.889 min?？紤]到實際操作情況，對提取工藝參數(shù)進行調整，最終的提取工藝條件：料液比1∶14（g/mL）、超聲功率140 W、提取時間16 min，經(jīng)驗證試驗，得到GLP得率為（2.00±0.08）%，與預測值[（1.99±0.06）%]相對誤差僅0.50%。

2.4 GLP體外抗氧化活性

2.4.1 ·OH清除能力

GLP和VC對·OH的清除率結果如圖6所示。

圖6 GLP和VC的·OH清除率Fig.6·OH scavenging rates of guava leaf polysaccharide and VC

如圖6所示，濃度為0.1 mg/mL～0.6 mg/mL時，GLP對·OH的清除率呈劑量依賴性升高，其中在0.5mg/mL～0.6 mg/mL時急劇升高。濃度為0.6 mg/mL時VC的·OH清除率為31.7%，GLP的·OH清除率為23.3%，說明GLP對·OH有很強的清除能力。經(jīng)計算，GLP對·OH清除能力的IC50值為12.155 mg/mL。

2.4.2 DPPH自由基清除能力

GLP和VC對DPPH自由基清除能力結果如圖7所示。

圖7 GLP和VC的DPPH自由基清除率Fig.7 DPPH·scavenging rates of guava leaf polysaccharide and VC

如圖7所示，樣品濃度為0.1 mg/mL～0.6 mg/mL時，隨著樣品濃度的升高，VC和GLP對DPPH自由基的清除率不斷地升高，GLP對DPPH自由基清除能力與VC相似，但是略低于VC。濃度為0.6 mg/mL時，VC的DPPH自由基清除率為75.96%，GLP為65.43%。GLP對DPPH自由基有較強的清除能力。經(jīng)計算，GLP對DPPH自由基清除能力的IC50值為0.261 mg/mL。

2.4.3 總還原力

GLP和VC的總還原力能力如圖8所示。

圖8 GLP和VC的總還原力Fig.8 Total reduction capacities of guava leaf polysaccharide and VC

如圖8所示，樣品濃度為0.2 mg/mL～1.2 mg/mL時，VC和GLP的總還原力隨樣品濃度的升高而增大，但是GLP的還原力明顯低于VC。隨著樣品濃度增加，VC和GLP總還原力的差值也隨之加大。結果表明，GLP具有良好的總還原能力，與羅游[7]的研究結果一致。

2.4.4 O2-·清除能力

GLP和VC對的O2-·清除能力如圖9所示。

圖9 GLP 和 VC的 O2－·清除率Fig.9 O2-·scavenging rates of guava leaf polysaccharide and VC

線粒體電子傳遞系統(tǒng)會產(chǎn)生O2-·，是一種初始弱自由基。與此同時，O2-·可能產(chǎn)生其他強自由基進而導致各種疾病的發(fā)生[15-16]。如圖11所示，樣品濃度為0.01 mg/mL～0.06 mg/mL 時，GLP 對 O2-·的清除率隨著濃度的升高而增大，總體呈現(xiàn)劑量依賴性升高。經(jīng)計算，GLP對O2-·清除能力的IC50值為0.660 mg/mL。

3 結論

本文通過單因素試驗和響應面試驗優(yōu)化GLP提取工藝，得到最優(yōu)工藝條件為料液比1∶14（g/mL），超聲功率140 W，提取時間16 min，此條件下，番石榴葉多糖得率可達（2.00±0.08）%。通過體外抗氧化試驗研究了最優(yōu)工藝提取的GLP的抗氧化活性。結果表明，0.6 mg/mL GLP對·OH 的清除率為（23.30±1.29）%，對DPPH自由基的清除率為（65.43±2.56）%；0.06 mg/mL GLP 對 O2-·的清除率為（22.30±1.53）%，并且具有較強的總還原力，隨著GLP濃度的升高，總還原力也隨之增強。本研究結果為番石榴葉多糖作為天然抗氧化劑的應用提供了參考依據(jù)。