鐘雨婷，張倩，姚姝婷，羅婭，明悅，李曉玲，劉璇，岳鑫，魏香奕，劉剛，李學(xué)理，3*

（1.成都醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610500；2.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610000；3.成都醫(yī)學(xué)院四川省動(dòng)物源性食品獸藥殘留防控技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610500）

二乙基亞硝胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）早在1987年就被世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）國(guó)際癌癥研究署（International Agency for Research on Cancer，IARC）列為 2A 致癌物[1]，一次大劑量攝入或長(zhǎng)期少量積累均可能引發(fā)癌癥[2]。研究證實(shí)，NDEA廣泛分布于水、環(huán)境、發(fā)酵食品及人體消化道，主要誘發(fā)肝臟組織病變和腫瘤[2-3]。因此，開展安全、高效降解NDEA相關(guān)研究迫在眉睫。

微生物降解法因具有高效、安全、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢(shì)而成為目前降解NDEA的研究熱點(diǎn)，其中備受關(guān)注的是乳酸菌。因?yàn)槿樗峋鞘称分谐Ｓ玫陌l(fā)酵劑，同時(shí)也具有改善腸道蠕動(dòng)、緩解便秘、治療腹瀉、抑制腸道致病菌等益生功能，可降解NDEA的乳酸菌不僅能豐富發(fā)酵食品風(fēng)味、延長(zhǎng)貨架期、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收、維持腸道微生態(tài)平衡，還能減除NDEA、降低患癌風(fēng)險(xiǎn)[4-5]。

目前，微生物降解NDEA研究偏重從發(fā)酵食品、人體腸道中分離和篩選乳酸菌，評(píng)價(jià)其降解能力。如Nowak等[6]發(fā)現(xiàn)3株來源于人體腸道的乳酸菌能有效降解NDEA。項(xiàng)目組前期獲得1株來源于健康人腸道的糞腸球菌（Enterococcus faecium，E.faecium）15A，能有效降解NDEA[7]。E.faecium是哺乳動(dòng)物腸道中重要的原籍乳酸菌[8]，應(yīng)用于肉制品發(fā)酵和益生菌劑的制備，具有改善肉品感官品質(zhì)、調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)、提高機(jī)體免疫力等功能[9]。

然而，乳酸菌降解NDEA的機(jī)理研究較少，降解作用的關(guān)鍵基因、調(diào)控蛋白、代謝通路等分子機(jī)制更未闡明。這勢(shì)必限制乳酸菌作為發(fā)酵劑、益生菌在食品產(chǎn)業(yè)中的開發(fā)與應(yīng)用。因此，本研究首先系統(tǒng)考察了不同環(huán)境中E.faecium 15A對(duì)NDEA的作用特性，基于作用特性結(jié)果，采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析了菌株降解的差異表達(dá)基因、代謝途徑，利用實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）技術(shù)驗(yàn)證關(guān)鍵的差異表達(dá)基因，從分子層面探究E.faecium 15A降解NDEA的機(jī)制，為利用E.faecium 15A有效清除NDEA提供支持。將E.faecium 15A制成菌劑和發(fā)酵劑，形成更安全的發(fā)酵乳、發(fā)酵肉、益生菌等產(chǎn)品，為減輕NDEA致癌性開辟新的膳食方案。研究結(jié)果可拓展乳酸菌的益生功能，開發(fā)具有更高保健價(jià)值的乳酸菌。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌種及試劑

二乙基亞硝胺（色譜純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；酵母粉：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；牛肉膏：北京路橋技術(shù)有限公司；葡萄糖、檸檬酸三銨、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫80（均為分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司；甲醇（色譜純）：上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司。試驗(yàn)菌株由四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供的健康人體腸道乳酸菌中分離純化和篩選所得，經(jīng)測(cè)序鑒定，最終確定為E.faecium 15A。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)（Centrifuge 5804R）：德國(guó)艾本德公司；全自動(dòng)高壓滅菌鍋（GI-54DWS）：上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司；數(shù)顯式臺(tái)式酸度計(jì)（雷磁PHSJ-4F）：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；高效液相色譜儀（Agilent1200）：美國(guó)安捷倫科技公司；紫外分光光度計(jì)（UV1102）：上海天美科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（HPX-9272MBE）：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；恒溫振蕩器（THZ-312）：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；超純水機(jī)（Ⅱ-5/10T）：四川優(yōu)普超純科技有限公司。

