李 敏， 李建英， 羅國(guó)菊， 郭 野

（1.濰坊市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東 濰坊 261041；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100730）

冷凝集是指在低溫條件下紅細(xì)胞（red blood cell，RBC）發(fā)生可逆性凝集，標(biāo)本發(fā)生冷凝集會(huì)導(dǎo)致RBC計(jì)數(shù)假性減少和體積假性增高的結(jié)果。目前，臨床實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行血細(xì)胞分析時(shí)，如遇到冷凝集標(biāo)本，較普遍的處理方式有37 ℃水浴30 min或進(jìn)行血漿置換，基本能達(dá)到將平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC）糾正到＜380 g/L的預(yù)期效果，但這些處理方式均需要一定的時(shí)間，操作步驟相對(duì)繁瑣，且人工干預(yù)的步驟均會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生一定程度的誤差。如何利用好血液分析儀的參數(shù)，在短時(shí)間內(nèi)有效地解決問(wèn)題，是對(duì)檢驗(yàn)人員提出的挑戰(zhàn)。有研究發(fā)現(xiàn)，冷凝集標(biāo)本41 ℃加熱1 min后檢測(cè)，或利用血液分析儀的網(wǎng)織紅細(xì)胞（reticulocyte，RET）通道檢測(cè)的糾正效果比37 ℃水浴2 h的效果更好[1]。R-MFV、RBC-O是血液分析儀的研究參數(shù)，可通過(guò)計(jì)算糾正MCHC，無(wú)需額外的孵育或置換時(shí)間。目前尚未見(jiàn)有關(guān)聯(lián)合應(yīng)用RET通道RBC-O參數(shù)和電阻抗通道R-MFV參數(shù)計(jì)算MCHC來(lái)糾正冷凝集標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的報(bào)道。本研究在評(píng)估無(wú)冷凝集標(biāo)本R-MFV、RBC-O的可應(yīng)用性后，探討R-MFV、RBC-O聯(lián)合應(yīng)用在糾正冷凝集標(biāo)本MCHC中的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 樣本收集

隨機(jī)取2021年8月中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院臨床送檢血常規(guī)的20例無(wú)冷凝集標(biāo)本血液分析儀檢測(cè)結(jié)果。另收集2021年6—8月中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院住院患者臨床送檢血常規(guī)的15例冷凝集標(biāo)本。冷凝集判斷標(biāo)準(zhǔn)：MCHC≥380 g/L，RBC、血細(xì)胞比容（hematocrit，HCT）、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）之間不符合“3規(guī)則”[2]，放入4 ℃冰箱5 min有肉眼可見(jiàn)的冷凝集現(xiàn)象[3]。

1.2 儀器與試劑

XN-9100全自動(dòng)血液分析儀（日本Sysmex公司）及配套試劑、質(zhì)控品，該儀器電阻抗通道以鞘流電阻抗法檢測(cè)RBC，RBC-I和R-MFV為該通道研究參數(shù)；RET通道采用半導(dǎo)體激光流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）+核酸熒光染色法檢測(cè)RBC，RBC-O為該通道的研究參數(shù)。

1.3 標(biāo)本處理與質(zhì)量控制

每日測(cè)定3個(gè)水平配套質(zhì)控品，確保結(jié)果均在控。無(wú)冷凝集標(biāo)本常規(guī)上機(jī)檢測(cè)。冷凝集標(biāo)本分別用3種方法處理。（1）37 ℃水浴法：將冷凝集標(biāo)本與含2.0 mL 0.9%NaCl溶液的稀釋液一同置于37 ℃水浴箱內(nèi)孵育30 min，吸取10 μL迅速加入2.0 mL溫0.9%NaCl溶液中混勻，滴到計(jì)數(shù)板上，待RBC在計(jì)數(shù)板中分布均勻后，采用顯微鏡法[4]計(jì)數(shù)RBC。（2）血漿置換法：將標(biāo)本1 500×g離心3 min，棄去血漿，加入等量0.9% NaCl溶液混勻，重復(fù)血漿置換步驟2遍，上機(jī)檢測(cè)。（3）RET通道MCHC檢測(cè)：采用XN-9100全自動(dòng)血液分析儀RET通道檢測(cè)MCHC（記為MCHC-O）。（4）通過(guò)RBC-O和R-MFV計(jì)算MCHC：用RBC-O替換RBC-I，R-MFV替換紅細(xì)胞平均體積（mean corpuscular volume，MCV），通過(guò)公式MCHC=Hb/（RBC-O×RMFV）計(jì)算MCHC（記為MCHC計(jì)算）。

