王瑩，張虹

成都中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，四川 成都 610075

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是由心腦血管疾病引起低灌注性、缺血性或出血性腦損傷繼而造成認知功能喪失的綜合征[1]。細胞凋亡為I型程序性細胞死亡，即受到各種因素刺激后，調控一系列水解酶介入的自主性細胞程序性死亡過程[2]。海馬神經元是機體學習與記憶的高級神經中樞，死亡受體活化、線粒體損傷途徑與內質網應激啟動被視為3條經典的細胞凋亡通路。當海馬神經元處于應激狀態(tài)時，上述經典凋亡通路被活化，進而誘導B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cystein-asparate protease，Caspase)家族等凋亡基因，使海馬神經元細胞程序性死亡，空間學習記憶力受損，機體出現認知功能減退[3-4]。近年來，中醫(yī)藥治療VD的機制研究日益增多，大量研究表明中藥可以通過干預凋亡相關基因或信號轉導通路等途徑，抑制VD神經元凋亡，保護腦組織?，F將中醫(yī)藥干預VD的相關研究綜述如下，旨在為臨床研究提供依據。

1 凋亡相關基因

人體細胞凋亡相關基因種類豐富，當前研究較多的Bcl-2家族、Caspases家族、P53、血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)等基因參與了VD的發(fā)病過程。

1.1 凋亡相關基因在VD發(fā)病中的機制

1.1.1 Bcl-2家族Bcl-2家族成員有抗凋亡基因和促凋亡基因兩大類，如Bcl-XL、Bcl-2等抗細胞凋亡基因，Bcl-XS、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)等促細胞凋亡基因。Bcl-2 與Bax作為調控凋亡的核心基因，其表達異常與細胞凋亡的發(fā)生密切相關[5]。正常狀態(tài)下，Bcl-2與Bax的表達保持平衡以維持細胞代謝，在調控線粒體膜通透性、線粒體巰基的氧化還原狀態(tài)和細胞色素C(Cytochrome C，Cyt-C)的釋放中具有關鍵作用[6]。當Bax蛋白表達量較Bcl-2高時，同源二聚體Bax/ Bax上升，誘導細胞凋亡；當Bcl-2蛋白表達量較Bax高時，則同源二聚體Bcl-2/Bcl-2及異源二聚體Bcl-2/Bax上升，產生抗凋亡作用[7]。有研究表明，在分兩次結扎雙側頸總動脈構建的VD大鼠模型中，海馬CA1區(qū)出現大量神經元凋亡，Bcl-2、Bax蛋白水平顯著上調，Bax蛋白上升趨勢更為明顯，證實了Bcl-2/Bax失衡誘導神經元凋亡可能是VD發(fā)生的重要病理基礎[8]。促凋亡基因Noxa屬于Bcl-2家族成員，可以通過P53轉錄依賴性方式被激活，其表達異常也與細胞凋亡直接相關[9]。

1.1.2 Caspases家族Caspases是一種與細胞凋亡密切相關的特異性半胱氨酸天冬酸蛋白水解酶，目前人體內共發(fā)現有14種，其中Caspase-3在細胞凋亡的過程中發(fā)揮核心作用，它最初以無活性的Pro-Caspases酶原形式存在于細胞質中，當凋亡信號傳遞到酶原后，保守的天冬氨酸殘基經過蛋白水解轉化成具有活性的Caspase-3，進而發(fā)揮細胞凋亡效應[10]。Caspases家族主要通過兩大關鍵途徑被激活，一種是死亡受體途徑，另一種是線粒體途徑。其中死亡受體通路中死亡因子Fas-L被Fas受體特異性識別并結合，Fas/Fas-L復合物反過來誘導Fas和Fas相關死亡結構域蛋白(Fas-associated protein with death domain，FADD)結合，導致FADD聚集和死亡效應結構域(death effector domain，DED)出現，FADD通過DED與Pro-Caspase-8相互作用，誘導質膜胞質區(qū)Pro-Caspase-8低聚化，形成巨大分子復合物即凋亡誘導信號復合體(death inducing signaling complex，DISC)，進而激活 Caspase-8，繼之激活下游Caspase-3啟動凋亡；線粒體途徑主要是通過細胞應激使線粒體通透性增加，線粒體內Cyt-C被釋放到胞質中，在胞質脫氧三磷酸腺苷(deoxyadenosine triphosphate，dATP)或ATP作用下，凋亡蛋白酶激活因子-1(apoptosis protease activating factor-1，Apaf-1)低聚化，Apaf-1 促使胞漿內Pro-Caspase-9、dATP和 Cyt-C 共同形成凋亡小體，進而激活Caspase-9/3，執(zhí)行凋亡過程[11]。腦缺血發(fā)生后，Caspase-3被激活，進而誘導神經元細胞凋亡，此外，其還參與了兩大凋亡通路中的重要環(huán)節(jié)[12-13]。