1.3 液體培養(yǎng)基的配制

液體培養(yǎng)基：4.0 g酵母粉、5.0 g牛肉粉、20.0 g葡萄糖、2.0 g檸檬酸三銨、5.0 g乙酸鈉、2.0 g磷酸氫二鉀、0.2 g硫酸鎂、0.05 g硫酸錳、1.0 mL吐溫80，用蒸餾水定容至1 L，pH值為6.0、121℃滅菌15 min～20 min。

1.4 NDEA的檢測(cè)

參考姜慧萍[10]檢測(cè)NDEA方法，并做一定修改。采用高效液相色譜法進(jìn)行試驗(yàn)，色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、檢測(cè)器為二極管陣列檢測(cè)器、檢測(cè)器波長(zhǎng)230 nm、流動(dòng)相為甲醇∶水（體積比）=35∶65、流速0.8 mL/min，取1 mL待測(cè)樣品用0.22 μm微孔濾膜過濾得濾液待檢。

1.5 環(huán)境因素對(duì)降解作用的影響

E.faecium 15A培養(yǎng)12h，離心后用無(wú)菌生理鹽水制得菌懸液（107cfu/mL）。將菌懸液接種于含4.75 μg/mL NDEA的液體培養(yǎng)基中，對(duì)照組用等體積無(wú)菌生理鹽水代替菌懸液。37 ℃分別培養(yǎng) 3、6、9 、12、24、48 h，取樣，考察培養(yǎng)時(shí)間的影響；分別于 4、20、37、42 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，考察溫度的影響；分別于培養(yǎng)基 pH 值為 2、3、4、5、6、7、8 的 37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)24 h，考察pH值的影響；分別于37℃的恒溫培養(yǎng)箱及恒溫厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。檢測(cè)樣品中NDEA降解率 [NDEA降解率/%=（對(duì)照組NDEA含量-處理組NDEA含量）/對(duì)照組NDEA含量×100]，以及微生物的生長(zhǎng)量（OD600）。

1.6 轉(zhuǎn)錄組分析

將制備好的E.faecium 15A菌懸液分別加入含4.75 μg/mL NDEA（處理組）和空白（對(duì)照組）的培養(yǎng)基中，在pH6、37℃、有氧條件下培養(yǎng)12 h，每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。進(jìn)行RNA的提取及質(zhì)量檢測(cè)、文庫(kù)構(gòu)建、通過Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序的轉(zhuǎn)錄組分析。

1.6.1 差異基因分析及功能注釋

基于負(fù)二項(xiàng)分布，對(duì)樣品進(jìn)行差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）的篩選[11]，閾值為 p＜0.05和｜log2（fold change）｜＞1。｜log2（fold change）｜值越大，表示差異倍數(shù)越大，若基因的log2（fold change）＞0，則認(rèn)為該DEGs上調(diào)，若log2（fold change）＜0，則認(rèn)為該DEGs下調(diào)[12]。

1.6.2 DEGs的富集分析

采用 GOseq[13]軟件和 KOBAS（2.0）軟件[14]分別基于基因分類數(shù)據(jù)庫(kù)（gene ontology，GO）、京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）對(duì)DEGs進(jìn)行功能注釋和生物通路分類，確定顯著差異基因或蛋白行使的主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1.7 RT-qPCR驗(yàn)證

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果，選擇5個(gè)基因進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

將E.faecium 15A菌懸液分別加入含4.75 μg/mL NDEA和空白的培養(yǎng)基中，在pH6和pH8、37℃、有氧條件下培養(yǎng)12h，進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系（20μL）：SYBR熒光定量PCRMix 5 μL，正反向引物各0.5 μL，cDNA 模板 1 μL，ddH2O 3 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃3 min、95 ℃ 10 s、58 ℃ 30 s、95 ℃ 10 s、40 循環(huán)；熔解曲線：以1℃/循環(huán)的速度升溫，60℃～95℃保持4 s。利用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果均為3次或多次試驗(yàn)的平均值，采用Origin－Pro 9.1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和制圖，所列結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。轉(zhuǎn)錄組分析時(shí)使用的是Bowtie2、HTSeq、DEGSeq、DESeq、GOSeq、hmmscan、KOBAS 軟件，Adobe Illustrator進(jìn)行圖片編輯處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 E.faecium 15A降解NDEA的作用特性