1.4 結(jié)果判定

（1）采用Bland-Altman法比較20例無(wú)冷凝集標(biāo)本RBC-I與RBC-O、MCV與R-MFV的一致性。以測(cè)量結(jié)果的差值為縱坐標(biāo)，均值為橫坐標(biāo)，繪制散點(diǎn)圖，并標(biāo)注出95%一致性界限（±1.96s）。如果2個(gè)測(cè)量結(jié)果的差值均位于95%一致性界限內(nèi)，則判定為2種方法結(jié)果具有較好的一致性[5]。

（2）以37 ℃水浴法為參考方法，分別計(jì)算15例冷凝集標(biāo)本RET通道、血漿置換法RBC計(jì)數(shù)結(jié)果與參考方法的差值，以差值為90%～110%為可接受范圍。

（3）以MCHC＜380 g/L，RBC、HCT、Hb之間符合“3規(guī)則”為糾正合格。統(tǒng)計(jì)RET通道、血漿置換法和通過(guò)RBC-O、R-MFV計(jì)算MCHC達(dá)到糾正標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)本數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 RBC-I與RBC-O、MCV與R-MFV的一致性

RBC-I與RBC-O、MCV與R-MFV的差值均在95%一致性界限內(nèi)，一致性好。見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 無(wú)冷凝集標(biāo)本RBC-I與RBC-O一致性分析

圖2 無(wú)冷凝集標(biāo)本MVC與R-MFV一致性分析

2.2 冷凝集標(biāo)本處理前后RBC計(jì)數(shù)結(jié)果

除1例冷凝集標(biāo)本血漿置換法與參考方法差值為60.5%外，其他14例標(biāo)本與參考方法差值均為90%～110%。冷凝集標(biāo)本直接上機(jī)檢測(cè)、37 ℃水浴法、RET通道檢測(cè)、血漿置換法RBC計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 15例冷凝集標(biāo)本不同方法RBC計(jì)數(shù)結(jié)果

2.3 采用不同方法糾正冷凝集標(biāo)本MCHC的效果比較

RET通道、血漿置換法和通過(guò)RBC-O、R-MFV計(jì)算MCHC，分別有5、13、14例達(dá)到糾正要求。見(jiàn)表2、圖3。

表2 15例冷凝集標(biāo)本不同方法紅系參數(shù)糾正結(jié)果

圖3 3種方法MCHC結(jié)果比較

3 討論

XN-9100全自動(dòng)血液分析儀檢測(cè)RBC的原理為電阻抗法，RBC通過(guò)小孔時(shí)，形成相應(yīng)大小的脈沖，脈沖的數(shù)目代表RBC的數(shù)量，脈沖的高度代表單個(gè)細(xì)胞的體積，脈沖高度疊加，經(jīng)換算即可得出HCT的值。Hb測(cè)定原理為在稀釋的血液中加入溶血?jiǎng)?，將RBC溶解，釋放出Hb，后者與溶血?jiǎng)┲邢嚓P(guān)成分結(jié)合形成Hb衍生物，進(jìn)入Hb測(cè)試系統(tǒng)進(jìn)行比色，吸光度的變化與液體中Hb含量成正比[6]。在冷凝集標(biāo)本中，RBC凝集成團(tuán)，體積增大，聚集后體積超過(guò)250 fL時(shí)RBC計(jì)數(shù)會(huì)假性減少；多個(gè)RBC聚集后形成的RBC團(tuán)在通過(guò)計(jì)數(shù)孔時(shí)引起脈沖增大，會(huì)導(dǎo)致MCV假性升高，凝集的RBC使MCV增高，同時(shí)RBC計(jì)數(shù)減少，但以RBC計(jì)數(shù)減少為主，因此HCT也隨之降低，并造成了由RBC、Hb、HCT計(jì)算得到的MCHC結(jié)果異常升高[7]。Hb檢測(cè)為比色法，不受影響，對(duì)于冷凝集標(biāo)本而言，Hb是電阻抗通道提供的不受影響的相對(duì)“真值”，可以直接應(yīng)用。

