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        基于高效液相色譜法對淡豆豉發(fā)酵過程中6種異黃酮含量的動態(tài)分析

        2022-11-15 06:46:54曹冬英謝思靜曾思婷隋利強徐偉福建中醫(yī)藥大學藥學院福建省中藥炮制技術傳承基地福州350122
        中南藥學 2022年9期
        關鍵詞:淡豆豉木素異黃酮

        曹冬英,謝思靜,曾思婷,隋利強,徐偉(福建中醫(yī)藥大學藥學院,福建省中藥炮制技術傳承基地,福州350122)

        淡豆豉,又名“香豉”“豆豉”“豉”,為豆科植物大豆Glycine max(L.)Merr.的干燥成熟種子(黑豆)的發(fā)酵加工品[1]。其味苦、辛,性涼,歸肺、胃經,有解表、除煩、宣發(fā)郁熱的作用,在臨床上主要用于感冒、寒熱頭痛、煩躁胸悶、虛煩不眠等癥[2]。

        淡豆豉歷代炮制方法有燒制、熬制、炒制、清酒制、醋蒸制、炒焦法、鹽醋拌蒸法以及清蒸法等[3-6]。2020年版的《中國藥典》收載的淡豆豉發(fā)酵方法為青蒿、桑葉加水煎煮,煎液拌入大豆,大豆吸汁后蒸透,晾涼,再用青蒿、桑葉渣悶制使發(fā)酵至黃衣上遍,除去藥渣之后再進行悶制直到香氣溢出,再略蒸,干燥即得淡豆豉成品[1]。

        淡豆豉在不同地區(qū)炮制方法略有差異,《全國中藥炮制經驗與規(guī)范集成》(2017年版增修本)[7]中一共收載了42 種關于淡豆豉的炮制方法,其中24 種方法是直接發(fā)酵不經過悶制,18 種方法經過發(fā)酵后再悶制?!度珖兴庯嬈谥埔?guī)范輯要》(2016年版)[8]中則收載了20 種淡豆豉的炮制方法,其中,直接發(fā)酵和經過發(fā)酵后再悶制的方法各10 種。關于淡豆豉發(fā)酵過程中再悶制工藝合理性與否也存在爭議。

        淡豆豉中含有黃酮類、多糖類、豆豉纖溶酶、大豆皂苷、蛋白質等成分,其中異黃酮具有預防更年期、乳腺癌以及改善骨質疏松,預防心血管疾病、阿爾茨海默病等藥理活性[9],并且在淡豆豉中主要以游離型的苷元和結合型的糖苷存在,故本文主要通過收集淡豆豉不同發(fā)酵階段的樣品,通過HPLC 法測定6 種異黃酮的含量,分析不同發(fā)酵階段6 種異黃酮含量動態(tài)變化,探討發(fā)酵過程中再悶制環(huán)節(jié)的必要性,為淡豆豉的工藝和原理研究提供理論參考。

        1 材料

        LC-20A 型高效液相色譜儀(日本島津公司);SQP 型十萬分之一分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司);大豆苷(批號:P14M10F83057)、大豆苷元(批號:C06N6Y5504)、黃豆黃苷(批號:P06J9F65073)、黃豆黃素(批號:G16J9C65571)、染料木苷(批號:P09M8F31018)、染料木素(批號:H30A9Z69019)(上海源葉生物科技有限公司,以上對照品純度均大于98%);甲醇為色譜純(德國Merck 公司);甲酸為色譜純(上海阿拉丁試劑有限公司)。

        黑豆(市售),經福建中醫(yī)藥大學車蘇容副教授鑒定為豆科植物黑大豆Glycine max(L.)Merr.的成熟種子。桑葉(北京本草方源藥業(yè)集團有限公司,批號:20170508)經福建中醫(yī)藥大學車蘇容副教授鑒定為桑科植物桑Morus alba(L.)的葉。青蒿(安徽順和堂中藥飲片有限公司,批號:171201)經福建中醫(yī)藥大學車蘇容副教授鑒定為菊科植物黃花蒿Artemisia annua(L.)的干燥地上部分。

        2 方法與結果

        2.1 淡豆豉樣品的制備[1]

        黑大豆洗凈,取青蒿、桑葉加水煎煮,紗布過濾,濾渣備用,煎液濃縮,冷卻拌入凈大豆,藥汁吸盡后蒸透,取出,晾涼。置容器內,紗布覆蓋,濾過的青蒿、桑葉渣均勻覆蓋于紗布上,置于室溫,悶制發(fā)酵,于發(fā)酵第2日、第4日、第6日、第13日分別取出部分黑豆留作淡豆豉樣品,并標記為Y-2、Y-4、Y-6、Y-13。