1.1.3 P53P53是一種常見的促凋亡基因，多被應用于抑癌領域，是當前研究熱點。P53一般以低水平位于細胞核和線粒體內，可與DNA 發(fā)生特異性結合以保護基因組的完整性，參與調控細胞凋亡與衰老、細胞周期阻滯、促DNA自我修復等多種生物學過程[14]。當細胞受到各種異常信號刺激時，P53被激活，通過轉錄依賴性或轉錄非依賴性機制促進凋亡發(fā)生[15]。P53轉錄依賴性凋亡主要是通過介導上述兩大關鍵途徑轉錄多種促凋亡基因的表達，如Bax、Fas、Apaf-1等，從而引起凋亡[15-16]。P53轉錄非依賴性凋亡是活化的P53發(fā)生線粒體轉位，與Bcl-2 蛋白家族相互作用后，使線粒體膜通透性增加，最終導致細胞凋亡[17-18]。有報道指出，P53高表達在介導慢性腦缺血神經細胞損傷中發(fā)揮關鍵作用[19]。朱燕珍等[20]研究發(fā)現，VD模型大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞出現明顯凋亡現象，P53、Noxa表達水平升高，且呈正相關，相關系數為0.918，提示P53、Noxa誘導海馬神經元凋亡可能是VD的重要發(fā)病機制。

1.1.4 HO-1HO是參與血紅素降解代謝過程中的限速酶，目前已發(fā)現其有3種亞型，分別是HO-1、HO-2和HO-3，其中HO-1被研究最多，又稱熱休克蛋白32，具有保護細胞、抗氧化損傷、抗炎、抗細胞凋亡等作用[21]。HO-1基因由4個內含子與5個外顯子組成，其啟動子具有多態(tài)性，在轉錄起始位點上游的5′端存在一些特殊的增強子成分[22]，包括應激反應、熱休克反應、金屬調節(jié)反應等調控元件，激活蛋白1(activator protein-1，AP-1)、核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)等結合位點[23]。多個增強子與轉錄基因相結合可活化HO-1基因，并影響其調控作用。HO-1的催化產物一氧化碳(carbon monoxide，CO)及膽紅素同樣具有抗凋亡、抗氧化、保護神經血管單元的作用[24]。另研究指出，CO也可以損害神經元細胞線粒體及其膜，誘導細胞壞死及凋亡[25]，可能與CO不同濃度產生的雙重作用相關，低濃度可以對慢性腦缺血產生保護作用，反之高濃度則可引起神經毒性反應。

