余史丹，汪碩聞，唐原君，李紅霞，竺東杰，范國榮2，*（.聯(lián)勤保障部隊第906醫(yī)院藥劑科，浙江 寧波 5040；2.上海市藥物（中藥）代謝產(chǎn)物研究重點實驗室，上海 2004；.上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科，上海 200080）

獲得性免疫缺陷綜合征，簡稱艾滋病，是由人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染引起的一種嚴重威脅人類健康的傳染性疾病[1]。高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療法（highly active antiretroviral therapy，HAART）是現(xiàn)階段艾滋病治療最為有效的方法。國家推薦用于成人及青少年抗病毒治療的三聯(lián)療法一般包括兩種核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NRTIs）和一種非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NNRTIs）[2-3]。其中，富馬酸替諾福韋酯、拉米夫定聯(lián)合依非韋倫為目前臨床上推薦的初始抗病毒療法的首選方案，療效顯著、不良反應(yīng)少[4-6]。富馬酸替諾福韋酯與拉米夫定同屬于核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。富馬酸替諾福韋酯水溶性好，口服后水解生成替諾福韋，競爭性地結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄酶從而抑制HIV 病毒復(fù)制[7]。拉米夫定口服吸收良好，代謝生成三磷酸拉米夫定，阻斷病毒DNA 鏈的合成和延長從而發(fā)揮抗病毒作用[8]。依非韋倫作為一種選擇性非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，對HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生非競爭性抑制作用，阻礙病毒復(fù)制而發(fā)揮療效[9]，三者聯(lián)用協(xié)同發(fā)揮抗病毒作用。

降低用藥劑量，減少不良反應(yīng)發(fā)生率、增加依從性和降低耐藥的發(fā)生是目前艾滋病治療新方案的研究方向。本試驗研究的新型抗艾滋病復(fù)方藥物（拉米夫定300 mg ＋富馬酸替諾福韋酯200 mg ＋依非韋倫400 mg）是何志明院士團隊基于反饋系統(tǒng)控制平臺體系（Feedback System Control，F(xiàn)SC）對臨床常用的多種抗病毒藥物進行篩選、重組和劑量優(yōu)化得到的高效、低毒的藥物組合[10]。與目前臨床上常用的一線治療方案（拉米夫定 300 mg ＋富馬酸替諾福韋酯300 mg ＋依非韋倫 600 mg）相比，組合相同，劑量較低，有利于減輕藥物不良反應(yīng)，降低用藥成本，提高患者用藥依從性[11-13]。

藥物聯(lián)合使用?？蛇_到增效減毒的目的，但也存在療效降低、毒副作用增強等風險，藥動學(xué)相互作用是導(dǎo)致其發(fā)生的重要機制之一[14-15]。已有研究報道聯(lián)用替諾福韋及地達諾新后拉米夫定的AUC0～∞保持不變，Cmax降低，tmax增加，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義[16]。Jiang 等[17]對大鼠口服恩替卡韋和拉米夫定后拉米夫定的藥動學(xué)進行研究，未發(fā)現(xiàn)顯著藥物相互作用。Ceckova 等[18]研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)用依非韋倫后拉米夫定的血漿清除率（CL）顯著降低，t1/2延長，AUC0～∞增加，減少了其在大鼠體內(nèi)的腎臟排泄。目前拉米夫定聯(lián)用富馬酸替諾福韋酯、依非韋倫后是否存在藥動學(xué)相互作用尚未見相關(guān)報道。

本實驗建立了一種快速、靈敏的UFLC-MS/MS 法測定大鼠血漿中拉米夫定的濃度，并應(yīng)用于研究新型抗艾滋病復(fù)方藥物中富馬酸替諾福韋酯、依非韋倫對拉米夫定在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)行為的影響，探討可能存在的藥動學(xué)相互作用，為抗病毒藥物臨床安全、合理使用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

