王鵬 邱振東 張利龍 左騰 李凱 陳辰 王衛(wèi)星

膽囊癌在肝外膽道系統(tǒng)惡性腫瘤中的發(fā)病率約占80%～95%[1-2]。由于缺乏早期臨床表現(xiàn)，膽囊癌一旦發(fā)現(xiàn)病情多處于進(jìn)展期[3]。膽囊具有豐富的淋巴組織及血供，膽囊癌細(xì)胞易向鄰近器官侵犯并隨血液系統(tǒng)或淋巴管向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后差， 5年生存率約為32%，是消化道腫瘤中惡性程度較高的一類(lèi)腫瘤[4-5]。膽囊癌的主要治療方式為手術(shù)，放化療以及姑息治療是其輔助治療手段[5-7]。白細(xì)胞分化抗原74(cluster of differentiation 74,CD74)作為一種具有多種免疫功能的Ⅱ型跨膜蛋白，在炎癥以及多種惡性腫瘤中均有表達(dá)，是腫瘤細(xì)胞增殖及多種實(shí)體腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因子[8-10]。本研究擬通過(guò)測(cè)定膽囊癌組織中CD74的表達(dá)水平以及其與膽囊癌的臨床病理相關(guān)性以及其與已知腫瘤標(biāo)志因子表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor ，EGFR)的相關(guān)性，探討CD74在膽囊癌中的作用及其相關(guān)機(jī)制。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

我院2016年9月～2021年9月間收治的膽囊癌病人54例，男性17例，女性37例，平均年齡為61.2歲，所有病人術(shù)前均未接受新輔助化療或放療，排除肝臟腫瘤轉(zhuǎn)移至膽囊所致的轉(zhuǎn)移癌。

二、方法

1.試劑：兔抗人EGFR抗體，購(gòu)自北京中杉金橋公司。通用免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒購(gòu)自Thermo公司。

2.免疫組化檢測(cè)：采用SP法測(cè)定膽囊癌組織中的CD74以及EGFR的表達(dá)情況[11]。

3.Western blot檢測(cè)：組織蛋白提取并Western blot法檢測(cè)CD74在膽囊癌中的表達(dá)情況，將液氮中凍存的腫瘤組織秤取50 mg，液氮研磨后,提取蛋白，蛋白變性，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗，孵育二抗，采用Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃膜，分析。

4.免疫組化結(jié)果判定：免疫組化結(jié)果判定由2位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師獨(dú)立完成，其均對(duì)病人臨床資料未知。免疫組化圖片采用OLYMPUS BX53正置顯微鏡拍照。CD74陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞胞漿內(nèi)有黃色或棕黃色沉著。每張病理切片隨機(jī)選擇5個(gè)200倍視野鏡下拍照。采用Image-pro Plus 6.0圖片分析軟件對(duì)染色的面積、密度、光密度值進(jìn)行分析。綜合染色強(qiáng)度和細(xì)胞著色率對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行評(píng)分：0分，不著色；1分，淡黃色著色；2分，黃色染色；3分，棕黃色染色。對(duì)于細(xì)胞著色率亦進(jìn)行評(píng)分：0分，0～5%細(xì)胞著色；1分，6%～25%細(xì)胞著色；2分，26%～50%細(xì)胞著色；3分，>50%細(xì)胞著色。綜合每張切片的平均染色強(qiáng)度評(píng)分和平均細(xì)胞著色率評(píng)分之和，0分陰性，1～2分弱陽(yáng)性，3分陽(yáng)性，4～6分強(qiáng)陽(yáng)性。0～2分定義為陰性表達(dá)，3～6分定義為陽(yáng)性表達(dá)[12]。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。CD74表達(dá)情況比較采用χ2檢驗(yàn)，多因素Logistic回歸分析顯著性差異的因素 。應(yīng)用Spearman秩相關(guān)性分析CD74表達(dá)水平與EGFR水平的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

在正常膽囊組織中CD74呈陰性表達(dá)。54例膽囊癌病人中CD74的表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系見(jiàn)表1。通過(guò)Logisitic多因素分析表明，腫瘤的浸潤(rùn)深度和TNM分期是影響CD74表達(dá)的獨(dú)立因素(見(jiàn)表2)。在膽囊癌組織中分化程度低的膽囊癌組織CD74表達(dá)強(qiáng)于分化程度好的膽囊癌組織(圖1)。Western blot技術(shù)分析同樣印證了CD74在分化差的膽囊癌組織中表達(dá)上調(diào)(圖2)。54例病人中，CD74的表達(dá)與性別、年齡無(wú)明顯差異性(P>0.05);分化差的膽囊癌中CD74的表達(dá)高于中分化及低分化膽囊癌。反應(yīng)腫瘤浸潤(rùn)程度的T分期，T分期晚的膽囊癌組織CD74表達(dá)高于T分期較早的膽囊癌組織，但與腫瘤組織的N分期尚無(wú)明顯差異；TNM分期較早的膽囊癌與分期較差的膽囊癌組織中CD74的表達(dá)具有明顯差異(表1)。EGFR在膽囊癌中的表達(dá)情況見(jiàn)圖3。通過(guò)免疫組化分析細(xì)胞漿中陽(yáng)性染色情況，54例膽囊癌切片，均有EGFR的陽(yáng)性表達(dá)(評(píng)分>3分)。通過(guò)Spearman秩相關(guān)分析CD74與EGFR表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果表明，CD74的IHC的IOD值與EGFR的IOD值呈正相關(guān)。CD74在不同分化程度的膽囊癌組織中的IOD值以及同EGFR之間的相關(guān)性，見(jiàn)圖4。

表1 CD74在膽囊癌中的表達(dá)與病人臨床病理特征的關(guān)系(例)