1.2 中醫(yī)藥調控凋亡相關基因研究周偉等[26]應用改良雙側頸總動脈阻斷法構建VD模型大鼠，發(fā)現模型大鼠腦組織中Caspase-3、Bax的表達顯著上升，Bcl-2表達顯著降低；以低、高劑量的大蒜素干預模型大鼠后，Caspase-3、Bax表達顯著下降，Bcl-2表達顯著上升，表明大蒜素可以有效改善VD大鼠認知能力，其機制可能與促進抗凋亡基因表達密切相關。實驗研究發(fā)現，川續(xù)斷總皂苷能夠通過降低海馬CA1組織中聚ADP-核糖聚合酶[Poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]、Bax、Caspase-3表達，增加Bcl-2表達，從而減少神經元細胞凋亡，發(fā)揮腦保護作用[27]。鄧敏貞等[28]制備VD模型小鼠發(fā)現，人參皂苷Rb3、β-細辛醚組以及兩者聯合用藥均可明顯下調Bax mRNA及蛋白表達量，上調Bcl-2 mRNA及蛋白表達量，發(fā)揮抗海馬神經元凋亡的作用以改善VD。高玲等[29]應用雙側頸總動脈永久結扎法(2-VO)建立VD模型大鼠，結果發(fā)現益髓解毒法中藥組方可以通過抑制大鼠海馬組織Caspase-3、Caspase-9蛋白的表達，有效提高大鼠的學習記憶能力。王韻橋等[30]實驗發(fā)現，五臟溫陽化瘀湯的抗VD作用機制與上調Bcl-2、Bcl-XL表達，下調 Caspase-3、Caspase-9表達有關。吳林等[31]研究發(fā)現，溫肺降濁方能夠通過降低Caspase-3表達，抑制神經元凋亡，起到神經元保護作用。另研究發(fā)現，該方可通過降低大鼠海馬區(qū)Cytc、Bax表達，發(fā)揮抗VD功效[32]。有研究發(fā)現，活血益智片抗VD的作用機理可能與其抑制P53與Caspase-3活性進而產生抗凋亡作用相關[33]。李建省等[34]研究發(fā)現，P53主要是通過激活促凋亡基因或線粒體途徑誘導細胞凋亡，而通絡益智散能抑制模型大鼠海馬CA1區(qū)P53蛋白的表達，保護腦組織。高冬麗等[35]研究發(fā)現，P53的蛋白表達間接反映腦缺血模型大鼠神經細胞凋亡狀況，證實了天麻素改善VD大鼠學習記憶能力的作用機理可能與下調P53表達從而抑制海馬神經細胞的凋亡有關。實驗研究發(fā)現，以黃蒲通竅膠囊干預VD大鼠28 d，可有效降低Fas表達水平，抑制Fas信號通路，進而抑制細胞凋亡，改善VD大鼠認知功能障礙[36]。鄭攀等[37]觀察補腎醒腦方對VD大鼠腦組織Fas和Bcl-2基因表達的影響，結果顯示該方可以抑制腦缺血后Fas基因表達，升高抗凋亡Bcl-2基因表達。黃立武等[38]研究證實，益肺宣肺降濁方能夠下調HO-1表達，減少大腦皮層CO的生成，減少其對神經細胞的毒性損傷，進而抑制細胞凋亡，有效改善大鼠認知能力。

目前，大量實驗研究集中于中醫(yī)藥通過調控Bcl-2、Caspases家族相關基因干預VD，對P53與HO-1基因的研究較少，而研究已證實中醫(yī)藥通過調控HO-1的表達可發(fā)揮不同作用機制影響VD，如下調其表達，能減少神經毒性，抗凋亡；上調則可減輕氧化損傷，發(fā)揮腦保護作用[39]，可見，中醫(yī)藥對基因表達水平具有雙向調節(jié)作用，可使疾病相關基因表達恢復動態(tài)平衡。

2 凋亡相關信號通路

2.1 凋亡相關信號通路在VD發(fā)病中的作用機制

2.1.1 p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路MAPKs是細胞內執(zhí)行信號級聯放大的一類蛋白質，能夠針對細胞外不同的刺激調控細胞凋亡、分化、分裂等多個生理過程[40]。p38 MAPK是MAPKs家族一員，cleaved p38 MAPK可調控Bax向線粒體易位，從而激活死亡受體途徑，導致神經元細胞凋亡[41]。有研究證實大鼠腦缺血缺氧后，大腦皮層內p38 MAPK表達升高且被激活，SB 203580腦室給藥能夠有效抑制p38 MAPK活化，改善血腦屏障(Blood-brain barrier，BBB)損傷和繼發(fā)的腦水腫程度[42-43]。

