黃 剛，金 剛

（1.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021；2.寧夏大學(xué) 食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏銀川 750021）

乳酸菌經(jīng)過(guò)增殖培養(yǎng)、濃縮分離后，與適量的保護(hù)劑進(jìn)行混合制成菌懸液，再經(jīng)干燥處理可制成乳酸菌發(fā)酵劑。目前，常用的干燥方法有烘干、噴霧干燥、真空冷凍干燥等。其中，真空冷凍干燥是目前對(duì)菌體保藏效果最好、保藏時(shí)間最長(zhǎng)的一種乳酸菌發(fā)酵劑制備技術(shù)，該技術(shù)可以保持菌體的生理生化特性和生物活性。然而，真空冷凍干燥過(guò)程中也會(huì)導(dǎo)致乳酸菌活力下降甚至死亡。國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)有關(guān)乳酸菌在真空冷凍干燥過(guò)程中的損傷機(jī)制做了大量研究，發(fā)現(xiàn)乳酸菌在真空冷凍干燥后造成菌體存活率以及發(fā)酵活力降低的主要原因包括冷凍干燥過(guò)程造成細(xì)胞膜通透性改變、細(xì)胞完整性被破壞、細(xì)胞酶及相關(guān)蛋白變性和核糖核酸結(jié)構(gòu)發(fā)生變化等[1]。

為了進(jìn)一步提高乳酸菌在真空冷凍干燥后的存活率和儲(chǔ)藏期，本文對(duì)真空冷凍干燥原理以及影響乳酸菌凍干存活率的關(guān)鍵因素進(jìn)行了討論，以期為制備高活性和耐儲(chǔ)藏的乳酸菌發(fā)酵劑提供參考。

1 乳酸菌發(fā)酵劑概況

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，1988 年丹麥漢森中心實(shí)驗(yàn)室成功研制了直投式乳酸菌發(fā)酵劑，在此之前液體發(fā)酵劑使用了數(shù)十年。與液體發(fā)酵劑相比，直投式乳酸菌發(fā)酵劑具有活菌數(shù)高（109～1012CFU/g）、保質(zhì)期長(zhǎng)、接種量少和產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等特點(diǎn)，且不需要進(jìn)行活化、擴(kuò)培等處理，可直接應(yīng)用于生產(chǎn)，大大提高了勞動(dòng)生產(chǎn)力與產(chǎn)品質(zhì)量。

目前，我國(guó)對(duì)真空冷凍干燥的工藝應(yīng)用日漸成熟，但是由于菌種間的差異以及所使用凍干機(jī)的不同，還沒(méi)有一種通用的凍干方法來(lái)適應(yīng)于所有菌種。

2 真空冷凍干燥原理

乳酸菌菌液中水分是以自由水和結(jié)合水兩種方式存在，結(jié)合水以化學(xué)結(jié)合方式存在于菌液中。真空冷凍干燥采用了低溫低壓下的熱傳導(dǎo)機(jī)理，當(dāng)壓強(qiáng)低于610.5 Pa 時(shí)，不管溫度如何變化，只有固態(tài)和氣態(tài)，所以在此條件下升高溫度或者降低壓強(qiáng)都可以打破兩相平衡，使整個(gè)系統(tǒng)朝著冰轉(zhuǎn)換成水蒸氣的方向發(fā)展，即將菌液中的固態(tài)冰直接轉(zhuǎn)換為水蒸氣的干燥過(guò)程。

整個(gè)真空冷凍干燥過(guò)程主要分3 個(gè)階段完成，預(yù)凍→升華干燥（一次干燥）→解析干燥（二次干燥）[2]。

3 真空冷凍干燥對(duì)菌體造成的損傷

真空冷凍干燥主要分為冷凍和干燥兩個(gè)過(guò)程，冷凍對(duì)菌體造成的傷害主要表現(xiàn)為細(xì)胞的滲透失水和冰晶的形成，干燥對(duì)菌體的傷害主要表現(xiàn)在細(xì)胞的過(guò)度失水。在真空冷凍干燥過(guò)程中對(duì)乳酸菌的細(xì)胞損傷主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。