        取發(fā)酵后的淡豆豉清洗稍晾,置于密閉容器內水浴50 ~60℃,保溫,進行第二次悶制發(fā)酵,分別在第二次發(fā)酵的第3日、第9日和第15日分別取出部分黑豆留作淡豆豉樣品,并標記為Y悶-3、Y悶-9、Y悶-15。

        取Y-2、Y-4、Y-6、Y-13、Y悶-3、Y悶-9、Y悶-15 共7 份樣品,干燥,粉碎,過二號篩。

        2.2 色譜條件[10-11]

        采用Welch Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以甲醇(A)-甲酸0.1%(B)為流動相,梯度洗脫(0 ~7 min,25%~30%A;7 ~12 min,30% ~45%A;12 ~20 min,45%A;20 ~27 min,45% ~60%A;27 ~33 min,60% ~75%A;33 ~35 min,75%~25%A;35 ~40 min,25%A),流速為0.8 mL·min-1,柱溫為30℃,檢測波長為254 nm。理論塔板數均不低于5000。樣品和對照品HPLC色譜圖見圖1。

        圖1 對照品及淡豆豉樣品HPLC 色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of reference substance and Sojae Seman Praeparatum sample

        2.3 混合對照品溶液的制備

        取對照品大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素適量,精密稱定,置50 mL 量瓶中,加入70%甲醇超聲溶解,制成質量濃度分別為730、1200、916、608、892 和564 μg·mL-1的單一對照品儲備液,備用。分別精密量取上述對照品儲備液各1 mL,置同一10 mL 量瓶中,加70%甲醇至刻度混勻,得到質量濃度為大豆苷73 μg·mL-1、大豆苷元120 μg·mL-1、黃豆黃苷91.6 μg·mL-1、黃豆黃素60.8 μg·mL-1、染料木苷89.2 μg·mL-1、染料木素56.4 μg·mL-1的混合對照品溶液。

        2.4 供試品溶液的制備

        依次取樣品粉末(過二號篩)約1 g,精密稱定,分別置于50 mL 錐形瓶中,精密加入70%甲醇25 mL,稱重,加熱回流30 min,放冷,再稱重,用70%色譜甲醇補足減失的重量,搖勻,用0.22 μm 微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液至進樣瓶中備用。

        2.5 標準曲線的制備

        精密稱取大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素各對照品,加入70%甲醇超聲溶解,定容至5 mL 量瓶,再用70%甲醇稀釋為不同梯度質量濃度的混合對照品溶液。按“2.2”項下的色譜條件測定。以大豆苷、大豆苷元、黃豆黃苷、黃豆黃素、染料木苷、染料木素的質量濃度(X)為橫坐標,以峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線,見表1。

        表1 淡豆豉中6 種異黃酮的線性范圍考察結果Tab 1 Linear range of 6 isoflavones in Sojae Seman Praeparatum

        2.6 精密度試驗

        精密吸取“2.3”項下的混合對照品溶液10 μL,按照“2.2”項下的色譜條件連續(xù)進樣6 次測定,測得大豆苷元、大豆苷、黃豆黃素、黃豆黃苷、染料木素、染料木苷的峰面積RSD分別為0.078%、0.062%、0.042%、0.23%、0.039%、2.5%。說明精密度良好。

        2.7 重復性試驗

        稱取淡豆豉粉末,按“2.4”項下的方法制備成供試品溶液,按照“2.2”項下的色譜條件進樣6 次,計算得大豆苷、大豆苷元、黃豆黃苷、黃豆黃素、染料木苷、染料木素峰面積的RSD分別為3.0%、0.47%、2.6%、1.2%、2.8%、2.4%,結果表明方法重復性良好。

        2.8 穩(wěn)定性試驗

        精密稱取編號為Y悶-15 的淡豆豉粉末,按“2.4”項下的方法制備成供試品溶液,分別在0、2、4、8、12、24 h 按照“2.2”項下的色譜條件進樣測定,計算大豆苷、大豆苷元、黃豆黃苷、黃豆黃素、染料木苷、染料木素峰面積的RSD值分別為2.8%、1.9%、1.2%、0.71%、1.4%、1.2%。表明供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定。

        2.9 加樣回收試驗

        取編號為Y悶-15 的淡豆豉粉末,精密稱定約1 g,每份加入等量的6 份混合對照品溶液,按照“2.4”項下的方法制備供試品溶液,再按照“2.2”項下的色譜條件進樣測定,計算大豆苷、大豆苷元、黃豆黃苷、黃豆黃素、染料木苷、染料木素的平均加樣回收率為103.66%、99.51%、101.40%、99.44%、103.89%、101.76%;RSD分別為3.7%、2.5%、3.7%、3.6%、3.3%、3.3%。