SHIMADZU UFLC-20A（配備CBM-20A 控制器，DGU-20A3 在線脫氣機，LC-20AD 高壓梯度泵，SIL-20A 自動進樣器和CTO-20AC 柱溫箱，日本島津公司），API 4000 三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀、Analyst 1.6 色譜質(zhì)譜工作站（美國AB Sciex 公司），SCILOGEX MX-S 渦旋混合器（美國Scilogex 公司），SORVALL LEGEND Micro 21R 冷凍離心機（美國Thermo Scientific 公司），XS205 Dual Range 電子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司），SK5200H超聲儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司），Hi-Tech 水純化系統(tǒng)（上海和泰儀器有限公司）。

1.2 試藥

替諾福韋對照品（含量＞99%，批號：MO426AS）、依非韋倫對照品（含量＞99%，批號：MO202AS）、拉米夫定對照品（含量＞99%，批號：MO222AS）、內(nèi)標阿昔洛韋對照品（含量＞99%，批號：JO610AS）、富馬酸替諾福韋酯原料藥（含量＞98%，批號：MB1237）、依非韋侖原料藥（含量＞98%，批號：MB3218）、拉米夫定原料藥（含量＞98%，批號：MB1889）（大連美侖生物技術(shù)有限公司）。

甲醇（色譜純，德國Merck）；乙酸銨（分析純，上海泰坦化學(xué)有限公司）；甲酸（色譜純，上海安譜公司）；水為Hi-Tech 水純化系統(tǒng)自制的去離子超純水（18.2 MΩ）。

1.3 實驗動物

SPF 級成年、健康Sprague-Dawley 大鼠，180 ～220 g，雌雄兼顧[上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2013-0016]。所有的動物實驗均符合海軍軍醫(yī)大學(xué)動物倫理委員會規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱Agilent ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱溫30℃，流動相A 為含0.1%甲酸和25 mmol·L－1乙酸銨的去離子水，流動相B 為甲醇，梯度洗脫（0.01 ～0.30 min，40% ～70%B；0.31 ～2.40 min，70%B；2.41 ～3.00 min，40%B）；流速1 mL·min－1，柱后分流比3∶7，進樣量5 μL，分析時間3 min。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），正離子檢測模式，選擇多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式進行一/二級質(zhì)譜分析。源參數(shù)：源電壓5500 V，Gas1 50 psi，Gas2 45 psi，CUR 20 psi，CAD 10 psi，離子源溫度500℃；各化合物的一/二級離子和質(zhì)譜特征性參數(shù)見表1，二級質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 各分析物及內(nèi)標的離子質(zhì)譜圖Fig 1 Product ion mass spectra of each analyte and the internal standard

表1 各分析物及內(nèi)標用于定量分析的離子通道及優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)Tab 1 Mass parameters and MRM transitions optimized for quantitative analysis of each analyte and the internal standard

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液的配制 精密稱取拉米夫定對照品約10 mg，置于10 mL 棕色量瓶中，加入50%甲醇配制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL－1的儲備液。將儲備液用50%甲醇溶液逐級稀釋得到拉米夫定質(zhì)量濃度分別為100、200、500、1000、5000、10 000、18 000、20 000 ng·mL－1的系列工作溶液，同法配制含拉米夫定質(zhì)量濃度為300、2500 和16 000 ng·mL－1的質(zhì)控工作溶液。

2.2.2 內(nèi)標阿昔洛韋溶液的配制 精密稱取阿昔洛韋對照品約10 mg，置于10 mL 量瓶中，加50%甲醇溶解并定容，得質(zhì)量濃度為1 mg·mL－1的標準儲備液。用50%甲醇水溶液稀釋后得質(zhì)量濃度為1000 ng·mL－1的內(nèi)標阿昔洛韋工作溶液。以上所有溶液均置于－20℃保存。

