李光美,張 婷,趙 偉

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴州 貴陽 550002;2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,貴州 貴陽 550001)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是一種以高血糖、相對(duì)缺乏胰島素、胰島素抵抗等為主要特征的代謝性疾病,發(fā)病率較高,已成為我國公共衛(wèi)生領(lǐng)域面臨的主要問題。中醫(yī)在治療糖尿病及其并發(fā)癥方面具有顯著療效。《素問·奇病論》曰:“此人必?cái)?shù)食甘美而多肥也……轉(zhuǎn)為消渴,治之以蘭,除陳氣也?！痹撜撌鲋鲝堖\(yùn)用芳香化濁之佩蘭治療糖尿病。佩蘭具有芳香化濕、醒脾開胃、發(fā)表解暑的功效,尤善治脾經(jīng)濕熱。相關(guān)研究表明,佩蘭可下調(diào)T2DM大鼠肝臟中DGAT 2基因與蛋白表達(dá),改善脂代謝紊亂[1-2],同時(shí),佩蘭的主要成分香芹酚可減輕T2DM患者的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和血管炎癥[3]。但佩蘭治療T2DM的更多活性成分、作用靶點(diǎn)及通路尚有待探究?！皾岫尽笔侵阁w內(nèi)痰飲、水濕、瘀血不能及時(shí)排出而壅積化生的病理產(chǎn)物,又是損傷人體臟腑經(jīng)絡(luò)及氣血陰陽的致病因素[4],濁毒為患被認(rèn)為是糖尿病及其并發(fā)癥的核心所在[5]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以從活性成分-靶點(diǎn)、靶點(diǎn)蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)分析及基因本體(gene ontology,GO)、京都基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析等進(jìn)行直觀、全面、系統(tǒng)地闡述藥物與疾病的潛在關(guān)系。本研究主要基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討佩蘭干預(yù)2型糖尿病的作用機(jī)制,以期為后期臨床研究提供新思路。

1 資料與方法

1.1 佩蘭活性成分、靶點(diǎn)檢索及篩選與“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 以佩蘭為關(guān)鍵詞,從TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)中獲取藥物活性成分。將口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、藥物相似性(drug likeness,DL)≥0.18作為篩選條件[6],從而得到目標(biāo)活性成分及蛋白靶點(diǎn),并在Uni-Prot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)標(biāo)準(zhǔn)化蛋白質(zhì)靶點(diǎn)信息。再將其篩選出的活性成分和標(biāo)準(zhǔn)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2版軟件,構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 T2DM的疾病靶標(biāo)獲取及交集靶點(diǎn)的獲取 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com),搜索關(guān)鍵詞為“Diabetes Mellitus”或“Diabetes”,篩選關(guān)鍵詞為“TypeⅡDiabetes mellitus”或“TypeⅡdibetes”,得出T2DM的疾病靶點(diǎn),并將其與篩選得到的佩蘭靶點(diǎn)通過韋恩圖(Draw Venn Diagram)得到交集靶點(diǎn)。

1.3 構(gòu)建“藥物-疾病”蛋白互作PPI圖 將佩蘭干預(yù)T2DM的蛋白靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫平臺(tái)(https://www.string-db.org)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖,再將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化處理分析,以度值(degree)和連接評(píng)分(combined score)分析靶點(diǎn)之間相互的作用關(guān)系。

