李建 朱林 查正江 劉杰 黃純 李志宏

美國(guó)《發(fā)病率和死亡率周報(bào)》(Morbidity and Mortality Weekly Report,MMWR)數(shù)據(jù)顯示,相比2007年,2013年顱腦損傷相關(guān)的急診就診量增幅超過(guò)50%,增加的主要原因是跌倒或高處墜落、物體撞擊和交通事故[1]。顱腦損傷的后果包括認(rèn)知障礙、行為障礙、心理障礙。徐正芹等[2]研究表明，在急性顱腦損傷中血清外泌體內(nèi)泛素碳末端水解酶L1及神經(jīng)絲蛋白輕鏈多肽可作為顱腦損傷的預(yù)后標(biāo)志物。miRNA是一類長(zhǎng)度在23 bp左右的單鏈RNA分子，它們不表達(dá)蛋白質(zhì)，但參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn) ，microRNA(miRNA) 可以作為疾病生物標(biāo)志物。全血或特定血液成分中的miRNA是疾病診斷和預(yù)后的潛在標(biāo)志物[3-4]。有研究表明，miR-125b-2-3p與腫瘤的惡性程度有關(guān)。Meng等[5]發(fā)現(xiàn)，miR-125b-2-3p腎透明細(xì)胞癌預(yù)后有關(guān)，并且能夠通過(guò)EGR1促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。Zeng等[6]發(fā)現(xiàn)，lncRNA XIST/miR-125b-2-3p軸能夠調(diào)節(jié)結(jié)腸癌的細(xì)胞增殖和化療敏感度。我們通過(guò)生物信息技術(shù)分析GEO GSE123336數(shù)據(jù)集，聯(lián)合我院病人血清樣本進(jìn)行分析，探討血清miR-125b-2-3p與顱腦損傷病人嚴(yán)重程度和預(yù)后的關(guān)系。

材料與方法

1.公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù):(1)GEO數(shù)據(jù)庫(kù):本研究使用GEO數(shù)據(jù)集GSE123336對(duì)顱腦損傷血清miRNA進(jìn)行篩選，該數(shù)據(jù)集包含了綜合格斗(Mixed Martial Arts，MMA)頭部擊打次數(shù)，比賽前、比賽后不同時(shí)間的血清miRNA測(cè)序結(jié)果[7]，因此，這一部分?jǐn)?shù)據(jù)是配對(duì)數(shù)據(jù)。由于該數(shù)據(jù)集中樣本比較復(fù)雜，包含唾液和血清的測(cè)序結(jié)果。本研究不涉及唾液miRNA表達(dá)量，只選用了該數(shù)據(jù)集中的部分?jǐn)?shù)據(jù)。納入共計(jì)34個(gè)參賽者，僅分析比賽前、比賽后當(dāng)天的血清數(shù)據(jù)。(2)mirPATH數(shù)據(jù)庫(kù):為了研究差異miRNA可能的機(jī)制，本研究選用mirPATH數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)8個(gè)差異miRNA進(jìn)行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)聚類分析[8]。初步判斷差異miRNA可能涉及的功能通路。

2.臨床樣本：本研究收集以下病人血清：閉合性顱腦損傷輕型、中型、重型、特重型。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合主要診斷，除腦外傷以外無(wú)其他臟器外傷破裂；(2)年齡18～85周歲；(3)無(wú)嚴(yán)重慢性疾病病史；(4)頭部創(chuàng)傷6小時(shí)內(nèi)；(5)無(wú)長(zhǎng)期用藥史；(6)既往無(wú)精神、智力異常；(7)無(wú)嚴(yán)重胸腹部外傷。由于閉合性顱腦損傷輕型發(fā)病率高，樣本量龐大，本研究中并不需要納入所有的輕癥病人。因此只涉及2021年4月1日～2021年4月30日期間的閉合性顱腦損傷輕型的非手術(shù)病人，共27例。閉合性顱腦損傷(中型、重型、特重型)收集的病例為2020年6月1日～2021年4月30日間接受血腫清除術(shù)的病人，共61例。我院共納入病人88例，其中男65例，女23例。閉合性顱腦損傷輕型27例，中型13例，重型42例，特重型6例。男性病人的miR-125b-2-3p表達(dá)量為2.26±0.94，女性病人為2.02±0.96，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)?；€資料中格拉斯哥昏迷評(píng)分(GCS)、格拉斯哥預(yù)后評(píng)分(GOS)、住院時(shí)間與性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 樣本基線資料