2.1.2 腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)相關信號通路BDNF是一種由膠質細胞、腦血管內皮細胞、神經元等多種細胞合成的堿性蛋白，具有神經營養(yǎng)作用，與原肌球蛋白受體激酶B(tropomyosin receptor kinase B，TrkB)受體特異性結合后，可進一步誘導激活MAPK、磷脂酶(phospholipase C，PLC-γ)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)，促進抗凋亡、神經元增殖、長時程增強等，提高認知能力[44]。BDNF抗神經元凋亡的重要機制是增加細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)磷酸化水平[45]。PI3K/蛋白激酶B(serine/threonine protein kinase，Akt)是BDNF/TrkB的重要下游轉導通路，參與細胞增殖、凋亡和自噬等多種細胞生理病理過程，同時與腦缺血后細胞凋亡的調控有著密切聯系[46]。

2.1.3 沉默信息調節(jié)因子1/過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子-1α(silent information regulator 1，SIRT1/ peroxisome-proliferotor-activated receptorγcoactjvator-1α，PGC-1α)信號通路SIRT1屬于Sirtuin蛋白家族成員，是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴性核乙酰基酶[47]，參與細胞凋亡、自噬、新陳代謝、神經保護等重要生物學過程。PGC-1α作為其下游信號，是線粒體生物合成過程中的關鍵性調節(jié)因子，在體內能量代謝方面發(fā)揮著重要作用。SIRT1/PGC-1α信號轉導通路能夠去乙?；钚?，激活三磷酸腺苷合酶β，發(fā)揮抗凋亡作用[48]。腦缺血缺氧后，神經元細胞處于氧化應激狀況，其誘導細胞凋亡是腦缺血后神經損傷的重要病理過程，一些干預方式能夠通過激活SIRT1/PGC-1α信號轉導通路，減輕氧化損傷與神經元凋亡[49-50]。

2.1.4 PI3K/Akt/Bad信號通路PI3K/Akt信號途徑被認為是調控細胞凋亡的重要通路，PI3K是由p85、p110兩個亞基組成的一類胞內磷脂酰肌醇激酶。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能磷酸化一系列蛋白成分，Akt家族存在3種亞型，分別為Akt1、Akt2 與Akt3，其功能各不相同[51]。Bad是關鍵促凋亡基因，作為Akt的重要下游分子，能被直接磷酸化，生成Bcl-2或Bcl-xl單體，從而發(fā)揮抗凋亡效應。研究發(fā)現，以眼針為干預手段治療腦缺血模型大鼠，可以通過降低Bad表達水平，提高Bcl-xL表達水平，防止神經細胞凋亡，發(fā)揮保護神經血管單元的作用[52]。

2.1.5 PI3K/Akt/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路mTOR由mTORCl、mTORC2兩種復合物組成，參與調控細胞自噬、凋亡等，被視為細胞活動的“中央調控器”[53]。PI3K/Akt/mTOR信號在上游或旁路分子刺激下被激活，直接磷酸化凋亡相關蛋白或通過調控凋亡相關基因表達途徑實現抗凋亡作用，包括調節(jié)磷酸化Caspase-9，調控NF-κB、Bad活性，抑制P53、Cyt-C 釋放等[54]。相關研究證明，激活該信號通路可以改善VD大鼠學習記憶力，實現腦保護功能[55]。

2.1.6 絲裂原活化蛋白激酶5/細胞外信號調節(jié)激酶5(mitogen-activated kinase，MEK5/extracellular signal regulated kinase，ERK5)信號通路MEK5屬于MAPKK家族的成員，涉及抗凋亡等作用，由于缺乏特定抑制劑等相關生物制劑，當前研究較少，其下游分子ERK5信號轉導通路是MAPK家族一員。研究顯示，細胞凋亡與ERK5的缺失相關，ERK5是調控促凋亡蛋白Bad、BimL、BimEL的關鍵因子[56]。

2.1.7 ERK/環(huán)腺苷酸反應元件結合蛋白(cAMP response element bindingprotein，CREB)信號通路作為CREB上游分子，ERK能夠磷酸化，發(fā)揮調控神經元凋亡等作用。CREB能夠調控神經元生長、生存，參與長期的記憶形成過程及細胞內不同信號轉導[57]。CREB活化后可調控多種基因轉錄，促使即刻早期基因產物表達，通過抑制神經元凋亡與增強修復，具有神經元保護功效[58]。

