馮鑫 何毅 肖杰文 蔣丁勝 魏翔

主動脈夾層(aortic dissection,AD)是一種因高血壓、動脈粥樣硬化及脂代謝紊亂等多種危險因素引起的主動脈危急重癥，主動脈內膜形成撕裂破口，動脈腔內血液經撕裂破口進入中層膜，致使中層膜撕裂形成真假腔[1-2]，起病急，進展迅速，死亡率極高。有研究顯示，主動脈夾層的院內30天病死率高達21%～26%，院外病死率高達29%[3]。主動脈夾層的治療方式主要包括手術治療以及降低血壓，降低心率等輔助治療[4-5]。主動脈夾層發(fā)生過程中存在明顯的脂代謝紊亂，例如高密度脂蛋白和低密度脂蛋白[6]。載脂蛋白H(apopoprotein H,ApoH)也稱為β2-糖蛋白I(beta2glycoprotein I,β2GPI)，是脂蛋白的蛋白質部分，參與脂質代謝及凝血功能等多種生理途徑。ApoH與心血管疾病密切相關[7-8]，是血管栓塞、動脈粥樣硬化及冠心病等疾病的危險因素之一，可作為評估心血管風險的臨床指標。本研究觀察正常主動脈壁及夾層主動脈壁中ApoH表達量的變化，探討其在主動脈夾層發(fā)生過程中的作用及臨床意義。

對象與方法

一、對象

2015年8月～2020年1月我院心臟大血管外科住院的Stanford A型主動脈夾層(Stanford type A aortic dissection,TAAD)病人15例，行人工血管置換術中修剪的升主動脈壁作為夾層組。排除標準：遺傳性主動脈病變(如馬方綜合征等)、醫(yī)源性及創(chuàng)傷性TAAD。9例心臟移植或心肺移植病人術中修剪的正常升主動脈壁作為對照組。術前所有病人均簽署知情同意書，并獲得我院倫理委員會批準。

二、方法

1.蘇木精-伊紅(HE)染色和彈性纖維(EVG)染色：將采集的主動脈組織固定于4%多聚甲醛中，經脫水、包埋成蠟塊后切片，切片厚度為5 μm，依次按脫蠟、水合及染色等處理切片，分別完成HE和EVG染色，脫水封片后鏡下觀察。

2.蛋白質免疫印跡法(Western blot)：將兩組升主動脈標本各取500 mg，剪碎、研磨，加入200 μl RIPA裂解緩沖液，裂解30分鐘后4 ℃ 12 000 r/min離心5分鐘，取上清轉移于EP管。使用BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度。蛋白定量，電泳，轉膜。室溫下5%脫脂牛奶封閉1小時，加入一抗ApoH，4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液清洗(5 分鐘×3次)后加入相應二抗，室溫下孵育1小時，ChemiDOCTMXRS+凝膠成像系統(tǒng)顯影，Image Lab軟件對條帶進行灰度值分析。

3.免疫組織化學染色法：石蠟切片經脫蠟水合后浸泡于1×的抗原修復液(EDTA法)中，100 ℃水浴鍋中加熱20分鐘，3%雙氧水37 ℃孵育40分鐘，PBS清洗2次，5%山羊血清37 ℃封閉20分鐘，ApoH一抗(1∶50稀釋)4 ℃孵育過夜。次日PBS清洗3次，反應增強劑37 ℃孵育20分鐘，PBS清洗2次，二抗37 ℃孵育30分鐘，PBS清洗3次后行DAB顯色液顯色、蘇木素染核、鹽酸酒精分化、脫水、透明、封片及鏡下觀察拍照。

三、統(tǒng)計學分析

結果

1.兩組病人組織樣本病理學染色分析比較： HE染色及EVG彈力纖維染色結果顯示，對照組主動脈壁組織結構規(guī)整，彈力纖維完整連續(xù)，平滑肌細胞形態(tài)正常，排列緊密有序；夾層組主動脈中層結構紊亂，表現為明顯的退行性病變、平滑肌細胞丟失、炎癥細胞浸潤及彈力纖維碎裂(圖1)。彈力纖維破裂程度分級結果顯示，夾層組主動脈組織彈力纖維斷裂和內側降解程度明顯高于對照組[(1.000±0.000)比(3.208±0.806)]， 差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

