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        主動脈夾層組織中載脂蛋白H表達(dá)變化及其臨床意義

        2022-11-15 02:23:30馮鑫何毅肖杰文蔣丁勝魏翔
        臨床外科雜志 2022年10期
        關(guān)鍵詞:彈力平滑肌夾層

        馮鑫 何毅 肖杰文 蔣丁勝 魏翔

        主動脈夾層(aortic dissection,AD)是一種因高血壓、動脈粥樣硬化及脂代謝紊亂等多種危險(xiǎn)因素引起的主動脈危急重癥,主動脈內(nèi)膜形成撕裂破口,動脈腔內(nèi)血液經(jīng)撕裂破口進(jìn)入中層膜,致使中層膜撕裂形成真假腔[1-2],起病急,進(jìn)展迅速,死亡率極高。有研究顯示,主動脈夾層的院內(nèi)30天病死率高達(dá)21%~26%,院外病死率高達(dá)29%[3]。主動脈夾層的治療方式主要包括手術(shù)治療以及降低血壓,降低心率等輔助治療[4-5]。主動脈夾層發(fā)生過程中存在明顯的脂代謝紊亂,例如高密度脂蛋白和低密度脂蛋白[6]。載脂蛋白H(apopoprotein H,ApoH)也稱為β2-糖蛋白I(beta2glycoprotein I,β2GPI),是脂蛋白的蛋白質(zhì)部分,參與脂質(zhì)代謝及凝血功能等多種生理途徑。ApoH與心血管疾病密切相關(guān)[7-8],是血管栓塞、動脈粥樣硬化及冠心病等疾病的危險(xiǎn)因素之一,可作為評估心血管風(fēng)險(xiǎn)的臨床指標(biāo)。本研究觀察正常主動脈壁及夾層主動脈壁中ApoH表達(dá)量的變化,探討其在主動脈夾層發(fā)生過程中的作用及臨床意義。

        對象與方法

        一、對象

        2015年8月~2020年1月我院心臟大血管外科住院的Stanford A型主動脈夾層(Stanford type A aortic dissection,TAAD)病人15例,行人工血管置換術(shù)中修剪的升主動脈壁作為夾層組。排除標(biāo)準(zhǔn):遺傳性主動脈病變(如馬方綜合征等)、醫(yī)源性及創(chuàng)傷性TAAD。9例心臟移植或心肺移植病人術(shù)中修剪的正常升主動脈壁作為對照組。術(shù)前所有病人均簽署知情同意書,并獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)。

        二、方法

        1.蘇木精-伊紅(HE)染色和彈性纖維(EVG)染色:將采集的主動脈組織固定于4%多聚甲醛中,經(jīng)脫水、包埋成蠟塊后切片,切片厚度為5 μm,依次按脫蠟、水合及染色等處理切片,分別完成HE和EVG染色,脫水封片后鏡下觀察。

        2.蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot):將兩組升主動脈標(biāo)本各取500 mg,剪碎、研磨,加入200 μl RIPA裂解緩沖液,裂解30分鐘后4 ℃ 12 000 r/min離心5分鐘,取上清轉(zhuǎn)移于EP管。使用BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度。蛋白定量,電泳,轉(zhuǎn)膜。室溫下5%脫脂牛奶封閉1小時(shí),加入一抗ApoH,4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液清洗(5 分鐘×3次)后加入相應(yīng)二抗,室溫下孵育1小時(shí),ChemiDOCTMXRS+凝膠成像系統(tǒng)顯影,Image Lab軟件對條帶進(jìn)行灰度值分析。

        3.免疫組織化學(xué)染色法:石蠟切片經(jīng)脫蠟水合后浸泡于1×的抗原修復(fù)液(EDTA法)中,100 ℃水浴鍋中加熱20分鐘,3%雙氧水37 ℃孵育40分鐘,PBS清洗2次,5%山羊血清37 ℃封閉20分鐘,ApoH一抗(1∶50稀釋)4 ℃孵育過夜。次日PBS清洗3次,反應(yīng)增強(qiáng)劑37 ℃孵育20分鐘,PBS清洗2次,二抗37 ℃孵育30分鐘,PBS清洗3次后行DAB顯色液顯色、蘇木素染核、鹽酸酒精分化、脫水、透明、封片及鏡下觀察拍照。

        三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        結(jié)果

        1.兩組病人組織樣本病理學(xué)染色分析比較: HE染色及EVG彈力纖維染色結(jié)果顯示,對照組主動脈壁組織結(jié)構(gòu)規(guī)整,彈力纖維完整連續(xù),平滑肌細(xì)胞形態(tài)正常,排列緊密有序;夾層組主動脈中層結(jié)構(gòu)紊亂,表現(xiàn)為明顯的退行性病變、平滑肌細(xì)胞丟失、炎癥細(xì)胞浸潤及彈力纖維碎裂(圖1)。彈力纖維破裂程度分級結(jié)果顯示,夾層組主動脈組織彈力纖維斷裂和內(nèi)側(cè)降解程度明顯高于對照組[(1.000±0.000)比(3.208±0.806)], 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