2.2 中醫(yī)藥調控凋亡相關信號通路的研究楊申等[59]采用2-VO法誘導VD模型大鼠，結果發(fā)現，以銀杏葉提取物Egb761治療15 d后，大鼠海馬區(qū) p-p38MAPK表達降低，通過抑制p38MAPK信號通路，延緩海馬神經元細胞凋亡，提高空間學習記憶力。李歐等[60]實驗發(fā)現，香萱益神方能夠提高模型大鼠海馬中海馬組織BDNF表達水平，通過激活BDNF相關通路，減少海馬神經元細胞凋亡，有效改善模型大鼠認知能力。于文濤等[61]研究發(fā)現，補腎活血方低、高劑量組均可以明顯增加海馬區(qū)BDNF、TrkB、PI3K、AKT表達水平，有效改善海馬神經元凋亡細胞損傷，表明補腎活血方可能通過調控BDNF介導的PI3K/Akt信號轉導通路發(fā)揮神經元保護作用。李永格等[62]研究證實，山茱萸多糖增強模型大鼠學習記憶力的機制與升高BDNF、Bcl-2表達水平、抑制凋亡有關。周羅可等[63]研究發(fā)現，五味子甲素干預模型大鼠后，可通過激活SIRT1/PGC-1α通路，下調Bax、cleaved Caspase-3/Caspase-3表達量，上調Bcl-2、SIRT1、PGC-1α表達水平，抗神經元凋亡。易亞喬等[64]研究發(fā)現，加味腦泰方可通過激活SIRT1相關通路，升高SIRT1、Bcl-2表達水平，降低Bax、Caspase-3表達水平，抑制凋亡。郜巒等[65]實驗發(fā)現，腦絡欣通可增加VD大鼠PI3K、Akt及神經生長因子(nerve growth factor，NGF)表達，降低Bad表達，激活PI3K/Akt信號通路，抑制細胞凋亡。張杰等[66]研究發(fā)現，補腎通絡方可明顯升高VD大鼠海馬組織PI3K、Akt、mTOR表達，激活PI3K/Akt/mTOR通路，促進自噬，抑制凋亡。毛成遠等[67]研究證實，中藥三七皂苷Rg1可激活MEK5/ERK5傳導通路，上調p-MEK5、p-ERK5表達，抑制神經元細胞凋亡。靳賀超等[68]研究發(fā)現，補腎活血方可激活ERK/CREB信號傳導，抑制海馬神經元凋亡。

3 結語

綜上所述，中醫(yī)藥可通過調控多種凋亡相關基因或信號轉導通路等，有效改善認知障礙，減少神經元凋亡，發(fā)揮腦保護作用。但細胞凋亡本身的復雜機制尚未完全闡明，中藥介導神經元細胞凋亡防治VD的具體機制仍為今后研究的重點。目前，中醫(yī)藥調控凋亡治療VD的實驗研究還存在一定的局限：許多實驗僅僅構建相關病種的動物模型作為研究對象，丟失傳統(tǒng)中醫(yī)證型特征，今后的研究應將辨證論治與凋亡研究相結合，制備中醫(yī)證候學相關動物模型，運用中醫(yī)基礎理論框架，使其更具現代中西醫(yī)結合實驗特色；現有研究多以死亡受體途徑與線粒體途徑為主，較少涉及內質網應激作用的細胞凋亡機制方面；SIRT1/NF-κB通路、c-Jun 氨基末端蛋白激酶(c-Jun N-terminal protein kainse，JNK)通路也可調控凋亡治療VD[69-70]，但中醫(yī)藥是否能夠介導該通路減少神經元細胞凋亡，仍需實驗驗證；中醫(yī)藥多層面、多通道、整體性治療疾病的特點決定了其信號轉導通路可能不僅介導某一個靶點，其交叉性與復雜性可作為今后研究的重點難點。綜上，中醫(yī)藥抗凋亡治療VD的研究仍處于起步階段，亟需進一步的研究。