2.3 血漿樣品的前處理

血漿樣品采用96 孔板（美國Waters）蛋白沉淀高通量前處理方法。每一批次分析樣品隨行標準曲線的配制，質(zhì)控樣品和實測樣品的加樣均在同一塊96孔板上完成。采用自動多通道移液器（瑞士INTEGRA）在孔內(nèi)準確加入50 μL 血漿、5 μL內(nèi)標阿昔洛韋溶液（1000 ng·mL－1）和150 μL 甲醇進行蛋白沉淀，96 孔板封蓋并渦旋振蕩3 min，置于正壓裝置（美國Waters）下濾過提取5 min，隨后移取濾液至進樣小瓶中，自動進樣5 μL 進行UFLC-MS/MS 分析，峰面積內(nèi)標法定量檢測。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性實驗 通過對6 批不同來源SD 大鼠空白血漿、空白血漿標準添加定量下限（lower limit of quantitation，LLOQ）濃度水平標準溶液、實測血漿樣品進行比較以考察方法的專屬性。結(jié)果SD 大鼠血漿樣品中拉米夫定及內(nèi)標阿昔洛韋的保留時間分別為2.20、1.95 min，血漿內(nèi)源性及其他物質(zhì)對分析物及內(nèi)標的測定無明顯干擾，如圖2 所示，表明該方法專屬性良好。

圖2 大鼠血漿中拉米夫定及內(nèi)標阿昔洛韋的典型圖譜Fig 2 Representative MRM chromatogram of lamivudine and the internal standard in the rat plasma

2.4.2 LLOQ 和線性范圍 精密吸取拉米夫定工作溶液5 μL，加入SD 大鼠空白血漿45 μL，配制成含拉米夫定約10、20、50、100、500、1000、1800 和2000 ng·mL－1的血漿樣品，按“2.3”項下方法操作，進樣分析。以分析物與內(nèi)標的峰面積比值（Y）對相應(yīng)的質(zhì)量濃度（X）進行加權(quán)（1/χ2）線性回歸，得拉米夫定的標準曲線方程為Y＝0.0271X＋0.0528（r＝0.9995）。結(jié)果表明，SD 大鼠血漿中拉米夫定在10.26 ～2052 ng·mL－1與峰面積線性關(guān)系良好，LLOQ 為10.26 ng·mL－1（S/N＞10）。

2.4.3 精密度和準確度實驗 配制含拉米夫定的LLOQ 樣品和低、中、高3 個濃度水平的質(zhì)控樣品（每一濃度平行配制6 份），按“2.3”項下方法處理后進樣分析，連續(xù)3 d 分別進樣3 個分析批進行測定。根據(jù)當日建立的標準曲線分析LLOQ樣品和質(zhì)控樣品，將測得濃度與理論濃度比較，計算準確度及日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果顯示，拉米夫定日內(nèi)、日間精密度RSD均小于10%，準確度為92.23%～103.10%，表明該方法準確、可靠，且重復(fù)性好，結(jié)果見表2。

表2 SD 大鼠血漿中拉米夫定的日內(nèi)、日間精密度及準確度Tab 2 Precision and accuracy of lamivudine in SD rat plasma

2.4.4 回收率及基質(zhì)效應(yīng) 配制含拉米夫定低、中、高3 個濃度水平的質(zhì)控樣品（每一濃度平行配制6 份），按“2.3”項下方法處理，進樣檢測得峰面積A；另取6 批不同來源的SD 大鼠空白血漿樣品，按“2.3”項下方法加入沉淀劑制備空白基質(zhì)上清液，加入相應(yīng)濃度的質(zhì)控工作溶液（每批次每一濃度平行配制3 份，共6 批），進樣分析得峰面積B；直接進樣分析相應(yīng)濃度的質(zhì)控工作溶液得峰面積C；按A/B×100%計算各濃度水平下拉米夫定及內(nèi)標阿昔洛韋的提取回收率，按B/C×100%計算各濃度水平下拉米夫定及內(nèi)標阿昔洛韋的基質(zhì)基質(zhì)因子，進一步計算得經(jīng)內(nèi)標歸一化的基質(zhì)因子，結(jié)果見表3。拉米夫定在低、中、高3 個質(zhì)控濃度下的回收率及基質(zhì)效應(yīng)均較一致。

表3 SD 大鼠血漿中拉米夫定及內(nèi)標阿昔洛韋的回收率和基質(zhì)效應(yīng)Tab 3 Recovery and matrix effect of lamivudine and IS in SD rat plasma