        A 對照組,可見主動脈壁結(jié)構(gòu)完整,平滑肌細(xì)胞排列有序(HE ×200)。B 夾層組,主動脈壁組織發(fā)生中層退變,平滑肌細(xì)胞減少排列紊亂(HE ×200)。C 對照組,主動脈壁彈力纖維完整連續(xù)(EVG ×200);D 夾層組,主動脈壁彈力纖維破碎、斷裂和丟失(EVG ×200)。

        2.兩組間ApoH蛋白表達(dá)比較見圖2。夾層組ApoH蛋白表達(dá)量為1.455 ± 0.128,對照組為1.001 ± 0.060,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Pearson相關(guān)性分析顯示,ApoH的蛋白表達(dá)水平與主動脈夾層患者的升主動脈直徑(R2<0.001,P=0.99)、主動脈弓直徑(R2=0.162,P=0.322)及胸主動脈直徑(R2=0.459,P=0.065)無明顯相關(guān)性。

        兩組主動脈組織中ApoH蛋白表達(dá)情況和組織總蛋白表達(dá)情況

        3.兩組間ApoH在主動脈組織中的細(xì)胞定位和表達(dá)量比較:免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn),ApoH主要分布于平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)(圖3)。夾層組主動脈組織中ApoH表達(dá)量為(13.49 ± 0.948),對照組為(1.616 ± 0.057),兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

        A、C、E分別為對照組主動脈壁組織100倍、200倍400倍免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。B、D、E分別為夾層組主動脈壁組織100倍、200倍、400倍免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。ApoH表達(dá)呈棕色,對照組的平滑肌細(xì)胞中未見明顯棕色物質(zhì),夾層組平滑肌細(xì)胞中棕色物質(zhì)明顯增多,且主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。

        討論

        主動脈夾層的主要病理特征是主動脈中層退行性病變,包括平滑肌細(xì)胞丟失及彈力纖維斷裂等[9]。ApoH出現(xiàn)異常會引起多種心腦血管疾病如動脈粥樣硬化、冠心病、腦卒中及血管內(nèi)血栓形成等[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn),ApoH在TAAD病人主動脈組織中表達(dá)明顯上調(diào)。

        ApoH又稱為β2GPI,是一種由肝細(xì)胞合成的多功能血漿蛋白,基因定位于17q23-24,參與脂質(zhì)代謝及炎癥反應(yīng)等多種病理生理過程[10]。Tan等[10]研究發(fā)現(xiàn),ApoH表達(dá)上調(diào)可通過抑制P-Erk信號通路誘導(dǎo)血管內(nèi)皮功能障礙,影響血管發(fā)育。氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)的蓄積可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,是引起動脈粥樣硬化的重要因素[11]。李文[6]等研究發(fā)現(xiàn),低密度脂蛋白在主動脈夾層中表達(dá)上調(diào),其經(jīng)過氧化應(yīng)激可變成oxLDL。氧化應(yīng)激與主動脈夾層密切相關(guān),可誘導(dǎo)主動脈中層發(fā)生退行性病變,導(dǎo)致主動脈壁變薄[12]。有研究表明,ApoH與oxLDL結(jié)合可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞分化,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性氧及凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)升高,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。主動脈夾層的主要病理特征之一是平滑肌細(xì)胞丟失,而細(xì)胞內(nèi)ROS升高及細(xì)胞凋亡均可以導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞丟失[14]。有研究表明,血管發(fā)育障礙、動脈粥樣硬化及脂質(zhì)代謝異常等均與主動脈夾層的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[14-15]。在本研究中,TAAD病人主動脈組織中ApoH蛋白表達(dá)水平升高,表明ApoH在主動脈夾層形成的病理過程中具有調(diào)控作用,可能通過調(diào)控P-Erk信號通路導(dǎo)致血管發(fā)育不良,從而促進(jìn)主動脈夾層形成,也可能通過與oxLDL結(jié)合調(diào)控Bax表達(dá)誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞凋亡,影響主動脈夾層的發(fā)生。相關(guān)性分析揭示了ApoH的表達(dá)變化與主動脈直徑無顯著相關(guān)性,表明ApoH可能與主動脈夾層的形成有關(guān),但與主動脈夾層的進(jìn)展無關(guān)[16]。ApoH被發(fā)現(xiàn)與多種心血管疾病密切相關(guān),可作為臨床上評估心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)。

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