李仁強， 羅俊峰， 陳云弟

（上海閱爾基因技術(shù)有限公司技術(shù)研發(fā)部，上海 200433）

地中海貧血（簡稱地貧）是由于珠蛋白基因發(fā)生缺陷，導(dǎo)致1種或幾種珠蛋白肽鏈不能合成或合成減少，鏈結(jié)構(gòu)正常但比例失衡的遺傳性溶血性血紅蛋白病。地貧是常見的遺傳病，主要分布于地中海、中東、印度、東南亞和非洲地區(qū)，全球地貧基因攜帶者近2億[1-2]。地貧也是我國南方地區(qū)常見的、危害較大的遺傳病之一，其臨床異質(zhì)性較大，從無臨床表現(xiàn)到嚴(yán)重貧血，甚至死亡；尤其是β-地貧，患兒一般不會在出生時或出生后很快出現(xiàn)貧血等臨床表現(xiàn)。準(zhǔn)確、有效的基因檢測技術(shù)對于地貧的及時診斷至關(guān)重要。本研究擬建立一種基于異尾雙鏈熒光探針技術(shù)的新的檢測方法，通過3管反應(yīng)即可檢測常見的3種α-地貧非缺失突變和8種β-地貧點突變，同時對該方法的檢測性能進(jìn)行評價。

1 材料和方法

1.1 樣本制備

從UCSC數(shù)據(jù)庫（http：//genome.ucsc.edu/）獲取α-地貧基因簇和β-地貧基因簇序列[3]，從人類血紅蛋白數(shù)據(jù)庫（https：//globin.bx.psu.edu/hbvar/）[4]獲取α-地貧點突變和β-地貧點突變序列，并據(jù)此設(shè)計突變型質(zhì)粒，將質(zhì)粒干粉[生工生物工程（上海）股份有限公司]進(jìn)行離心處理后，用TE緩沖液梯度稀釋至2 000拷貝/μL。將正常樣本基因組DNA（上海閱爾基因技術(shù)有限公司）稀釋至7 ng/μL（約2 000拷貝/μL）。將突變型質(zhì)粒與正常樣本基因組DNA按1∶1（V∶V）混合，獲得模擬雜合突變樣本。

每套地貧核酸檢測國家參考品（貨號360014-201701，中國食品藥品檢定研究院）為32份，其中29份為點突變、缺失突變參考品，3份為無突變正常參考品。

在上海閱爾基因技術(shù)有限公司樣本庫中選取已知地貧基因型的臨床樣本200份，采用核酸提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取樣本DNA，用NanoDrop 2000分光光度計（美國ThermoFisher Scientific公司）測定DNA濃度和純度，嚴(yán)格按試劑盒說明書要求操作。

1.2 異尾雙鏈熒光探針法的實驗設(shè)計

1.2.1 異尾雙鏈熒光探針構(gòu)建 本研究使用的異尾雙鏈熒光探針由熒光探針鏈和淬滅探針鏈組成[5]，熒光探針鏈5'端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記阻止延伸的基團(tuán)，熒光探針鏈由5'端非同源序列區(qū)域和3'端模板互補區(qū)域組成；淬滅探針鏈序列和熒光探針鏈序列完全反向互補，在3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)。

1.2.2 基本原理 當(dāng)反應(yīng)體系中不存在模板DNA時，熒光探針鏈與淬滅探針鏈堿基互補配對結(jié)合，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)之間形成非熒光復(fù)合物，二者通過氫鍵以質(zhì)子偶聯(lián)的電子轉(zhuǎn)移相互作用，熒光基團(tuán)由此被淬滅。檢測樣本時，首先通過不對稱聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增產(chǎn)生大量單鏈DNA片段；然后將反應(yīng)體系升溫至95 ℃，熒光探針鏈與淬滅探針鏈?zhǔn)軣岱蛛x，成為單鏈游離狀態(tài)；隨后降溫至40 ℃，熒光探針鏈與單鏈DNA模板特異性雜交，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)脫離接觸發(fā)出熒光。見圖1。

圖1 異尾雙鏈熒光探針法點突變檢測原理示意圖

1.3 方法

采用Primer Premier軟件設(shè)計PCR引物和異尾雙鏈熒光探針，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并純化。熒光探針、淬滅探針序列及多重PCR分管見表1。PCR反應(yīng)體系：總體積為25 μL，5×GoldStar PCR Master Mix（江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司）5 μL，熒光探針或淬滅探針各0.1 μL，引物各0.2 μL，模板DNA 2 μL，用無酶水補足反應(yīng)體積。根據(jù)熒光探針或淬滅探針的濃度（10、20、50 nmol/L）和引物的濃度（50、200、1 000 mol/L）構(gòu)建不同的反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：40 ℃保溫8 min，采集各熒光通道信號值；95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，50個循環(huán)；95 ℃變性5 min，40 ℃保溫20 min，每分鐘檢測各通道熒光信號值。檢測儀器為ABI 7500熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