為明確E.faecium 15A降解NDEA的特性，首先考察了培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、pH值等環(huán)境因素對(duì)菌株生長(zhǎng)情況及降解NDEA作用的影響，結(jié)果如圖1所示。

從圖1可知，菌株降解NDEA的能力與其生長(zhǎng)情況變化趨勢(shì)一致：圖1A展示了E.faecium 15A降解NDEA作用和菌株生長(zhǎng)量隨培養(yǎng)時(shí)間的變化情況?？梢钥闯?，菌株在前12 h生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)12 h～48 h生長(zhǎng)量基本穩(wěn)定；菌株的生長(zhǎng)情況呈現(xiàn)出生長(zhǎng)曲線的常規(guī)變化趨勢(shì)，即隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌量先增加后趨于平穩(wěn)。同樣，受試菌株對(duì)NDEA的降解量表現(xiàn)出先增加后趨于穩(wěn)定的變化規(guī)律，此結(jié)果與受試菌株的生長(zhǎng)趨勢(shì)一致。當(dāng)E.faecium 15A培養(yǎng)12 h時(shí)，對(duì)NDEA的降解率為30.03%，隨后，該菌株的降解率變化不明顯。

由圖1B可知，E.faecium 15A降解作用和菌株生長(zhǎng)情況隨溫度變化也呈現(xiàn)一致的規(guī)律：在4℃到37℃范圍內(nèi)，菌株的生長(zhǎng)量和對(duì)NDEA的降解率隨溫度升高而逐漸升高，37℃時(shí)降解率達(dá)到最大值；在42℃的生長(zhǎng)量比37℃略有減少，對(duì)NDEA的降解作用也略有減弱。同樣，菌株在有氧條件下的生長(zhǎng)情況優(yōu)于厭氧培養(yǎng)，其對(duì)NDEA的降解作用比有氧環(huán)境中的作用更強(qiáng)（圖1C）。

環(huán)境的pH值對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖極為重要[15]。由圖1D可知，pH值的改變對(duì)受試菌株的生長(zhǎng)繁殖影響較大。E.faecium 15A在pH2～pH7范圍內(nèi)表現(xiàn)出降解NDEA作用，并且，降解作用和菌株生長(zhǎng)情況變化一致，在pH6環(huán)境中，菌株生長(zhǎng)量和降解能力最強(qiáng)。而在pH8環(huán)境中E.faecium 15A表現(xiàn)為促進(jìn)NDEA形成，說明pH值因素能改變E.faecium 15A對(duì)NDEA的作用特性。

結(jié)果表明，E.faecium 15A降解NDEA的能力和其生長(zhǎng)情況變化趨勢(shì)一致，推測(cè)菌株降解作用與其生長(zhǎng)代謝密切相關(guān)；培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、需/厭氧培養(yǎng)條件的改變，會(huì)影響菌株的降解能力，不會(huì)轉(zhuǎn)變菌株對(duì)NDEA的作用特性。而E.faecium 15A在pH2～pH7的環(huán)境中表現(xiàn)出降解NDEA的能力，在pH8的條件下轉(zhuǎn)變?yōu)榇龠M(jìn)NDEA的產(chǎn)生，可能是菌株在pH8和其它pH值條件下產(chǎn)生了差異蛋白，兩者轉(zhuǎn)錄途徑不同?；诖耍捎棉D(zhuǎn)錄組技術(shù)研究降解能力最強(qiáng)的條件下（pH6、37 ℃、有氧、12 h、4.75 μg/mL NDEA）和對(duì)照組（0 μg/mL NDEA）E.faecium 15A的差異表達(dá)基因及轉(zhuǎn)錄途徑，探究降解作用的關(guān)鍵基因和代謝通路。

2.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

2.2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估

用Illumina HiSeq平臺(tái)對(duì)試驗(yàn)樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序。對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行堿基測(cè)序錯(cuò)誤率、堿基含量分布的檢查，具體結(jié)果見表2。

