趙旭亮， 田瑞霞， 施友文， 俞 敏， 焦鎏鎏， 朱復(fù)希

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，安徽 合肥 230022；2.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第901醫(yī)院婦產(chǎn)科，安徽 合肥 230031；3.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第901醫(yī)院影像科，安徽 合肥 230031）

骨骼纖毛類(lèi)疾病是一類(lèi)以骨骼系統(tǒng)異常為主要表現(xiàn)的罕見(jiàn)疾病，是由調(diào)控初級(jí)纖毛結(jié)構(gòu)或功能的基因缺陷導(dǎo)致的，包括短肋-多指綜合征（short-rib polydactyly syndrome，SRPS）、軟骨外胚層發(fā)育不良癥（chondroectodermal dysplasia，EVC）、窒息性胸廓營(yíng)養(yǎng)不良（asphyxiating thoracic dysplasia，ATD）或Jeune綜合征、Sensenbrenner綜合征和顱骨外胚層發(fā)育不良（cranioectodermal dysplasia，CED），其中圍產(chǎn)期致死性SRPS的病情最為嚴(yán)重[1]。WDR35基因缺陷可導(dǎo)致伴或不伴多指（趾）畸形短肋胸椎發(fā)育不良7型（short-rib thoracic dysplasia 7，SRTD7；OMIM#614091），又被稱(chēng)為短肋-多指綜合征5型（SRPS-5），屬于SRPS中較為罕見(jiàn)的亞型。SRPS主要表現(xiàn)為胸廓狹窄、伴四肢長(zhǎng)骨明顯短小及多指（趾）畸形，不同亞型間臨床表現(xiàn)常有重疊，因此不易鑒別[2-3]。本研究采用全外顯子家系測(cè)序（trio-whole exome sequencing，Trio-WES）診斷1例SRPS-5引產(chǎn)兒，并分析其臨床特征和遺傳學(xué)特點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

引產(chǎn)兒母親30歲，孕4產(chǎn)2，本次妊娠為宮內(nèi)孕、單胎。否認(rèn)近親婚配，體健，且無(wú)不良嗜好，否認(rèn)孕前特殊病史及圍孕期因素暴露史。曾有2次胚胎停育史，1次引產(chǎn)史（孕足月因胎兒畸形考慮四肢短小引產(chǎn)，具體情況不詳）。本次妊娠再次因胎兒“四肢短小”于孕22+3周就診于中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第901醫(yī)院。產(chǎn)前超聲檢查示胎兒頸后透明帶厚度1.2 mm，雙頂徑52 mm（孕22周水平），頭圍193 mm（孕21+4周水平），腹圍172 mm（孕22+2周水平），股骨長(zhǎng)19 mm（孕15+4周水平），肱骨長(zhǎng)22 mm（孕16+5周水平），脛骨長(zhǎng)16 mm，足長(zhǎng)36 mm，胎兒心率151次/min，心率齊。胎兒長(zhǎng)骨明顯較短，且骨干彎曲，股骨干骺端粗大，呈“電話(huà)聽(tīng)筒”狀；胸腔狹窄且胸圍較小，心胸比值為0.43，肋骨短且雙肺受壓變?。桓共颗蚵?，胸腹移行處有分界，移行處腹側(cè)增大。超聲診斷胎兒骨骼發(fā)育不良，結(jié)合胎兒母親不良妊娠史，考慮致死性侏儒Ⅰ型。胎兒母親及其家屬選擇于孕23周引產(chǎn)終止妊娠。引產(chǎn)兒體征與超聲結(jié)果相符。電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）三維重建提示長(zhǎng)骨及骨干發(fā)育不良，肋骨短且胸腔狹窄，但頭顱、手及足部發(fā)育正常。見(jiàn)圖1。