二、方法

1.病人入院后急診采血時(shí)順便采集血樣3 ml，置于無(wú)抗凝成分的采血管。靜置于4 ℃冰箱1小時(shí)血樣凝固后，在4 ℃，2 000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心15分鐘，將血清和細(xì)胞成分分裝進(jìn)兩個(gè)凍存管。將凍存管編號(hào)后凍存進(jìn)-80 ℃冰箱中。

2.qRT-PCR：miRNA使用血清/血漿 miRNA提取分離試劑盒從血清中提取。每份血清樣品取200 μl，提miRNA前加入cel-miR-39-3p 標(biāo)準(zhǔn)品1 μl用作外參。cel-miR-39-3p Standard RNA(miRB0000010-3-1)購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司。逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)使用Bulge-Loop miRNA qRT-PCR Starter Kit，在Icycling GT9612 PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，在QuantStudio3儀器進(jìn)行熒光定量PCR。目標(biāo)引物使用銳博公司的Bulge-Loop miR-125b-2-3p Primer Set(MQPS0000513-1-100)。外參引物使用Bulge-Loop cel-miR-39-3p Primer Set。miRNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR反應(yīng)步驟遵循試劑盒說(shuō)明書。

3.數(shù)據(jù)庫(kù)分析流程：下載數(shù)據(jù)后首先清理平均表達(dá)量≤10的miRNA，表達(dá)量過(guò)低的miRNA受到測(cè)量誤差的影響較大，導(dǎo)致差異是隨機(jī)出現(xiàn)的。用R語(yǔ)言limma包進(jìn)行差異分析，差異miRNA的篩選條件為|log2FC|≥1，P≤0.001。用mirPATH數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異miRNA進(jìn)行KEGG聚類分析，初步判斷差異miRNA可能涉及的功能通路。用mirPATH提供的miRNA-mRNA相互作用數(shù)據(jù)繪制互作網(wǎng)絡(luò)。判斷差異miRNA主要互作蛋白。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果

1.GSE123336顯示miR-125b-2-3p在顱腦創(chuàng)傷組血清含量顯著上升：我們對(duì)GSE123336進(jìn)行差異分析，設(shè)置篩選條件為|log2FC|≥1，P≤0.001。顯著差異的miRNA一共8個(gè)(圖1A)，其中顯著性最高的3個(gè)miRNA見(jiàn)表2。由于miR-125b-2-3p在數(shù)據(jù)庫(kù)中的顯著性要高于miR-10b-5p。因此，我們選擇miR-125b-2-3p進(jìn)行進(jìn)一步研究。使用mirPATH數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)8個(gè)差異進(jìn)行KEGG富集分析后發(fā)現(xiàn)，差異miRNA功能主要富集在以下通路(圖1B)：Renal cell carcinoma,Glycosphingolipid biosynthesis,Proteoglycans in cancer,Ubiquitin mediated proteolysis,TGF-beta signaling pathway,MAPK signaling pathway,Mucin type O-Glycan biosynthesis,Sphingolipid signaling pathway,Non-small cell lung cancer。將miR-125b-2-3p和富集分析中的互作基因提取出來(lái)構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)(圖1C)。

A:GEO數(shù)據(jù)集 GSE123336差異基因熱圖。B:mirPATH數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異miRNA的富集分析結(jié)果。C:mirPATH富集分析中涉及的蛋白與miR-125b-2-3p互作網(wǎng)絡(luò)。黃色MAPK信號(hào)通路，藍(lán)色Sphingolipid(鞘磷脂類)信號(hào)通路，其他顏色表示其他通路