表2 E.faecium 15A的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計(jì)Table 2 Quality statistics of transcriptome sequencing data of E.faecium 15A

Q20和Q30分別指質(zhì)量值大于20、30的堿基占總體堿基的百分比，若Q20大于等于90%，Q30大于等于80%，則認(rèn)為測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量可信。本次測(cè)序的堿基錯(cuò)誤率小于0.1%，Q20和Q30值均大于90%，處理組和對(duì)照組的平均GC含量分別為40.42%和40.15%，各項(xiàng)參數(shù)都達(dá)到測(cè)序質(zhì)量的要求。表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)數(shù)量和質(zhì)量可信度較高，可進(jìn)行后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

2.2.2 DEGs分析

比較降解能力最強(qiáng)的條件下（pH6、37℃、有氧、12 h、4.75 μg/mL NDEA）E.faecium 15A 和對(duì)照組（0 μg/mL NDEA）的 DEGs，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，兩者共有271個(gè)DEGs，其中92個(gè)基因上調(diào)、179個(gè)基因下調(diào)。

2.2.3 GO富集分析

GO是國(guó)際基因功能分類標(biāo)準(zhǔn)體系，包括分子功能、生物過程和細(xì)胞組成3個(gè)部分，GO數(shù)據(jù)庫(kù)可以對(duì)DEGs進(jìn)行功能分類和富集分析。以矯正后的p＜0.05為評(píng)判指標(biāo)，篩選出GO富集最顯著的前30條通路進(jìn)行作圖分析，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，有機(jī)氮化合物代謝過程、小分子代謝過程、有機(jī)氮化合物生物合成過程、嘌呤-核苷酸物質(zhì)合成/代謝通路的DEGs富集最顯著且數(shù)目較大，其DEGs數(shù)目分別是 63、47、44、145個(gè)。GO 富集最顯著的前30條通路中，以嘌呤-核苷酸物質(zhì)合成/代謝的通路數(shù)量最多（圖3中13條紅色條帶）。

2.2.4 KEGG富集分析

KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)可用于系統(tǒng)分析基因功能和基因組信息，幫助研究人員將基因與表達(dá)信息看作一個(gè)整體網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析研究，其結(jié)果可用散點(diǎn)圖表示。E.faecium 15A的DEGs基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析的結(jié)果見圖4。

如圖4所示，表示富集程度的指標(biāo)包括富集分?jǐn)?shù)、q值及富集到此通路上的基因數(shù)量。其中，富集分?jǐn)?shù)表示該通路中富集的DEGs數(shù)量與注釋基因數(shù)量的比值，比值越大表示富集程度越高；q值是校正后的p值，取值范圍為0～1，若數(shù)值越接近0，表示富集越顯著，由圖4中散點(diǎn)的顏色表示，顏色越接近紅色表示富集越顯著；散點(diǎn)的大小表示該通路中的DEGs數(shù)量，越大表示DEGs數(shù)量越多。綜合富集程度指標(biāo)可知，DEGs主要富集在遺傳信息處理中的RNA聚合酶合成、能量代謝中的氧化磷酸化、細(xì)胞過程中的群體感應(yīng)、代謝中的嘌呤代謝途徑中。

2.3 RT-qPCR驗(yàn)證

轉(zhuǎn)錄組結(jié)果表明，E.faecium 15A對(duì)NDEA的降解過程是一個(gè)多基因靶點(diǎn)、涉及多代謝通路的過程，GO和KEGG分析結(jié)果均說明嘌呤合成/代謝通路可能為主要的作用靶點(diǎn)通路?；冢黮og2（Fold Change）｜和p值、基因是否存在意義的篩選條件確定DEGs（hpt、xpt、Pyk、Ndk、guaA），并采用 RT-qPCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（ribonucleic acid-sequenceing，RNA-seq） 結(jié)果的準(zhǔn)確性，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，RT-qPCR檢測(cè)的差異基因的表達(dá)趨勢(shì)與 RNA-seq 結(jié)果一致：hpt、xpt、Pyk、Ndk 基因上調(diào)，基因guaA表現(xiàn)為下調(diào)。進(jìn)一步對(duì)比E.faecium 15A在降解作用最強(qiáng)的條件（pH6）與pH8環(huán)境下（促進(jìn)作用）的上述基因表達(dá)變化。結(jié)果表明，E.faecium 15A降解能力與嘌呤-核苷酸物質(zhì)合成/代謝途徑相關(guān)的基因hpt、xpt、Pyk、Ndk、guaA 相關(guān)。