1.4 GO功能富集分析和KEGG通路分析 運(yùn)用Metascape(https://metascape.org/gp/index.html/main/step1)對(duì)篩選得到的佩蘭干預(yù)T2DM的潛在蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析,以P＜0.01作為篩選條件,對(duì)富集的通路和GO功能排序,運(yùn)用微生信在線(http://www.bioinformatics.com.cn)及Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化處理,并構(gòu)建佩蘭干預(yù)T2DM的關(guān)鍵靶點(diǎn)及信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖,進(jìn)一步闡述蛋白靶點(diǎn)與通路的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 佩蘭活性成分及靶點(diǎn)篩選結(jié)果 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共獲得60個(gè)佩蘭的已知成分,以O(shè)B≥30%和DL≥0.18作為篩選條件獲得11個(gè)活性成分,剔除在TCMSP數(shù)據(jù)庫未找到相關(guān)蛋白靶點(diǎn)的4個(gè)成分,共納入佩蘭的7個(gè)活性成分(見表1),再將其通過TCMSP數(shù)據(jù)庫得到相應(yīng)靶點(diǎn)名稱,去重后得到87個(gè)蛋白靶點(diǎn),將其蛋白靶點(diǎn)名稱輸入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫,獲得其標(biāo)準(zhǔn)化蛋白靶點(diǎn)名稱共79個(gè)。

表1 佩蘭活性成分

2.2 藥物“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將佩蘭的活性成分與蛋白靶點(diǎn)通過Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖,網(wǎng)絡(luò)圖共包含86個(gè)節(jié)點(diǎn)(7個(gè)活性成分和79個(gè)靶點(diǎn))和101條線,其中菱形節(jié)點(diǎn)代表活性成分,正六邊形節(jié)點(diǎn)代表蛋白靶點(diǎn),線代表活性成分與蛋白靶點(diǎn)的關(guān)系,其中活性成分與degree和節(jié)點(diǎn)(betweenness)呈正相關(guān)[7]。結(jié)果顯示,木犀草素(luteolin)、豆甾醇(Stigmasterol)、澤蘭苦素(Eupatoriopicrin)等在網(wǎng)絡(luò)圖中具有樞紐作用,這可能是佩蘭干預(yù)T2DM的關(guān)鍵活性成分。見圖1。

圖1 佩蘭干預(yù)2型糖尿病藥物活性成分靶點(diǎn)圖

2.3 獲取T2DM的疾病靶標(biāo)及“藥物-疾病”交集靶標(biāo) 通過Genecards數(shù)據(jù)庫獲取T2DM靶點(diǎn),以Relevance score≥24.2作為標(biāo)準(zhǔn),獲得1 209個(gè)蛋白靶點(diǎn)。分別將佩蘭與T2DM的蛋白靶點(diǎn)導(dǎo)入韋恩圖后得到45個(gè)交集靶點(diǎn)。見表2。

表2 佩蘭干預(yù)2型糖尿病的有效靶點(diǎn)

2.4 “藥物-疾病蛋白互作”PPI圖 將二者交集蛋白靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING在線數(shù)據(jù)庫,限定物種為“Homo sapiens”,選取相互作用閾值高于0.9的高置信度數(shù)據(jù),隱藏?zé)o蛋白互作關(guān)系的靶點(diǎn)[8]后得到37個(gè)節(jié)點(diǎn)、114條邊、平均節(jié)點(diǎn)度數(shù)為5.07的蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)圖。繼將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化處理分析,以degree值和combined score值分析靶點(diǎn)之間相互的作用關(guān)系。節(jié)點(diǎn)的形狀大小代表degree值,圓形越大,degree值越高,反之越低;節(jié)點(diǎn)之間連線的粗細(xì)代表combined score值,線條越粗,互作分?jǐn)?shù)越高,反之越低,以此篩選出網(wǎng)絡(luò)中信息傳遞效率更高、影響作用更大的核心靶點(diǎn)。結(jié)果顯示AKT1(protein kinase B)、TP53(tumor suppressor p53)、JUN(Jun Proto-Oncogene)、IL6(Interleukin 6)、TNF(Tumor Necrosis Factor)、VEGFA(vascular endothelial growth factor A)、MAPK1(mitogen-activated protein kinase 1)為其核心靶點(diǎn)。見圖2。