CD74在膽囊癌組織中的表達(dá)情況。A：PBS陰性對(duì)照組；B：正常膽囊組織中CD74的表達(dá)情況；C：高分化膽囊癌組織中CD74的表達(dá)情況；D：中分化膽囊癌組織中CD74D的表達(dá)情況；E：低分化膽囊癌組織中CD74的表達(dá)情況；F：陽(yáng)性對(duì)照(結(jié)腸癌組織)

表2 腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度以及TNM分期的多因素Logistic分析

P:低分化的膽囊癌組織；W：高分化膽囊癌組織;M:中分化的膽囊癌組織圖2 Western blot 檢測(cè)不同分化程度的膽囊癌組織中CD74的表達(dá)情況

A：與高分化組比較，aP<0.05；與中分化組比較，bP<0.05;B：中CD74的表達(dá)IOD值與EGFR呈正相關(guān)，系數(shù)為0.607

討論

膽囊癌的臨床表現(xiàn)與慢性膽囊炎以及膽石癥有一定的重疊，絕大多數(shù)膽囊癌病人就診時(shí)，疾病大多處于進(jìn)展期。進(jìn)展期膽囊癌的預(yù)后差，其5年生存率約為32%[13]，是消化系疾病中預(yù)后較差的腫瘤之一。

A：低表達(dá)； B：高表達(dá)圖3 EGFR在膽囊癌中的表達(dá)情況(SP×200)

CD74在血液系統(tǒng)腫瘤以及多種實(shí)體腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。本研究結(jié)果表明，CD74在膽囊癌組織中過(guò)表達(dá)，且在低分化膽囊癌中的表達(dá)明顯高于高分化膽囊癌。Western blot結(jié)果提示，CD74的表達(dá)在低分化膽囊癌中表達(dá)升高，這同樣在蛋白水平印證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。CD74的表達(dá)與膽囊癌的分化程度、腫瘤浸潤(rùn)深度即T分期以TNM分期具有明顯的相關(guān)性，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與病人的年齡、性別以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無(wú)明顯相關(guān)性，TNM分期與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果表明，CD74在54例膽囊癌病人中有35例陽(yáng)性表達(dá)，其中T3-T4分期有25例，與膽囊癌的浸潤(rùn)深度有明顯差異，但在有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性病人中CD74的表達(dá)有18例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組CD74陽(yáng)性有17例,通過(guò)線性分析淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況與T分期的相關(guān)性，其結(jié)果表明，T分期與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無(wú)明顯相關(guān)性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

CD74是MHC-Ⅱ的固定鏈，是一種跨膜蛋白，其在抗原提呈細(xì)胞如B細(xì)胞、單核細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞中的表達(dá)明顯升高，D-CD74復(fù)合物對(duì)于宿主的免疫反應(yīng)具有抑制作用，此作用促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖。大量研究表明，CD74在惡性腫瘤中的過(guò)表達(dá)可以阻斷腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性的抗原提呈作用，從而導(dǎo)致免疫逃逸。在B細(xì)胞淋巴瘤以及多發(fā)性骨髓瘤中CD74已經(jīng)被報(bào)道作為一種新的治療靶點(diǎn)，在非血液系統(tǒng)惡性腫瘤中如胃癌，腎癌以及非小細(xì)胞肺癌中CD74也已經(jīng)被報(bào)道作為一種新的標(biāo)志物，且具有預(yù)測(cè)預(yù)后的作用[14-15]。

在本研究中，低分化膽囊癌組織中CD74的免疫組化平均IOD值高于中分化以及高分化膽囊癌組織，Western blot 結(jié)果同時(shí)印證了這樣的結(jié)果。CD74的致癌機(jī)制與MIF具有重要的關(guān)聯(lián)，MIF是重要的炎癥因子，CD74與MIF復(fù)合物是作為受體/配體復(fù)合物參與慢性炎癥及慢性炎癥向腫瘤發(fā)展的過(guò)程。其可能的機(jī)制是通過(guò)封閉p53這種抑癌基因，阻礙p53的跨膜行為，阻止p53進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，阻斷其所介導(dǎo)的凋亡過(guò)程。因此，導(dǎo)致細(xì)胞的增殖增多，介導(dǎo)上皮增殖[16-17]。CD74與MIF的復(fù)合物還可以通過(guò)EGFR增加上皮細(xì)胞的增殖，EGFR作為多種實(shí)體腫瘤的靶向治療點(diǎn)，其參與腫瘤的增殖、遷徙以及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的重要過(guò)程[18]。CD74與MIF復(fù)合體通過(guò)上體白細(xì)胞介素-8來(lái)上調(diào)EGFR的表達(dá)水平，而EGFR是生長(zhǎng)因子家族的重要成員之一，其主要功能為調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖以及分化，在正常細(xì)胞的生理過(guò)程中其作用十分重要。目前，在腫瘤細(xì)胞中，針對(duì)EGFR靶點(diǎn)的治療已經(jīng)廣泛應(yīng)用，如肺癌、腎癌等實(shí)體腫瘤[19]。本研究通過(guò)Spearman秩相關(guān)得出以下結(jié)論，CD74的表達(dá)水平與EGFR呈正相關(guān)，即膽囊癌中高表達(dá)CD74的樣本中EGFR的表達(dá)同樣高表達(dá)，CD74可能與細(xì)胞的EGFR具有相關(guān)性，其可能是治療膽囊癌的潛在治療靶點(diǎn)之一。

綜上，通過(guò)免疫組化以及Western blot分析CD74以及EGFR在膽囊癌中的表達(dá)，結(jié)果表明，CD74與EGFR呈正相關(guān),且與病人的臨床病理特征明顯相關(guān)，CD74是參與膽囊癌發(fā)生發(fā)展的重要因子。