2.4.5 稀釋效應(yīng) 配制含拉米夫定質(zhì)量濃度為3200、8000、16 000 和32 000 ng·mL－1的SD大鼠血漿質(zhì)控樣品各5 份，分別用空白血漿稀釋2、5、10 和20 倍，按“2.3”項下方法處理后進行UFLC-MS/MS 分析。結(jié)果顯示，血漿稀釋2、5、10、20 倍后測得值與理論值的平均相對誤差（RE）分別為0.70%、1.74%、2.33%和2.53%，RSD值均小于5%，表明高質(zhì)量濃度血漿樣品經(jīng)稀釋后不影響測定。

2.4.6 殘留 配制標準添加定量上限（upper limit of quantification，ULOQ）質(zhì)量濃度（2000 ng·mL－1）水平的血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后進樣分析。通過進樣標準添加ULOQ 水平的血漿樣品后，緊接著連續(xù)進樣空白溶劑估計殘留。結(jié)果表明，在該分析方法下，空白溶劑中拉米夫定峰面積與相應(yīng)分析批ULOQ 峰面積之比均小于15%，且不超過內(nèi)標的1.5%。

2.4.7 交叉串擾 吸取拉米夫定儲備液適量，用50%甲醇稀釋制得其ULOQ 溶液（2000 ng·mL－1）。取水代空白血漿50 μL，按“2.3”項下方法制備不含內(nèi)標的ULOQ 樣品及僅含內(nèi)標的IS 樣品。結(jié)果表明，拉米夫定、內(nèi)標各通道間無交叉串擾，如圖3 所示。

圖3 拉米夫定及內(nèi)標阿昔洛韋的典型圖譜Fig 3 Representative MRM chromatogram of lamivudine and acyclovir（IS）

2.4.8 穩(wěn)定性 配制低、高質(zhì)量濃度（30、1600 ng·mL－1）的拉米夫定血漿標準樣品，按“2.3”項下方法操作處理后進樣分析，考察樣品處理、進樣分析及儲存過程中的穩(wěn)定性。含拉米夫定的血漿樣品室溫下放置4 h 穩(wěn)定，RE為－3.37%～6.44%，RSD＜2.3%；處理后樣品在自動進樣器中放置12 h穩(wěn)定，RE為－1.57%～7.21%，RSD＜4.6%；樣品經(jīng)三次凍融循環(huán)（－80℃）后穩(wěn)定，RE為－2.22%～10.61%，RSD均＜3.2%；樣品在－80℃冰箱冷凍保存60 d 后穩(wěn)定，RE為－1.26%～3.17%，RSD均＜0.87%。結(jié)果表明，拉米夫定血漿樣品在樣品處理、分析及儲存過程中穩(wěn)定性良好。

2.5 藥動學(xué)研究

選用12 只成年、健康SD 大鼠，雌雄各半，隨機分為單獨給藥組和聯(lián)合給藥組。禁食過夜后，分別灌胃給藥拉米夫定32 mg·kg－1，拉米夫定32 mg·kg－1＋富馬酸替諾福韋酯21 mg·kg－1＋依非韋倫43 mg·kg－1（等效劑量通過體表面積法換算而得），于給藥前（空白對照）及給藥后5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h 從大鼠眼眶取血300 μL 置于涂有肝素的EP 管中，6500 r·min－1離心5 min，取上清液置于－80 ℃冰箱保存。血漿樣品按“2.3”項下方法處理后進行UFLC-MS/MS分析。以非房室模型（統(tǒng)計矩法）經(jīng)DAS 2.0 軟件計算藥動學(xué)參數(shù)。采用獨立樣本t檢驗對藥動學(xué)參數(shù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。平均血藥濃度-時間曲線見圖4，藥動學(xué)參數(shù)見表4。

表4 SD 大鼠單獨給藥和聯(lián)合給藥后拉米夫定的藥動學(xué)參數(shù)Tab 4 Pharmacokinetic parameters of lamivudine in SD rats after a single and combination administration