3 討論

目前研究認(rèn)為，乳酸菌降解NDEA的能力與其生長(zhǎng)代謝的強(qiáng)度呈正相關(guān)[9-10，15-18]。例如，Kim 等[16-17]先后從韓國(guó)泡菜中分離出能降解NDEA的清酒乳桿菌、植物乳桿菌和明串珠菌，發(fā)現(xiàn)乳酸菌對(duì)NDEA的降解能力與菌株生長(zhǎng)情況密切相關(guān)。這與本文的試驗(yàn)結(jié)果一致：處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的E.faecium 15A對(duì)NDEA的降解作用最強(qiáng)，乳酸菌的降解能力可能與活菌的數(shù)量有關(guān)[9-13，15]。

溫度、培養(yǎng)時(shí)間、氧氣含量、pH值等環(huán)境因素影響菌株的生長(zhǎng)情況、降解NDEA的能力，證實(shí)了乳酸菌降解NDEA能力主要與菌株生長(zhǎng)情況正相關(guān)。E.faecium 15A在最適生長(zhǎng)溫度37℃環(huán)境中，對(duì)NDEA的降解能力最強(qiáng)。菌株在4℃（食品貯存溫度）、20℃（室溫）、42℃生長(zhǎng)量相對(duì)較少，因此，展現(xiàn)出相對(duì)較弱的降解作用。E.faecium 15A在有氧環(huán)境中生長(zhǎng)情況、降解作用均強(qiáng)于厭氧環(huán)境（模擬發(fā)酵食品內(nèi)部環(huán)境）。環(huán)境的pH值能改變E.faecium 15A對(duì)NDEA的作用特性，pH2、pH4、pH6、pH7 條件下，E.faecium 15A 發(fā)揮對(duì)NDEA的降解作用，而pH8環(huán)境中，E.faecium 15A表現(xiàn)為促進(jìn)NDEA形成。這與課題組前期的發(fā)現(xiàn)一致：環(huán)境pH值對(duì)亞硝胺的產(chǎn)生影響最顯著[15]。因此，為探究E.faecium 15A降解NDEA的機(jī)制，本文基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)探究E.faecium 15A降解能力最強(qiáng)的條件下（pH6、37℃、有氧、12h、4.75 μg/mL NDEA）的 DEGs，并采用RT-qPCR驗(yàn)證。同時(shí)，利用RT-qPCR對(duì)比pH8環(huán)境下E.faecium15A發(fā)揮促進(jìn)作用時(shí)的相關(guān)基因表達(dá)量，以期獲得菌株降解NDEA的轉(zhuǎn)錄途徑和關(guān)鍵基因。

KEGG分析表明，DEGs富集在遺傳信息處理中的RNA聚合酶、能量代謝中的氧化磷酸化、細(xì)胞過程中的群體感應(yīng)、代謝中的嘌呤代謝途徑。GO分析結(jié)果說明，該菌株的DEGs聚類在有機(jī)氮化合物代謝過程、小分子代謝過程、有機(jī)氮化合物生物合成過程、嘌呤-核苷合成/代謝的生物過程通路。其中，嘌呤-核苷合成/代謝過程的通路數(shù)量和差異基因數(shù)最多，其DEGs為xpt、hpt、Pyk、Ndk 和 guaA。