A 對照組，可見主動脈壁結構完整，平滑肌細胞排列有序(HE ×200)。B 夾層組，主動脈壁組織發(fā)生中層退變，平滑肌細胞減少排列紊亂(HE ×200)。C 對照組，主動脈壁彈力纖維完整連續(xù)(EVG ×200)；D 夾層組，主動脈壁彈力纖維破碎、斷裂和丟失(EVG ×200)。

2.兩組間ApoH蛋白表達比較見圖2。夾層組ApoH蛋白表達量為1.455 ± 0.128，對照組為1.001 ± 0.060，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Pearson相關性分析顯示，ApoH的蛋白表達水平與主動脈夾層患者的升主動脈直徑(R2<0.001,P=0.99)、主動脈弓直徑(R2=0.162,P=0.322)及胸主動脈直徑(R2=0.459,P=0.065)無明顯相關性。

兩組主動脈組織中ApoH蛋白表達情況和組織總蛋白表達情況

3.兩組間ApoH在主動脈組織中的細胞定位和表達量比較：免疫組織化學染色發(fā)現，ApoH主要分布于平滑肌細胞胞質內(圖3)。夾層組主動脈組織中ApoH表達量為(13.49 ± 0.948)，對照組為(1.616 ± 0.057)，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

A、C、E分別為對照組主動脈壁組織100倍、200倍400倍免疫組織化學染色結果。B、D、E分別為夾層組主動脈壁組織100倍、200倍、400倍免疫組織化學染色結果。ApoH表達呈棕色，對照組的平滑肌細胞中未見明顯棕色物質，夾層組平滑肌細胞中棕色物質明顯增多，且主要分布在細胞質中。

討論

主動脈夾層的主要病理特征是主動脈中層退行性病變，包括平滑肌細胞丟失及彈力纖維斷裂等[9]。ApoH出現異常會引起多種心腦血管疾病如動脈粥樣硬化、冠心病、腦卒中及血管內血栓形成等[7-8]。本研究發(fā)現，ApoH在TAAD病人主動脈組織中表達明顯上調。

ApoH又稱為β2GPI，是一種由肝細胞合成的多功能血漿蛋白，基因定位于17q23-24，參與脂質代謝及炎癥反應等多種病理生理過程[10]。Tan等[10]研究發(fā)現，ApoH表達上調可通過抑制P-Erk信號通路誘導血管內皮功能障礙，影響血管發(fā)育。氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)的蓄積可以促進內皮細胞凋亡，是引起動脈粥樣硬化的重要因素[11]。李文[6]等研究發(fā)現，低密度脂蛋白在主動脈夾層中表達上調，其經過氧化應激可變成oxLDL。氧化應激與主動脈夾層密切相關，可誘導主動脈中層發(fā)生退行性病變，導致主動脈壁變薄[12]。有研究表明，ApoH與oxLDL結合可誘導巨噬細胞向泡沫細胞分化，促進細胞內活性氧及凋亡相關蛋白Bax表達升高，進而促進細胞凋亡[13]。主動脈夾層的主要病理特征之一是平滑肌細胞丟失，而細胞內ROS升高及細胞凋亡均可以導致平滑肌細胞丟失[14]。有研究表明，血管發(fā)育障礙、動脈粥樣硬化及脂質代謝異常等均與主動脈夾層的發(fā)病機制密切相關[14-15]。在本研究中，TAAD病人主動脈組織中ApoH蛋白表達水平升高，表明ApoH在主動脈夾層形成的病理過程中具有調控作用，可能通過調控P-Erk信號通路導致血管發(fā)育不良，從而促進主動脈夾層形成，也可能通過與oxLDL結合調控Bax表達誘導平滑肌細胞凋亡，影響主動脈夾層的發(fā)生。相關性分析揭示了ApoH的表達變化與主動脈直徑無顯著相關性，表明ApoH可能與主動脈夾層的形成有關，但與主動脈夾層的進展無關[16]。ApoH被發(fā)現與多種心血管疾病密切相關，可作為臨床上評估心血管疾病風險的指標。