圖1 本例胎兒引產(chǎn)前、后的影像學(xué)檢查結(jié)果

1.2 方法

1.2.1 基因檢測(cè) 本研究經(jīng)中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第901醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)（倫理申請(qǐng)?zhí)枺?02106002），孕婦及其家屬簽署知情同意書(shū)。取引產(chǎn)兒皮膚組織約2 g，置于RNAlater保護(hù)管中，同時(shí)采用乙二胺四乙酸抗凝管采集其父母外周血3 mL。行全外顯子家系測(cè)序（trio-whole exome sequencing，Trio-WES），根據(jù)基因組提取試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）說(shuō)明書(shū)要求提取DNA。將目標(biāo)區(qū)域DNA片段進(jìn)行富集，構(gòu)建覆蓋人類(lèi)基因組全外顯子文庫(kù)，采用NovaSeq 6000測(cè)序儀（美國(guó)Illumina公司）對(duì)其進(jìn)行高通量測(cè)序，目標(biāo)序列覆蓋度≥99%。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理與位點(diǎn)驗(yàn)證 測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控過(guò)濾后，將序列與GRch37/hg19參考基因組進(jìn)行比對(duì)，對(duì)在各數(shù)據(jù)庫(kù)（dbSNP、千人基因組及ExAC）中篩選出的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)、插入及缺失變異進(jìn)行檢索，查看其在正常人群中的分布頻率。采用SIFT（http：//provean.jcvi.org/index.php）、PolyPhen-2（http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）及Mutation Taster（https：//www.mutationtaster.org/）蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件對(duì)錯(cuò)義突變進(jìn)行危害性分析。根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）相關(guān)指南[4]進(jìn)行變異位點(diǎn)評(píng)級(jí)。采用Sanger測(cè)序驗(yàn)證WDR35基因可疑致病變異位點(diǎn)，采用3730XL測(cè)序儀（美國(guó)ABI公司）對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并采用DNASTAR 5.0軟件（美國(guó)DNASTAR公司）進(jìn)行分析。WDR35基因缺失驗(yàn)證：在缺失區(qū)域上、下游各設(shè)計(jì)1個(gè)對(duì)照擴(kuò)增子，常染色體與X染色體各設(shè)計(jì)1個(gè)對(duì)照擴(kuò)增子，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）進(jìn)行DNA相對(duì)定量分析。

1.2.3 變異保守性分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/）搜索WDR35蛋白序列（NM_001006657），采用Mega 7.0軟件（新西蘭Mega有限公司）對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行保守性分析，并進(jìn)行多物種同源比對(duì)。采用Swiss-Model在線(xiàn)平臺(tái)（https：//swissmodel.expasy.org/）查詢(xún)與WDR35蛋白序列相似的三維晶體結(jié)構(gòu)，以酵母β-COP結(jié)構(gòu)為模板（PDB編號(hào)：3mkqA）[5]，采用DeepView軟件（瑞士生物信息研究院）進(jìn)行可視化分析，在正常WDR35蛋白三維模型上對(duì)定點(diǎn)突變位點(diǎn)（p.Val267Met）進(jìn)行局部展示。

2 結(jié)果

2.1 基因檢測(cè)結(jié)果

Trio-WES結(jié)果顯示，胎兒WDR35基因發(fā)生復(fù)合雜合變異，分別為父親攜帶的c.799G＞A/p.Val267Met雜合變異和母親攜帶的chr2：20151176-20151245雜合缺失，dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)、千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和ExAC數(shù)據(jù)庫(kù)均未收錄這2個(gè)變異。Sanger測(cè)序結(jié)果顯示存在c.799G＞A/p.Val267Met變異。RT-qPCR結(jié)果顯示母親攜帶chr2：20151176-20151245雜合缺失，該缺失區(qū)域包含WDR35基因第14號(hào)外顯子序列。引產(chǎn)兒家系圖見(jiàn)圖2。引產(chǎn)兒及其父母WDR35基因變異分析結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 引產(chǎn)兒家系圖

圖3 先證者（引產(chǎn)兒）及其父母WDR35基因變異分析

采用SIFT、PolyPhen-2及Mutation Taster在線(xiàn)分析軟件對(duì)c.799G＞A/p.Val267Met的生物危害性進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果分別為0.002（damaging）、0.791（possibly damaging）、1（disease causing），提示變異可能影響蛋白功能。檢索HGMD及PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)，未發(fā)現(xiàn)關(guān)于該變異的報(bào)道，屬于WDR35基因新變異。根據(jù)ACMG指南，將c.799G＞A/p.Val267Met評(píng)級(jí)為可能致?。╨ike pathogenic），評(píng)級(jí)證據(jù)為PM1+PM2+PM3+PP3。chr2：20151176-20151245雜合缺失為功能缺失型（loss of function，LOF）變異，可能導(dǎo)致基因功能喪失，ACMG將該變異評(píng)級(jí)為可能致?。╨ike pathogenic），評(píng)級(jí)證據(jù)為PVS1+PM2。