圖4 SD 大鼠單獨給藥和聯(lián)合給藥后血漿中拉米夫定的平均藥-時曲線Fig 4 Mean plasma concentration-time curves of lamivudine in SD rat plasma after a single and combination administration

從表4 中可以看出，單獨給藥組和聯(lián)合給藥組大鼠血漿中拉米夫定均于給藥后1 h 達峰，Cmax分別 為4178.95 ng·mL－1和4598.86 ng·mL－1，AUC0～τ分別為14 917.86 ng·h·mL－1和13 728.50 ng·h·mL－1，t1/2z分別為1.50 h 和1.63 h，P值均大于0.05，藥動學(xué)參數(shù)變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示聯(lián)合使用替諾福韋與依非韋倫對拉米夫定在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)行為無明顯影響。

3 討論

文獻報道生物基質(zhì)中拉米夫定的測定多采用高效液相色譜法（HPLC-UV）、液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法（LC-MS/MS）等，存在靈敏度低[19]、血漿用量大[20-21]、樣品前處理過程煩瑣[22-23]、分析時間長[24-25]等局限。本實驗建立了一種快速、簡便、專屬性好的UFLC-MS/MS 方法測定大鼠血漿中拉米夫定的濃度，分析時間僅為3 min，分析過程中血漿用量少，僅需50 μL。通過考察不同有機溶劑（甲醇、乙腈），分別按1∶2、1∶3、1∶5（血漿樣品∶有機溶劑）沉淀蛋白處理，結(jié)果表明使用甲醇1∶3沉淀蛋白時，拉米夫定的色譜峰峰形良好，基質(zhì)干擾小，靈敏度及回收率等均符合分析要求。同時采用96孔板系統(tǒng)對血漿樣品進行蛋白沉淀處理，顯著縮短了樣品處理時間，提高了樣品處理效率，實現(xiàn)了大規(guī)模樣品的高通量分析。

本研究首次考察了富馬酸替諾福韋酯、依非韋倫對拉米夫定在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)過程的影響。結(jié)果表明，聯(lián)用替諾福韋、依非韋倫使拉米夫定的Cmax、CL增加，AUC0～∞減少，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示無顯著藥動學(xué)相互作用存在。拉米夫定主要以原形藥物由腎小球濾過、腎小管分泌排泄，部分通過有機陽離子轉(zhuǎn)運系統(tǒng)經(jīng)腎臟排出，約占其總清除量的70%[26]。作為轉(zhuǎn)運體OCT2、MATE1 和MATE2-K 的底物，當與此類轉(zhuǎn)運體抑制劑聯(lián)用時可降低拉米夫定的腎臟清除率[27-28]。替諾福韋系統(tǒng)代謝極少，主要通過腎小球濾過及活性小管分泌（OAT1 和OAT3 轉(zhuǎn)運至基底膜腎小管上皮細胞，由MRP4 分泌至腎小管管腔）聯(lián)合作用排泄[29-30]。盡管替諾福韋、拉米夫定均主要經(jīng)腎臟消除，但本研究結(jié)果提示無顯著藥動學(xué)相互作用存在，與Kearney 等[16]報道的研究結(jié)果一致，分析原因可能與其排泄過程中的藥物轉(zhuǎn)運蛋白不同有關(guān)。研究報道，一定濃度的依非韋倫可通過抑制MATE1、OCT1、OCT2 和MRP2 轉(zhuǎn)運體而減少拉米夫定在大鼠腎臟中的排泄[18]，但在本研究中未觀察到拉米夫定CL、t1/2、AUC0～∞等藥動學(xué)參數(shù)的顯著變化，考慮與本實驗中給藥劑量較低（依非韋倫 400 mg）有關(guān)，需進一步探究。拉米夫定、富馬酸替諾福韋酯及依非韋倫聯(lián)合用于艾滋病抗病毒治療，臨床上需長期給藥[31]。本實驗僅考察了單劑量富馬酸替諾福韋酯、依非韋倫對拉米夫定的影響，具有一定的局限性，針對多劑量富馬酸替諾福韋酯、依非韋倫對拉米夫定藥動學(xué)影響及其具體作用機制有待后續(xù)進一步研究。