表2 Top3顯著的miRNA

2.miR-125b-2-3p隨著顱腦損傷嚴(yán)重程度顯著上調(diào)：閉合性顱腦損傷輕型病人miR-125-2-3p表達(dá)量1.02±0.36，中型病人為2.23±0.53，重型病人為3.33±0.90，特重型為3.74±1.06(圖2A)。相關(guān)性分析提示，miR-125b-2-3p與GCS評(píng)分呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A．顱腦損傷嚴(yán)重程度與miR-125b-2-3p的關(guān)系：?jiǎn)我蛩胤讲罘治?P<0.05)，兩兩比較除重型和特重型之間無(wú)顯著差異，其他各組兩兩比較均存在顯著差異(P<0.05)。B.miR-125b-2-3p血清表達(dá)量和GCS評(píng)分的相關(guān)性分析miR125b-2-3p表達(dá)量和損傷嚴(yán)重程度的關(guān)系

3.高表達(dá)的miR-125b-2-3p預(yù)示著不良的預(yù)后：我們分析了不同GOS預(yù)后分級(jí)的miR-125b-2-3p表達(dá)量。結(jié)果顯示，GOS Ⅰ/Ⅱ級(jí)miR-125b-2-3p相對(duì)表達(dá)量為4.12±0.74，Ⅲ級(jí)為為3.45±0.51，Ⅳ級(jí)為為2.40±0.66，Ⅴ級(jí)為為1.34±0.71(圖3A)。越高的miR-125b-2-3p表達(dá)顯預(yù)示著越差的預(yù)后(圖3A)。以GOS Ⅰ/Ⅱ級(jí)為陽(yáng)性事件，以GOS Ⅲ/Ⅳ級(jí)為陰性事件進(jìn)行的ROC分析，ROC曲線下面積等于0.89(圖3B)。這意味著miR-125b-2-3p對(duì)不良預(yù)后(GOS Ⅰ/Ⅱ級(jí))有著較高的預(yù)測(cè)效能。

A.血清miR-125b-2-3p表達(dá)量與GOS預(yù)后分級(jí)的關(guān)系。B.ROC分析圖3 miR-125b-2-3p和GOS預(yù)后的關(guān)系

討論

顱腦損傷除了對(duì)外傷血腫壓迫的早期手術(shù)治療有明確療效外，并不存在特效的治療方法。重度顱腦損傷病人有相當(dāng)比例的病人預(yù)后屬于GOS Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)。病人預(yù)后GOS Ⅱ級(jí)實(shí)際上會(huì)比GOS Ⅰ級(jí)給家庭帶來(lái)更大的負(fù)擔(dān)。

2015年瑞典開(kāi)展一項(xiàng)涉及182例顱腦損傷病人的研究，該研究指出，血清NF-L可以評(píng)估6～12個(gè)月的TBI預(yù)后，是GOS預(yù)后的獨(dú)立因子[9]。李煥良等[10]研究顯示，TC、LDL-C、HbA1c和空腹血糖水平是影響顱腦損傷病人預(yù)后的危險(xiǎn)因素。類似的，血清UCH-L1可以預(yù)測(cè)輕中度顱腦損傷病人是否需要神經(jīng)外科干預(yù)[11]。第二天的血清UCH-L1 濃度預(yù)示著不良預(yù)后。