2.2 同源性比對(duì)和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

同源性比對(duì)結(jié)果顯示，WDR35蛋白Val267在不同物種之間高度保守。見(jiàn)圖4。

圖4 不同物種之間WDR35蛋白的同源性分析

通過(guò)Swiss-Model在線(xiàn)平臺(tái)對(duì)WDR35蛋白同源進(jìn)行建模，結(jié)果顯示，WDR35蛋白Val267位于WD40蛋白N'-端7個(gè)緊密相連的β-螺旋槳狀結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域起著蛋白識(shí)別及運(yùn)輸?shù)裙δ?。?dāng)p.Val267Met發(fā)生變異，即與Val286、Gln287形成額外氫鍵時(shí)，可能導(dǎo)致局部空間改變。見(jiàn)圖5。

圖5 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果

3 討論

短肋胸椎發(fā)育不良（short-rib thoracic dysplasia，SRTD）是以肋骨短小及胸廓狹窄為主要表型的一類(lèi)綜合征，可合并多指（趾）畸形等。伴或不伴多指（趾）畸形SRTD有22種亞型（www.omim.org/phenotypicSeries/PS208500）。SRTD分類(lèi)主要為SRPS、ATD及Mainzer-Saldino綜合征（OMIM#266920）等[6]，其中SRPS由初級(jí)纖毛功能缺陷和/或纖毛蛋白調(diào)節(jié)的細(xì)胞信號(hào)通路受損所致[7]，根據(jù)不同致病基因共分為5種亞型，WDR35基因變異引起的SRPS-5于2011年被首次報(bào)道，該亞型為一種常染色體隱性遺傳疾病，其主要臨床特征為嚴(yán)重的四肢短小伴彎曲、窄胸及多指（趾）畸形、髖臼頂呈“三叉戟”狀，非骨骼系統(tǒng)表型包括唇腭裂及其他器官畸形，如腎囊腫及偏側(cè)性缺陷[2，4]。本例SRPS-5胎兒具有四肢長(zhǎng)骨明顯短小且彎曲，窄胸伴肺發(fā)育不良等SRPS典型臨床特征。另外，在胎兒母親既往孕史中，有1次因產(chǎn)前超聲提示胎兒四肢短小而引產(chǎn)的情況，具體臨床信息不詳，可能同樣因WDR35基因缺陷所致。

值得注意的是，WDR35基因缺陷除可導(dǎo)致SRPS-5外，也是CED-2的致病基因。CED-2患兒出生后即可觀察到其特殊面容，包括額頭隆起、雙側(cè)顳部狹窄、低耳位或向后旋轉(zhuǎn)的外耳廓、內(nèi)眥褶、小下頜及鼻孔前傾等。由于變異導(dǎo)致外胚層發(fā)育受限，CED-2患兒主要臨床特征為顱縫早閉、短指及牙齒、頭發(fā)、指甲等外胚層組織異常，雖也表現(xiàn)為四肢短小（尤其是肱骨）和胸廓狹窄，但嚴(yán)重程度明顯弱于SRPS-5，且有非胚胎期致死的特征[8]。SRPS-5患兒出現(xiàn)嚴(yán)重表型可能與WDR35基因發(fā)生LOF變異有關(guān)，既往報(bào)道的SRPS-5病例中，至少有1個(gè)WDR35等位基因發(fā)生移碼變異或非編碼區(qū)變異導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄異常[5，9-10]。然而，CED-2患者WDR35基因多數(shù)為錯(cuò)義變異導(dǎo)致蛋白功能受損[11-14]，由于該基因變異相關(guān)報(bào)道較為罕見(jiàn)，因此能否利用變異類(lèi)型鑒別2種疾病的效能，仍需更多隊(duì)列研究進(jìn)行驗(yàn)證。