表1 引物探針序列和多重PCR的分管

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 孔間校正 每份樣本分別進(jìn)行3管反應(yīng)，記錄最后1個循環(huán)各通道熒光強度（F）和對應(yīng)通道空白對照的熒光強度（F0），F(xiàn)AM/VIC/NED/CY5通道熒光強度和ROX通道熒光強度的商即為校正的樣本熒光強度（Fn）和空白對照的熒光強度（Fn0）。

1.4.2 熒光背景校正 以Fn0作為熒光背景，計算樣本熒光強度凈增量（ΔFn），計算公式為：ΔFn=Fn-Fn0。

1.4.3 熒光強度凈增量計算 計算待測樣本與對應(yīng)通道野生型的熒光強度凈增量差值ΔΔFn，ΔΔFn=ΔFn樣本-ΔFn野生型。

1.4.4 閾值設(shè)置 檢測突變位點陽性臨床樣本，計算突變位點目標(biāo)熒光凈增量差值ΔΔFn的均值ΔΔF，熒光閾值=ΔFn野生型+ΔΔF/2。

1.4.5 結(jié)果判定 實際檢測時將待測樣本與野生型樣本、空白對照同時檢測，待測樣本扣除野生型樣本得到ΔΔFn值，比較ΔΔFn值與熒光閾值判定點突變。

1.5 方法性能評價

1.5.1 準(zhǔn)確性和特異性 將全套地貧核酸檢測國家參考品按說明書要求進(jìn)行檢測。（1）準(zhǔn)確性：本方法檢測范圍內(nèi)的國家陽性參考品的結(jié)果應(yīng)為相應(yīng)基因型別；（2）特異性：國家陰性參考品和本方法檢測范圍外的國家陽性參考品的結(jié)果應(yīng)為未檢出突變。

1.5.2 靈敏度 選擇常見的非缺失α-地貧突變型與β-地貧基因點突變型（Hb CS、CD41/42、IVS-II-654）參考品梯度稀釋至1.0、2.5、5.0、10.0 ng/μL，每份樣本檢測3次。

1.5.3 方法比較 將異尾雙鏈熒光探針法與PCR-反向點雜交法[試劑盒購自亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司]同時檢測200份已知地貧基因型的臨床樣本，評估臨床標(biāo)本檢測的準(zhǔn)確性與特異性。2種方法結(jié)果不一致的樣本采用測序法確認(rèn)。

2 結(jié)果

2.1 異尾雙鏈熒光探針法的建立與評估

按照設(shè)計方案（圖2），建立多重不對稱PCR及異尾雙鏈熒光探針雜交的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件并進(jìn)行評估、優(yōu)化。檢測過程：首先通過多重不對稱PCR產(chǎn)生大量單鏈DNA片段；PCR反應(yīng)結(jié)束后，熒光標(biāo)記探針與單鏈DNA雜交，通過熒光信號值判定點突變的有無及具體類型。

圖2 地貧基因點突變檢測方案

2.1.1 PCR反應(yīng)體系 使用基因組DNA樣本評估不對稱PCR擴增的特異性。使用人工合成單鏈DNA與異尾雙鏈熒光探針雜交，獲得可區(qū)分野生型與突變型模板的探針對。使用優(yōu)化的不對稱PCR與探針雜交體系檢測模擬雜合樣本，確定反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。PCR反應(yīng)產(chǎn)物見圖3。

圖3 多重不對稱PCR特異性擴增目標(biāo)區(qū)域單鏈DNA片段

2.1.2 熒光信號增量閾值確定 采用建立的異尾雙鏈熒光探針雜交法檢測臨床樣本，并對檢測結(jié)果進(jìn)行分析和計算，確定判定突變的熒光信號增量閾值。見表2、圖4。