        2.10 樣品的含量測定

        取編號為Y-2、Y-4、Y-6、Y-13、Y悶-3、Y悶-9、Y悶-15 的淡豆豉粉末樣品,精密稱取1 g,分別置于50 mL 錐形瓶中,再分別精密加入70%色譜甲醇25 mL,加熱回流30 min,放冷,再稱重,用70%色譜甲醇補足減失的重量,搖勻,用0.22 μm 微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液至進樣瓶中,按照“2.2”項下的方法進樣測定,代入回歸方程計算出每份樣品中6 種異黃酮的濃度以及6 種異黃酮的含量,結果見表2,用折線統(tǒng)計圖表示6 種異黃酮含量動態(tài)變化,見圖2。

        表2 淡豆豉不同發(fā)酵階段6 種異黃酮的含量(n =3)Tab 2 Content of 6 isoflavones in different fermentation stages of Sojae Seman Praeparatum (n =3)

        圖2 淡豆豉不同發(fā)酵階段6 種異黃酮含量動態(tài)變化趨勢圖Fig 2 Dynamic change of 6 isoflavones in different fermentation stages of Sojae Seman Praeparatum

        3 討論

        3.1 悶制過程中主要成分含量變化

        由圖2 可直觀看出,淡豆豉發(fā)酵過程中,大豆苷元、染料木素和黃豆黃素3 種苷元含量總體呈上升趨勢,以大豆苷元的變化趨勢最顯著;染料木苷、大豆苷和黃豆黃苷3 種苷含量總體呈下降趨勢,以染料木苷的下降趨勢最顯著。

        大豆苷元從發(fā)酵開始,含量變化上升顯著,第二次悶制的第3日含量上升最顯著;染料木素在第一次悶制發(fā)酵階段前6 d 含量變化不大,第13日含量有明顯上升趨勢;黃豆黃素在第一次悶制發(fā)酵的前4 d 含量增加最為顯著,此3 種苷元都是第二次悶制發(fā)酵階段第9日含量達到峰值,到第二次悶制發(fā)酵階段第15日含量有所下降,提示第二次悶制發(fā)酵階段對于苷元含量的積累有顯著影響,可嘗試縮短悶制時間。染料木苷從發(fā)酵開始,含量持續(xù)下降,并且下降幅度最大;大豆苷在發(fā)酵第4日含量下降幅度最大,此后含量呈較緩下降趨勢;黃豆黃苷在發(fā)酵前6 d 含量下降不大,第13日有明顯下降趨勢。此3 種苷類成分的含量都是第二次悶制發(fā)酵階段第9日達到最低值,但在第15日都有所上升。結果提示,在淡豆豉發(fā)酵過程中存在苷到苷元的轉化并且第二次悶制發(fā)酵的過程中苷和苷元會持續(xù)轉化。

        大豆苷具有良好的降血壓和改善腦循環(huán)的作用;大豆苷元具有類雌激素樣作用[12],對于治療婦女更年期綜合征等具有良好效果;黃豆黃苷具有抗病毒、抗菌的作用[13],可以防止骨質疏松和心腦血管疾?。稽S豆黃素除了能夠降低胃癌細胞的存活率[14],還可以誘發(fā)細胞程序性死亡;染料木苷具有抗增殖、抗腫瘤血管生成,以及誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡等作用[15];染料木素具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗凋亡等活性[16]。再悶制階段有利于苷向苷元轉化,該過程主要由于葡萄糖苷酶作用于糖苷型異黃酮的氧苷鍵,使其葡萄糖基團脫掉,供微生物代謝,使糖苷型異黃酮轉化為異黃酮苷元。因大豆苷元、染料木素等異黃酮苷元較糖苷型異黃酮具有更高的生物活性[17],所以淡豆豉發(fā)酵后解表、除煩功效增強。

        3.2 提取溶劑的優(yōu)化

        在前期試驗的基礎上,結合參考文獻,對淡豆豉中6 種異黃酮的提取溶劑進行了優(yōu)化,比較了甲醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇的提取效果。結果顯示,70%甲醇提取效果較好,且雜質相對較少,故本試驗采用70%甲醇作為提取溶劑。

        3.3 小結

        淡豆豉在不同地區(qū)炮制方法略有差異,對于發(fā)酵過程的悶制環(huán)節(jié)是否必要,不同學者也持有不同見解,本試驗收集淡豆豉不同發(fā)酵階段的樣品,分析6 種異黃酮含量動態(tài)變化,結果顯示,淡豆豉發(fā)酵過程中存在苷到苷元的轉化現象,再悶制環(huán)節(jié)有利于苷轉化成苷元,并且大豆苷元、染料木素等異黃酮苷元較糖苷型異黃酮具有更高的生物活性。該結果提示,淡豆豉發(fā)酵過程再悶制是必要過程,是有利于藥效成分轉化的發(fā)酵階段。后期試驗可結合不同階段解表、除煩作用的研究,對再悶制過程的必要性進一步分析探討,結合淡豆豉發(fā)酵過程中藥理作用的變化,為淡豆豉炮制工藝和炮制原理研究提供參考。

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