生物信息技術(shù)是發(fā)現(xiàn)潛在分子機(jī)制的有效手段。戴嘉婧等[12]通過(guò)生物信息技術(shù)發(fā)現(xiàn)，與三陰性乳腺癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)的潛在調(diào)控軸：hsa_circ_0001361/miR-93-3p/UBE2G2和hsa_circ_0002874/miR-2115-5p/DTX3L。我們對(duì)GEO GSE123336數(shù)據(jù)集進(jìn)行生物信息挖掘。該研究包含了MMA比賽頭部擊打次數(shù)和血清miRNA測(cè)序的結(jié)果。對(duì)該數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析后我們找到top 3個(gè)最顯著的差異miRNA：miR-125b-2-3p、miR-10b-5p、miR-99b-5p。而miR-125b-2-3p差異分析的P值最顯著。本研究把重點(diǎn)放在miR-125b-2-3p。結(jié)果顯示，血清miR-125b-2-3p在頭部外傷后顯著增加。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-125b-2-3p和其他差異miRNA共同富集到以下通路：Renal cell carcinoma Glycosphingolipid biosynthesis,Proteoglycans in cancer,Ubiquitin mediated proteolysis,TGF-beta signaling pathway,MAPK signaling pathway,Mucin type O-Glycan biosynthesis,Sphingolipid signaling pathway,Non-small cell lung cancer。富集的通路中與miR-125b-2-3p互作的蛋白主要涉及MAPK通路和Sphingolipid(鞘磷脂類)信號(hào)通路；而MAPK通路與缺血再灌注損傷、炎癥損傷有明確關(guān)系[13-14]。Sphingolipid信號(hào)影響細(xì)胞結(jié)局和免疫應(yīng)答[15]。血清miR-125b-2-3p的表達(dá)量改變可能是由于顱腦損傷后腦細(xì)胞內(nèi)miR-125b-2-3p入血。而在腦細(xì)胞內(nèi)失調(diào)的miR-125b-2-3p可能影響病人最終結(jié)局。

血清miR-125b-2-3p的表達(dá)量隨著顱腦損傷嚴(yán)重程度的增加顯著增加(P<0.05)。但在重型和特重型無(wú)顯著差異，這可能是由于特重型病人樣本量不足導(dǎo)致。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)GCS評(píng)分和miR-125b-2-3p呈顯著負(fù)相關(guān)，P<0.05。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)隨著GOS預(yù)后分級(jí)的增高，miR-125b-2-3p顯著降低。GOS預(yù)后分級(jí)等級(jí)越高表明預(yù)后越好。因此我們可以得出結(jié)論，血清miR-125b-2-3p是潛在的顱腦外傷預(yù)后標(biāo)志物。為了判斷預(yù)測(cè)效能，我們進(jìn)行了ROC分析。結(jié)果顯示，miR-125b-2-3p對(duì)GOS Ⅰ/Ⅱ級(jí)的ROC曲線下面積達(dá)到0.89。預(yù)測(cè)效能較好。

黎入熒[16]的一項(xiàng)研究成果顯示，腦梗死病人外泌體源性miR-125b-2-3p表達(dá)量對(duì)腦梗死有較好的診斷效能。該研究發(fā)現(xiàn)，在腦梗死病人中外泌體源性miR-125b-2-3p在血漿中表達(dá)顯著上調(diào)。這與我們的研究相符合，但黎入熒[16]發(fā)現(xiàn)，外泌體miR-125b-2-3p表達(dá)水平與神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度無(wú)關(guān)，與腦梗死嚴(yán)重程度無(wú)關(guān)，這與我們研究趨勢(shì)不相符合?？赡艿脑蚴抢枞霟蓹z測(cè)的是血清外泌體，而我們的研究并未局限在外泌體。另外，顱腦損傷miR-125b-2-3p釋放機(jī)制可能與腦梗死不同，損傷可能更傾向于細(xì)胞損傷后直接釋放入血。有研究指出，血清miR-125b-5p表達(dá)水平在急性缺血性腦卒中病人中明顯升高,且與Hcy、Hs-CRP及MMP-9水平相關(guān)[17]。miR-125b-5p和miR-125b-2-3p是不同的miR-125b成熟體，現(xiàn)有的研究成果表明，在中樞疾患中，miR-125b家族的表達(dá)量受到影響。miR-125b-2-3p在顱腦損傷中屬于較新穎的發(fā)現(xiàn)。

本研究結(jié)果提示，血清miR-125b-2-3p表達(dá)量是潛在的閉合性顱腦損傷病人預(yù)后標(biāo)志物。較高的血清miR-125b-2-3p表達(dá)量預(yù)示著不良預(yù)后。