圖2 佩蘭干預(yù)2型糖尿病核心蛋白靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析運(yùn)用Metascape數(shù)據(jù)庫對(duì)佩蘭干預(yù)T2DM的45個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG信號(hào)通路富集分析。GO分析得到1 290個(gè)GO條目(P＜0.01),其中生物過程(biological process,BP)1 187個(gè),細(xì)胞組成(cellular component,CC)46個(gè),分子功能(molecular function,MF)57個(gè),將三者可信度前10的條目運(yùn)用微生信在線進(jìn)行可視化處理(見圖3),結(jié)果主要涉及氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡通路等生物過程。KEGG通路富集分析獲得242條通路(P＜0.01),篩選出可信度前18的信號(hào)通路,利用微生信在線進(jìn)行可視化處理(圖4),主要涉及癌癥通路(Pathways in cancer)、PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、白細(xì)胞介素-17信號(hào)通路(IL-17 signaling pathway)、胰島素抵抗信號(hào)通路(insulin resistance)、AGE/RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic)等。并將篩選出的信號(hào)通路利用Cytoscape3.7.2軟件進(jìn)行可視化處理,得出靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。見圖5。

圖3 佩蘭干預(yù)2型糖尿病核心靶點(diǎn)GO富集分析圖

圖4 核心靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

圖5 靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

3.1 佩蘭治療T2DM的有效成分分析 本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)佩蘭干預(yù)T2DM的主要活性成分及蛋白靶點(diǎn)。根據(jù)藥物活性成分靶點(diǎn)圖可知,木犀草素作為佩蘭的主要活性成分,可能在干預(yù)T2DM的方面發(fā)揮重要作用。木犀草素是一種黃酮類化合物,具有抗氧化、抗炎和神經(jīng)保護(hù)活性。目前認(rèn)為代謝性炎癥與T2DM密切相關(guān),是T2DM的一個(gè)關(guān)鍵組成部分,可導(dǎo)致胰島素抵抗[9]。研究發(fā)現(xiàn),木犀草素夠明顯改善早期糖尿病大鼠心功能,減少心室肥大[10],在治療T2DM血管內(nèi)皮及血管功能障礙中發(fā)揮抗炎作用[11],并減輕糖尿病大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)和膽堿酯酶活性,改善神經(jīng)元損傷和認(rèn)知能力[12]。基于以上研究,可見木犀草素在治療T2DM及其并發(fā)癥方面療效顯著,可能與其抑制代謝炎癥作用有關(guān),這也與本研究篩選出的佩蘭干預(yù)T2DM的活性成分吻合。

3.2 佩蘭治療T2DM的有效靶點(diǎn)分析 從PPI圖可知,AKT1、TP53、IL6、TNF等作為核心靶點(diǎn)可能在佩蘭干預(yù)T2DM過程中發(fā)揮重要作用。AKT也被稱為蛋白激酶B,對(duì)細(xì)胞遷移和生長的調(diào)控至關(guān)重要,AKT1作為AKT的一種亞型在人體中廣泛表達(dá),主要通過磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK1)和m TOR復(fù)合物2(m TORC2)被激活[13-15]。研究發(fā)現(xiàn)AKT可直接抑制Fox01,而降低體內(nèi)葡萄糖水平[16]。腫瘤抑制基因TP53位于17號(hào)染色體上,TP53的多態(tài)性已成為癌癥研究的熱點(diǎn),同時(shí)也有研究證實(shí)了TP53中的rs1042522與T2DM的風(fēng)險(xiǎn)有顯著的相關(guān)性[17]。IL-6在炎性反應(yīng)中處于重要地位,IL6R是miR-22的靶基因,通過JAK/STAT信號(hào)通路的miR-22調(diào)控,抑制T2DM胰島β細(xì)胞的存活和凋亡[18]。TNF為腫瘤壞死因子,其作為炎性反應(yīng)的核心因子參與了糖尿病發(fā)生發(fā)展的過程,TNF-α的表達(dá)與空腹血糖水平呈顯著正相關(guān)[19],抑制TNF-α的表達(dá)使胰島素敏感性增加,過度表達(dá)則誘發(fā)胰島素抵抗[20]。以上研究表明,本研究篩選出的佩蘭治療T2DM的蛋白靶點(diǎn)多與細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)相關(guān)。胰島β細(xì)胞分泌缺乏、功能下降甚至細(xì)胞凋亡是T2DM發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵原因,根據(jù)本研究的預(yù)測(cè),佩蘭可能通過抑制胰島細(xì)胞凋亡,抑制炎癥因子釋放而治療T2DM。