血液分析儀RET通道的分析原理為半導(dǎo)體激光FCM+核酸熒光染色，且配置41 ℃液體加熱設(shè)備，故理論上通過(guò)RET通道可排除冷凝集干擾，得到可靠的RBC-O[6]。RBC體積服從正態(tài)分布，R-MFV與MCV在理論上是一致的[8]。因MCV是所有進(jìn)入檢測(cè)范圍（25～250 fL）內(nèi)單個(gè)、聚集的RBC體積的平均值，而當(dāng)RBC體積按大小排序時(shí)，聚集的RBC因體積大會(huì)排在后邊，因此R-MFV未納入或僅納入一部分聚集的RBC，其R-MFV也較MCV可靠，理論上更接近于RBC平均體積的“真值”。本研究結(jié)果顯示，無(wú)冷凝集的標(biāo)本RBC-I與RBC-O、MCV與R-MFV檢測(cè)結(jié)果具有較好的一致性，與相關(guān)研究結(jié)果[6]一致。

本研究結(jié)果顯示，RET通道檢測(cè)與37 ℃水浴法（參考方法）RBC計(jì)數(shù)的差值均為90%～110%，而血漿置換法5號(hào)樣本與參考方法RBC計(jì)數(shù)的差值（60.5%）超出界限，未達(dá)到糾正效果，但通過(guò)RBC-O和R-MFV計(jì)算，則達(dá)到了糾正效果；本研究15例冷凝集標(biāo)本糾正結(jié)果顯示，僅7號(hào)標(biāo)本未能通過(guò)研究參數(shù)計(jì)算的方法糾正（血漿置換法可以糾正）；2號(hào)和5號(hào)標(biāo)本血漿置換法未達(dá)到糾正標(biāo)準(zhǔn)，但通過(guò)RBC-O和R-MFV計(jì)算可以糾正；8號(hào)標(biāo)本的MCHC＜380 g/L，但RBC、HCT與Hb之間不符合“3規(guī)則”，放置于冰箱5 min后，管壁上可看到凝集顆粒，因此在遇到RBC、HCT與Hb含量不成比例時(shí)，建議先確認(rèn)是否存在冷凝集；13號(hào)標(biāo)本因標(biāo)本凝集成塊，初次檢測(cè)無(wú)結(jié)果，因此將標(biāo)本37 ℃水浴30 min后上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果幾乎無(wú)偏差。對(duì)RET通道、血漿置換法、通過(guò)RBC-O和R-MFV計(jì)算MCHC均可達(dá)到糾正要求（＜380 g/L）的標(biāo)本（4、8、11、13號(hào)），MCHC和MCV結(jié)果有一定的偏差，但因?yàn)樯袩o(wú)可參考的金標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)法判斷哪種方法糾正后的結(jié)果更接近真值，建議在報(bào)告中進(jìn)行相應(yīng)的描述，僅供臨床參考。

冷凝集標(biāo)本雖然可以通過(guò)水浴后稀釋、血漿置換、水浴后灌板計(jì)數(shù)、溫浴后稀釋等方法進(jìn)行處理，但這些方法都需要一定的時(shí)間，并且人工干預(yù)造成的誤差也不可控制[1]。本研究15例冷凝集標(biāo)本通過(guò)研究參數(shù)換算的方法有14例達(dá)到了糾正效果，糾正率＞90%，為冷凝集標(biāo)本的處理提供了一種快速的解決方法。然而，RET通道的RBC直方圖顯示明顯不呈正態(tài)分布時(shí)，R-MFV不適用，此時(shí)可采用水浴或水浴后稀釋、血漿置換等方法糾正冷凝集標(biāo)本。

本研究基于工作中冷凝集標(biāo)本的處理經(jīng)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)血漿置換優(yōu)于37 ℃ 30 min水浴的糾正效果，因此將血漿置換法與通過(guò)RBC-O、R-MFV計(jì)算的MCHC結(jié)果進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)計(jì)算的糾正效果較優(yōu)，但本研究標(biāo)本例數(shù)較少，未來(lái)在實(shí)際工作中會(huì)不斷驗(yàn)證RBC-O與R-MFV的應(yīng)用價(jià)值。