表2 3管反應(yīng)檢測結(jié)果的解釋（ΔΔFn值）

圖4 3管反應(yīng)檢測11種突變樣本結(jié)果

2.2 異尾雙鏈熒光探針法的檢測性能評價

2.2.1 準(zhǔn)確性和特異性 按地貧核酸檢測國家參考品說明書要求，采用異尾雙鏈熒光探針雜交法檢測全套參考品。結(jié)果顯示，對于檢測范圍內(nèi)的11種點突變樣本，異尾雙鏈熒光探針雜交法檢測結(jié)果與國家參考品說明書標(biāo)示的突變類型的符合率為100%；對檢測范圍外的其他點突變或缺失突變樣本，異尾雙鏈熒光探針雜交法均未檢出。見表3。

表3 國家參考品檢測結(jié)果

2.2.2 靈敏度 采用異尾雙鏈熒光探針雜交法檢測1.0、2.5、5.0、10.0 ng/μL的α-地貧Hb CS點突變參考品和β-地貧CD41/42、IVS-II-654點突變參考品，結(jié)果均與國家參考品說明書中提供的突變類型一致。

2.2.3 臨床樣本檢測 同時采用異尾雙鏈熒光探針雜交法和PCR-反向點雜交法檢測200份臨床樣本。結(jié)果顯示，異尾雙鏈熒光探針雜交法與PCR-反向點雜交法的符合率為100%。見表4。

表4 2種方法檢測臨床樣本的結(jié)果比較

3 討論

正常人每條16號染色體上有2個α-珠蛋白基因，即α1（HBA1）基因和α2（HBA2）基因，二者表達(dá)同一種產(chǎn)物α-珠蛋白鏈。正常情況下，α2基因較α1基因的功能更強，前者表達(dá)量為后者的2倍。α2與α1為高度同源基因，二者序列相似性約為94%，GC含量約為75%，編碼區(qū)序列完全一致，僅5'端非翻譯區(qū)與內(nèi)含子區(qū)域存在序列差異[1]。α-地貧基因簇同時存在α2、α1的同源基因HBZ和假基因HBZP1、HBM、HBQ1。中國人群常見的3種非缺失型α-地貧突變Hb WS、Hb QS和Hb CS均發(fā)生在HBA2基因編碼區(qū)[2]。與α-地貧類似，β-地貧基因HBB與HBD堿基序列高度相似，β-地貧基因簇上還存在HBG1、HBG2、HBE、HBBP1等同源基因或假基因。中國人群常見的β-地貧點突變均發(fā)生在HBB基因1號外顯子和2號外顯子區(qū)，該區(qū)域GC含量約為50%；其中，IVS-Ⅱ-654突變位于2號內(nèi)含子深處，該區(qū)域GC含量約為15%[2，6]。

目前，用于非缺失型α-地貧與β-地貧點突變檢測試劑盒主要采用PCR-反向點雜交法、多重?zé)晒馊劢馇€法[7]。PCR-反向點雜交法是一種較成熟的檢測技術(shù)，臨床應(yīng)用較廣泛，檢測過程包括PCR擴增與膜雜交顯色兩部分，可檢測常見點突變與缺失突變，其檢測過程耗時較長，包含大量繁瑣的手工操作，效率較低。此外，PCR產(chǎn)物開管檢測存在污染風(fēng)險。多重?zé)晒馊劢馇€法近年來逐漸被用于地貧突變檢測，該方法首先進(jìn)行PCR擴增獲得目標(biāo)片段，然后使用雙端標(biāo)記熒光探針或雙雜交熒光探針與目標(biāo)片段雜交，最后通過熔解曲線分析獲得熔點信息[8-10]。熒光熔解曲線法由于探針設(shè)計的特點，對于探針覆蓋范圍內(nèi)相鄰的突變位點，其熔點差異較小甚至存在熔點交叉，檢測結(jié)果只能判定含有2種突變中的一種，需要通過測序法才能鑒定出具體的突變類型。因此，開發(fā)一種能夠快速、簡單、準(zhǔn)確檢測非缺失型α-地貧與β-地貧點突變的方法具有重要的臨床意義。