3.3 佩蘭治療T2DM的GO富集分析及KEGG通路分析 根據(jù)靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖可知,PI3 K-Akt信號(hào)通路、AGE/RAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、胰島素抵抗信號(hào)通路等與T2DM密切相關(guān)。PI3K/AKT信號(hào)通路是胰島素代謝的主要途徑,該通路增加葡萄糖利用并減少肝臟和肌肉中的糖異生,進(jìn)而調(diào)節(jié)脂質(zhì)和葡萄糖代謝平衡[21-23],并在T2DM高血糖癥、神經(jīng)退行性變,以及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊病理性新血管的形成和發(fā)展中起到抑制作用[24]。AGE/RAGE信號(hào)通路在高血糖和鈣化條件下,可以通過PKC、p38 MAPK、fetuin-A、TGF-β、NF-κB 和 ERK1/2 信 號(hào) 通路極大影響細(xì)胞和全身對(duì)增加骨基質(zhì)蛋白的反應(yīng),并通過激活Nox-1和降低SOD-1的表達(dá)來增加氧化應(yīng)激以促進(jìn)糖尿病介導(dǎo)的血管鈣化[25],是糖尿病周圍神經(jīng)病變及糖尿病腎病發(fā)病的重要機(jī)制[26]。IL-17信號(hào)通路是一種參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子,研究發(fā)現(xiàn),IL-17與纖維化相關(guān)的糖尿病性心肌病相關(guān)[27],且IL-17信號(hào)通路可能是種植體周圍炎和T2DM病之間的主要分子機(jī)制[28]。胰島素抵抗信號(hào)通路蛋白包括PI3K/Akt、PKC、MAPK、AMPK、NF-κB等[29]。李建萍等[30]初步發(fā)現(xiàn)丹參-紅花配伍對(duì)于胰島素信號(hào)通路中代謝調(diào)控途徑和有絲分裂調(diào)控途徑的穩(wěn)態(tài)失衡具有顯著的調(diào)控作用?；谝陨险撌?佩蘭作用于多條通路對(duì)T2DM發(fā)揮干預(yù)作用,但具體機(jī)制還有待深入研究。

4 小結(jié)

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)佩蘭干預(yù)T2DM的復(fù)雜機(jī)制作了簡單探索,得出了佩蘭干預(yù)T2DM的主要活性成分、蛋白靶點(diǎn)及相關(guān)通路多與細(xì)胞凋亡、炎癥因子相關(guān),為探索芳香化濁藥物對(duì)T2DM的干預(yù)作用作了基礎(chǔ)鋪墊。結(jié)合本項(xiàng)目組前期研究成果,以佩蘭為君藥的中藥復(fù)方“濁毒清”有效治療T2DM及其并發(fā)癥[31-34]。臨床研究表明,濁毒清改善胰島素抵抗的機(jī)制與其抗炎作用有關(guān),濁毒清可通過降低炎癥因子水平、抑制代謝性炎性反應(yīng)進(jìn)而改善胰島素抵抗[35],但其發(fā)揮作用的主要活性成分及作用通路還有待研究,后續(xù)將在本研究的基礎(chǔ)上,提取相關(guān)活性成分,探討佩蘭干預(yù)T2DM的具體作用機(jī)制,為臨床運(yùn)用佩蘭提供更多的理論基礎(chǔ)。