3.1 機(jī)械損傷

在真空冷凍干燥過(guò)程中，由于快速降溫，細(xì)胞內(nèi)外形成結(jié)晶，產(chǎn)生機(jī)械力，從而導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)機(jī)械損傷。一般結(jié)晶形成的冰晶越大，細(xì)胞膜越容易破裂，從而造成細(xì)胞的死亡；冰晶越小對(duì)細(xì)胞的損傷也就越小。通常認(rèn)為降溫速率的大小影響著冰晶的大小，從而影響著細(xì)胞是否會(huì)受到損傷。許多研究者認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶是在快速降溫時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞損傷的主要原因[3]。

3.2 溶質(zhì)損傷

在真空冷凍干燥過(guò)程中，由于細(xì)胞內(nèi)所含水分的凍結(jié)使細(xì)胞間隙間的溶液逐漸濃縮，從而使電解質(zhì)的濃度顯著增加。細(xì)胞內(nèi)外由于滲透壓的存在導(dǎo)致細(xì)胞脫水，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)對(duì)高濃度的電解質(zhì)極為敏感，容易造成蛋白質(zhì)的變性，進(jìn)而使其喪失應(yīng)有的功能，增加了細(xì)胞的死亡率。

3.3 細(xì)胞膜損傷

細(xì)胞膜的損傷被認(rèn)為是菌體在真空冷凍干燥過(guò)程中失活的主要表現(xiàn)，另有研究表明細(xì)胞膜的損傷主要發(fā)生在干燥階段[4]。微生物的干燥損傷很大程度上是由于膜脂性質(zhì)、結(jié)構(gòu)的變化使膜的流動(dòng)性或完整性改變，導(dǎo)致細(xì)胞膜的功能失調(diào)，從而影響微生物的生命活動(dòng)。

3.4 胞內(nèi)酶失活

乳酸菌在真空冷凍干燥過(guò)程中，一些細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵酶會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能的改變，從而使整個(gè)細(xì)胞代謝紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。例如，乳酸脫氫酶、三磷酸腺苷酶、β-半乳糖苷酶在真空冷凍干燥時(shí)會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)與功能的改變[5]。

3.5 DNA 損傷

DNA 損傷也是凍干過(guò)程中造成菌體損傷的主要原因之一。有學(xué)者在真空冷凍干燥瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）時(shí)發(fā)現(xiàn)了DNA 和RNA 的改變。DNA 一旦產(chǎn)生損傷，在其修復(fù)過(guò)程中就會(huì)容易產(chǎn)生錯(cuò)誤，導(dǎo)致突變體的增加[6]。

4 影響乳酸菌冷凍干燥存活率的因素

4.1 菌體的收集時(shí)期

在乳酸菌生長(zhǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基的環(huán)境會(huì)發(fā)生改變，如pH 降低、代謝物的產(chǎn)生、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗等，為了獲得更高的活菌數(shù)，必須及時(shí)將菌體從培養(yǎng)基中離心收集，從生理狀態(tài)上來(lái)講有利于提高凍干后菌體的存活率和初始菌體的活菌數(shù)，而收集過(guò)程中直接影響菌體活性的則是菌體的菌齡。ZHANG 等[7]對(duì)酒類(lèi)酒球菌（Oenococcus oeni）SD-2a 冷凍干燥后發(fā)現(xiàn)，在穩(wěn)定期早期收集菌體比對(duì)數(shù)中期的存活率更高。

4.2 乳酸菌的應(yīng)激反應(yīng)