根據(jù)致病基因可將SRPS分為5種亞型，每種亞型的表型相似，通過(guò)超聲進(jìn)行產(chǎn)前診斷具有一定的困難，每種亞型均可導(dǎo)致特定疾病。由DYNC2H1基因變異導(dǎo)致的SRPS-1或SRPS-3又被稱(chēng)為Saldino-Noonan綜合征或Verma-Naumoff綜合征（OMIM#613091），是最常見(jiàn)的SRPS亞型，約占SRPS患者數(shù)的50%[8]。SRPS-1的特征為肢體極度短?。挔钪w）、胸廓狹窄、多指（趾）畸形、肩胛骨發(fā)育不全和多器官受累等，是最嚴(yán)重的SRPS亞型；SRPS-3與SRPS-1表型相似，患兒四肢短小、胸廓狹窄、顱底短缺、前額突出和枕部平坦的特征較明顯[15-16]。NEK1基因變異導(dǎo)致的SRPS-2又被稱(chēng)為Majewski綜合征（OMIM#263520），患兒特征為長(zhǎng)骨干骺端光滑，脛骨較腓骨短，多指（趾）畸形較為普遍[17]。IFT122基因變異導(dǎo)致的SRPS-4又被稱(chēng)為Beemer-Langer綜合征（OMIM#269860），與SRPS-2表型相似，均可表現(xiàn)出長(zhǎng)骨短且干骺端光滑[18]，長(zhǎng)骨嚴(yán)重彎曲（特別是橈骨與尺骨）、腓骨纖薄、小髂骨也是其臨床特征[3]。綜合不同亞型的臨床表型可以看出，SRPS最顯著的臨床特征為肋骨短伴四肢長(zhǎng)骨明顯短小，并可合并多指（趾）畸形，累及多器官。

SRPS的發(fā)生主要由細(xì)胞纖毛形成及功能缺陷導(dǎo)致，細(xì)胞纖毛內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（intraflagellar transport，IFT）對(duì)建立和維持纖毛結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。IFT轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程需要三磷酸腺苷參與，并由大型多蛋白復(fù)合物IFT-A和IFT-B控制，WDR35基因編碼IFT-A復(fù)合體核心區(qū)域的IFT121蛋白（另外2個(gè)蛋白分別為IFT140、IFT144）[3]，因此WDR35基因缺陷會(huì)干擾下游IFT43的穩(wěn)定性，從而破壞生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的有序增殖和分化，對(duì)軟骨內(nèi)成骨與礦化產(chǎn)生嚴(yán)重影響[19]。WDR35蛋白包括N'-端由7個(gè)緊密連接的β-螺旋槳狀結(jié)構(gòu)組成的結(jié)構(gòu)域（WD40/WD40樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域），具有細(xì)胞內(nèi)識(shí)別、結(jié)合及運(yùn)輸?shù)鞍椎纳锕δ埽贑'-端為1個(gè)TRP樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域[10，20]。本例引產(chǎn)兒WDR35基因發(fā)生復(fù)合雜合變異，其中1個(gè)源自父親的錯(cuò)義變異（c.799G＞A/p.Val267Met），位于WD40樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域，通過(guò)蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)該變異可導(dǎo)致局部生成額外氫鍵，進(jìn)而可能影響該結(jié)構(gòu)域的生物功能。MILL等[5]報(bào)道了1例具有顯著短肢、軸后多指畸形及特殊面容表型的SRPS-5胎兒，胎兒WDR35基因的1個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)同樣出現(xiàn)在高度保守的WD40樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域。提示該結(jié)構(gòu)域功能被破壞可能會(huì)導(dǎo)致更嚴(yán)重的疾病表型，但由于目前關(guān)于SRPS-5患兒產(chǎn)前研究的報(bào)道較少，因此仍需明確其基因型-表型的關(guān)聯(lián)性。

綜上所述，產(chǎn)前超聲檢查雖可識(shí)別胎兒發(fā)育異常等問(wèn)題，但許多疾病表型在妊娠后期或產(chǎn)后逐漸發(fā)生變化，增加了通過(guò)超聲進(jìn)行產(chǎn)前診斷的難度。SRPS不僅在不同亞型間表型相似，而且也與EVC、CED等其他軟骨發(fā)育不良疾病的產(chǎn)前超聲影像特征存在廣泛的表型重疊，若不進(jìn)行基因檢測(cè)，幾乎難以精確診斷。而全外顯子基因測(cè)序有助于診斷胎兒期疾病。ACMG于2020年發(fā)布了胎兒全外顯子測(cè)序在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用指南，明確指出，當(dāng)胎兒超聲檢查結(jié)果異常，并在核型和染色體微陣列檢測(cè)未見(jiàn)異常的情況下，建議進(jìn)行Trio-WES[21]。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展和臨床數(shù)據(jù)的不斷積累，胎兒全外顯子測(cè)序技術(shù)必將廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前精準(zhǔn)診斷，并發(fā)揮關(guān)鍵作用。