為解決上述難題，本研究采用多重不對稱PCR結(jié)合異尾雙鏈熒光探針進(jìn)行檢測。具體設(shè)計如下：（1）所有PCR引物均設(shè)計為具有較高的Tm值（Tm＞70 ℃），PCR擴增時采用較高的退火和延伸溫度，一方面使變性的雙鏈DNA維持單鏈狀態(tài)以便與引物結(jié)合和延伸；另一方面，較高的退火溫度使引物與目標(biāo)區(qū)域特異性雜交，避免相似序列干擾。（2）利用單管反應(yīng)檢測多種點突變時，應(yīng)盡可能提高探針與目標(biāo)模板的雜交效率，盡可能降低探針與背景模板的雜交效率，從而獲得較高的信噪比。有研究發(fā)現(xiàn)，在微陣列芯片的探針雜交反應(yīng)中，單鏈DNA相比雙鏈DNA有著更高的雜交效率，可獲得更高的檢測靈敏度[11-12]。本研究采用多重不對稱PCR方式，3對引物分別擴增α2基因片段、β基因突變熱點區(qū)域以及IVS-Ⅱ-654區(qū)域，獲得目標(biāo)區(qū)域單鏈DNA片段。相對于熒光熔解曲線法，本研究使用的PCR反應(yīng)體系復(fù)雜度低，僅使用2條引物即可獲得目標(biāo)區(qū)域單鏈DNA片段，無需使用額外的嵌套引物或巢式引物[13]，僅需優(yōu)化每條PCR引物用量即可獲得大量單鏈DNA片段，為異尾雙鏈熒光探針雜交反應(yīng)提供充足的單鏈DNA模板，并產(chǎn)生更高的熒光信號，直接通過熒光信號值即可進(jìn)行結(jié)果判定，無需采用復(fù)雜的熔解曲線分析和熔點判斷[14]。（3）異尾雙鏈熒光探針的探針鏈被設(shè)計為較低的Tm值（60 ℃），淬滅探針鏈被設(shè)計為極低的Tm值（40 ℃），PCR過程中熒光探針鏈、淬滅探針鏈?zhǔn)軣峤怄?，由于探針Tm值顯著低于PCR的退火、延伸溫度，熒光探針鏈、淬滅探針鏈均處于游離狀態(tài)，避免了探針與DNA雜交導(dǎo)致的引物延伸受阻，以及Taq酶切割探針引起的PCR反應(yīng)前后探針總量變化。（4）由于異尾雙鏈熒光探針法通過熒光探針-模板特異性雜交與鏈置換反應(yīng)進(jìn)行檢測，探針設(shè)計具有極大的靈活性；本研究針對每個待檢測突變位點分別設(shè)計1對特異性的異尾雙鏈熒光探針；同時，參考中國人群非缺失α-地貧與β-地貧點突變復(fù)合發(fā)生的位點與頻率信息，將常見復(fù)合雜合位點設(shè)置在不同反應(yīng)管中[3]；通過熒光信號或熒光信號組合即可準(zhǔn)確判定突變類型，不受突變位點之間位置關(guān)系限制，也無需測序鑒定。與熒光熔解曲線法類似，本研究采用的異尾雙鏈熒光探針法為閉管反應(yīng)模式，只需加入DNA即可進(jìn)行PCR反應(yīng)與熒光檢測，整個檢測過程均由PCR儀在3 h內(nèi)完成，反應(yīng)結(jié)束后無需進(jìn)行開蓋處理，不存在PCR產(chǎn)物污染風(fēng)險。

地貧核酸檢測國家參考品作為國家體外診斷試劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，由中國人群常見的α-地貧缺失與非缺失突變、β-地貧缺失與非缺失型突變組成，用于地貧基因檢測試劑盒的性能評價。本研究按國家參考品說明書要求，采用異尾雙鏈熒光探針法進(jìn)行檢測，結(jié)果表明：（1）點突變型樣本，包括單堿基替換、單堿基插入與多堿基插入等變異類型，均被準(zhǔn)確檢出，不存在假陰性或非特異性結(jié)果；（2）正常樣本、缺失樣本檢測結(jié)果均為陰性，不存在假陽性結(jié)果；（3）異尾雙鏈熒光探針法檢測限為1 ng/μL，低于國家參考品說明書要求的10 ng/μL。因此，異尾雙鏈熒光探針法的性能指標(biāo)符合國家參考品要求，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

同時，本研究檢測了200例臨床樣本，變異類型包括3種非缺失型α-地貧、8種β-地貧點突變。驗證結(jié)果表明，異尾雙鏈熒光探針法對97例陽性樣本、103例陰性樣本的檢測結(jié)果與PCR-反向點雜交法一致。

綜上所述，本研究利用多重不對稱PCR與異尾雙鏈熒光探針技術(shù)建立了一種通過3管反應(yīng)檢測3種非缺失型α-地貧突變與8種β-地貧點突變的方法。經(jīng)地貧核酸檢測國家標(biāo)準(zhǔn)品與地貧臨床標(biāo)本驗證，其性能指標(biāo)均滿足要求，能夠準(zhǔn)確、快速、可靠地檢測11種地貧點突變，具有較高的臨床應(yīng)用價值。