李寶坤[8]在羅伊氏乳酸桿菌（Lactobacillus reuteri）CICC6226 真空冷凍干燥過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)冷應(yīng)激和熱應(yīng)激都提高了L. reuteriCICC6226 凍干后的存活率。以上研究表明，在真空冷凍干燥前對(duì)乳酸菌進(jìn)行一定的應(yīng)激處理可以提高乳酸菌在凍干后的存活率和耐儲(chǔ)存性，例如冷應(yīng)激、熱應(yīng)激、酸應(yīng)激，這些應(yīng)激反應(yīng)可以使細(xì)胞對(duì)不利條件提前做出反應(yīng)，產(chǎn)生應(yīng)激蛋白、改變細(xì)胞膜脂肪酸的組成以及相容溶質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)或合成，從而提高乳酸菌對(duì)不利條件的抵抗力[9]。

4.3 凍干保護(hù)劑及其保護(hù)機(jī)理

在真空冷凍干燥過(guò)程中，難以避免乳酸菌的損傷，可以通過(guò)外源添加保護(hù)劑的方式來(lái)提高乳酸菌凍干后的存活率和儲(chǔ)藏時(shí)間[10]。乳酸菌的凍干保護(hù)劑按照能否進(jìn)入細(xì)胞可以分為滲透型和非滲透型兩類(lèi)。滲透型保護(hù)劑因?yàn)槟軌蜻M(jìn)入細(xì)胞與溶液中的水分子結(jié)合，從而發(fā)生水合作用，使細(xì)胞黏稠性增加，在凍干過(guò)程中溫度降低，溶液中冰晶的形成速率因此減慢，一定程度上降低了水轉(zhuǎn)換為冰晶的比例，從而減少了細(xì)胞外溶質(zhì)濃度升高所造成的細(xì)胞損傷；非滲透型保護(hù)劑不能透過(guò)細(xì)胞膜，常常包裹在細(xì)胞表面，降低了溶液形成冰晶的速率，在特定的溫度下可以降低細(xì)胞外溶質(zhì)的濃度，從而避免了在凍干過(guò)程中由于鹽類(lèi)濃縮，使細(xì)胞失水而導(dǎo)致的菌體滲透性休克、細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的塌陷、蛋白質(zhì)變性等不良問(wèn)題。

4.4 凍干后乳酸菌含水量對(duì)其存活率及儲(chǔ)藏期的影響

脫水程度的增加會(huì)造成乳酸菌蛋白質(zhì)損傷和存活率下降，所以應(yīng)該保留一部分水分來(lái)維持細(xì)胞的休眠狀態(tài)。目前有研究表明，乳酸菌冷凍干燥過(guò)程中，殘余的水分質(zhì)量在2%～3%對(duì)于維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和胞內(nèi)大分子穩(wěn)定性是必要的，菌體的相對(duì)存活率較高、儲(chǔ)藏期較長(zhǎng)[11]。

5 討論與展望

影響乳酸菌真空冷凍干燥后存活率的因素是多方面的。①菌種的自身因素，因種、屬的差異而不同，如鏈球菌屬抗冷凍干燥能力較強(qiáng)，而明串菌屬對(duì)冷凍干燥的抵抗力較差；嗜冷微生物要比嗜熱微生物更加抗凍。②合理的凍干程序設(shè)定也非常重要，在真空冷凍干燥過(guò)程中存在兩個(gè)最大冰晶的生成帶，即-3.7 ～0 ℃和-37.4 ～-30.0 ℃，快速通過(guò)冰晶生成帶可以減少菌體的冷凍損傷[12]。為了提高乳酸菌凍干后的存活率，常常使用保護(hù)劑，保護(hù)劑可以維持乳酸菌凍干后的生物活性和生理狀態(tài)，通常復(fù)配使用效果更好。

綜上分析，要提高乳酸菌的凍干存活率和儲(chǔ)藏期，需要從兩個(gè)方面進(jìn)行深入研究：①根據(jù)菌種特性以及真空冷凍干燥損傷機(jī)制設(shè)置合理的凍干程序；②篩選高效合理的凍干保護(hù)劑和復(fù)水溶劑，既要保證菌體的存活率和活性，也要降低成本。