xpt、是腸球菌的看家基因，其進(jìn)化速率相對(duì)較慢，具有高保守性和分辨率，xpt、負(fù)責(zé)調(diào)控黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)生[18-19]；hpt與次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶有關(guān)，此酶是嘌呤回收途徑中的關(guān)鍵酶，能催化5-磷酸核糖基-α-1-焦磷酸酯向次黃嘌呤或鳥嘌呤的轉(zhuǎn)移，生成次黃嘌呤核苷酸（inosine monphosphate，IMP）或鳥嘌呤核苷酸（guanosine monophosphate，GMP）[20]。而guaA編碼谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，在嘌呤核苷酸代謝途徑中促進(jìn)黃嘌呤核苷酸（xanthosine monophosphate，XMP）轉(zhuǎn)化為GMP[21-22]。PyK編碼的丙酮酸激酶，可催化磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化為腺嘌呤三核苷酸磷酸（adenosine triphosphate，ATP）和丙酮酸，是糖酵解過程中一個(gè)關(guān)鍵的限速酶，與ATP、GMP的生物合成有關(guān)，能將IMP轉(zhuǎn)化為ATP、腺嘌呤二核苷酸磷酸（adenosine diphosphate，ADP）、鳥嘌呤三核苷酸磷酸（guanosine diphosphate，GTP）、鳥嘌呤二核苷酸磷酸（guanosine diphosphate，GDP）。Ndk與核苷二磷酸激酶密切相關(guān)，它是調(diào)節(jié)核酸代謝的重要激酶，催化ATP和核苷二磷酸（nucleoside diphosphate，NDP）之間磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移，有NDP激酶活性、蛋白磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，可以參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[23]。

上述基因都編碼酶的產(chǎn)生，這些酶很可能參與降解NDEA或者是降解NDEA的關(guān)鍵蛋白[6，21]。Nowak[6]推測(cè)，乳酸菌降解NDEA的作用主要依靠菌株生長(zhǎng)產(chǎn)生的某種關(guān)鍵組分，其能與NDEA結(jié)合并使之降解。Xiao等[24-25]獲得具有降解亞硝胺作用的戊糖乳桿菌（Lactobacillus.pentosus）R3。比較 L.pentosus R3 全菌體、無(wú)細(xì)胞上清液、細(xì)胞碎片、胞內(nèi)提取液各部分對(duì)NDEA的降解能力后，發(fā)現(xiàn)L.pentosus R3降解作用的關(guān)鍵組分位于細(xì)胞碎片懸液中，通過分離和質(zhì)譜鑒定確定細(xì)胞碎片中的作用物質(zhì)多為表層蛋白質(zhì)。此蛋白可能就是位于細(xì)胞膜或細(xì)胞壁上的降解酶。

對(duì)比RT-qPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)E.faecium 15A在降解能力最強(qiáng)的pH6條件下，嘌呤合成/代謝途徑的相關(guān)基因xpt、Pyk、Ndk均上調(diào)，這些基因在菌株展現(xiàn)促進(jìn)作用的環(huán)境（pH8）均下調(diào)。因此，推測(cè)這些基因參與編碼的嘌呤合成/代謝酶可能是E.faecium 15A發(fā)揮降解NDEA作用的酶，或者這些酶是降解作用的關(guān)鍵蛋白，其合成或代謝的嘌呤可能為降解作用關(guān)鍵蛋白合成的前體物。所以，嘌呤合成/代謝途徑可能為E.faecium 15A降解NDEA的主要作用通路。

4 結(jié)論

本研究考察了環(huán)境因素對(duì)E.faecium 15A降解NDEA作用特性的影響。菌株降解作用與其生長(zhǎng)情況相關(guān)，兩者變化趨勢(shì)一致，說明降解作用和菌株生長(zhǎng)相關(guān)。培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、需/厭氧培養(yǎng)條件的改變會(huì)影響菌株的降解能力，不會(huì)轉(zhuǎn)變菌株對(duì)NDEA的作用特性。不同pH值環(huán)境下，菌株可能表現(xiàn)為降解NDEA或促進(jìn)NDEA生成的作用。這可能由于E.faecium 15A對(duì)NDEA的作用過程是一個(gè)多基因靶點(diǎn)、涉及多代謝通路的過程，其中嘌呤合成/代謝途徑或?yàn)橹饕饔冒悬c(diǎn)通路。經(jīng)RT-qPCR與RNA-seq結(jié)果對(duì)比，獲得了與降解作用的相關(guān)基因（xpt、hpt、Pyk、Ndk、guaA）。研究結(jié)果從分子層面探究了E.faecium 15A降解NDEA的機(jī)制，為利用E.faecium 15A有效清除NDEA提供理論支持。