林冬冬，程東慶（通信作者）

（浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053）

核酸適配體又稱適配體，在1990 年被首次提出，它是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX）篩選得到的一段DNA 或RNA 寡核苷酸單鏈，通過分子內(nèi)堿基配對、靜電作用、氫鍵、范德華力等作用折疊形成多種空間結(jié)構(gòu)，能識別并結(jié)合重金屬離子、抗生素、小分子等靶分子，具有與抗原-抗體反應(yīng)相類似的高度親和性和特異性，被人們稱為“化學(xué)抗體”。與抗體相比，核酸適配體還具有分子量?。? ～15 KD）、靶標(biāo)范圍廣、免疫原性低、穩(wěn)定性好、可人工合成、易修飾、應(yīng)用范圍廣等特點。生物傳感器是一種以生物元件為基礎(chǔ)的分析裝置，能將定量或定性的生化反應(yīng)信息轉(zhuǎn)化為電信號或光學(xué)信號，具有選擇性好、靈敏度高、可在線連續(xù)監(jiān)測等特點。近年來，國內(nèi)外研究者以核酸適配體作為識別分子與多種傳感器相結(jié)合，開發(fā)了一系列適配體傳感器，包括熒光適配體傳感器、電化學(xué)適配體傳感器以及基于納米材料的各類傳統(tǒng)適配體傳感器，能夠?qū)⒏鞣N不同信號進行轉(zhuǎn)化，從而達到檢測靶標(biāo)物質(zhì)的目的，這些適配體傳感器在農(nóng)藥、重金屬、病原微生物、抗生素檢測等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。目前，適配體傳感器作為高效、快速、靈敏的檢測技術(shù)受到廣泛關(guān)注，其被認為是極具發(fā)展?jié)摿Φ姆治龉ぞ摺１疚木蜔晒膺m配體傳感器、電化學(xué)適配體傳感器以及基于納米材料的適配體傳感器在上述領(lǐng)域的應(yīng)用研究進展進行如下綜述。

1.熒光適配體傳感器

熒光適配體傳感器通過適配體與靶物質(zhì)結(jié)合后熒光值的變化對靶物質(zhì)進行定量檢測，由于天然存在熒光的生物分子在自然界中較少見，通常需要對適配體進行熒光標(biāo)記，產(chǎn)生可測的熒光信號，從而實現(xiàn)對目標(biāo)分子的檢測。熒光標(biāo)記所依賴的化合物稱為熒光物質(zhì)，它是指具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)的化合物，當(dāng)受到光照射時，可躍遷成為激發(fā)態(tài)，而當(dāng)從激發(fā)態(tài)恢復(fù)到基態(tài)時，可釋放能量發(fā)出熒光。通過熒光標(biāo)記技術(shù)將熒光物質(zhì)共價結(jié)合或物理吸附到所研究分子的某個基團上，利用熒光物質(zhì)的熒光特性從而對靶物質(zhì)進行檢測。由于SYBR Green Ⅰ具有靈敏度高、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點，是分子檢測中應(yīng)用最多的DNA 熒光嵌入染料。熒光適配體傳感器具有檢測快速、操作簡單、靈敏性高、穩(wěn)定性好和特異性強等優(yōu)點，現(xiàn)被應(yīng)用于多個領(lǐng)域中對靶物質(zhì)進行檢測。Yang 等建立了一種適配體-SYBR Ⅰ熒光探針傳感體系用于檢測牛奶中的四環(huán)素，在最佳條件下，檢出限達1×10mg/mL。

雖然熒光適配體具有高效、快速、靈敏的檢測特點，但是熒光背景和熒光壽命都會影響檢測的準(zhǔn)確性。考慮到熒光標(biāo)記適配體價格相對昂貴以及熒光團標(biāo)記易影響適配體與靶物質(zhì)之間的親和力，國內(nèi)外學(xué)者就非熒光標(biāo)記適配體傳感器進行了廣泛研究。Chen 等以G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)DNA 替換三聯(lián)體DNA 結(jié)構(gòu)構(gòu)建了無標(biāo)記型熒光適配體傳感器，寡核苷酸通過與硫黃素T（Thioflavine T,ThT）結(jié)合形成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)探針（Signal transduction probe,STP）?；谌菪肿娱_關(guān)（Triplehelix molecular switch, THMS），當(dāng)四環(huán)素存在于人血清中時，四環(huán)素與適配體結(jié)合形成適配體-四環(huán)素復(fù)合物，具有分解THMS 并釋放STP 的功能。游離的STP 組成G-四聯(lián)體與ThT 結(jié)合，產(chǎn)生較強的熒光，檢出限低至9.7×10mol/L。Chen 等基于DNA 四臂連接及SYBR Green Ⅰ染料，建立了一種新型的無標(biāo)記熒光適配體傳感器用于牛奶和蜂蜜中氯霉素（chloroamphenicol, CAP）的檢測。在CAP 不存在時，CAP 適配體與其互補鏈進行雜交，形成雙鏈引物/適配體復(fù)合物。當(dāng)CAP 存在時，適配體與CAP 進行特異性識別、結(jié)合，從而生成DNA 四臂連接。由于SYBR Green Ⅰ存在于富含堿基對的DNA 四臂的連接處，因此熒光強度增加。在最佳條件下，CAP 的檢出限為7.2×10mg/mL。Wei 等以黃連素（berberine,Ber）作為熒光探針，通過Ag+與富含胞嘧啶的適配體特異性結(jié)合，建立了一種基于核酸外切酶輔助熒光背景還原的無標(biāo)記熒光適配體傳感器，用于檢測自來水和人血清中的Ag，檢出限達4.4×10fM。該方法不僅減少了背景干擾并且加強了靶物質(zhì)的相對熒光強度。適配體芯片是一種新型生物芯片，能夠固定不同的基團，根據(jù)探針與靶基因堿基互補結(jié)合實現(xiàn)基因表達的高通量分析。通過將花青素-3（Cyanidin-3, Cy3）、花青素-5（Cyanidin-5,Cy5）等熒光基團標(biāo)記在靶物質(zhì)上，熒光基團標(biāo)記的靶物質(zhì)與適配體結(jié)合后形成復(fù)合物，熒光掃描儀發(fā)射光源激發(fā)熒光基團產(chǎn)生熒光信號進而檢測適配體與靶物質(zhì)的結(jié)合情況，應(yīng)用熒光對適配體響應(yīng)信號進行檢測。然而熒光基團會破壞靶物質(zhì)的構(gòu)象甚至掩蓋結(jié)果，因此，研究者們正在探索新的非熒光標(biāo)記的適配體傳感器。

2.電化學(xué)適配體傳感器

電化學(xué)生物傳感器由生物識別元件和信號轉(zhuǎn)換元件組成，能夠?qū)⑸锓肿雍桶蟹肿拥慕Y(jié)合過程轉(zhuǎn)化為可測量的電信號，從而實現(xiàn)對靶物質(zhì)的檢測分析。常用的生物識別元件包括抗體、酶和核酸探針，而核酸適配體以其易于修飾、易于保存、穩(wěn)定性強等特點，已成為目前研究最廣的生物識別元件之一，并與電化學(xué)生物傳感器合用，形成電化學(xué)適配體傳感器。近年來，電化學(xué)適配體傳感器是適配體傳感器中研究最廣、發(fā)展最快的一類。

Nie 等開發(fā)了一種基于核酸酶信號循環(huán)放大的高親和力截短型電化學(xué)適配體傳感器，對牛奶和水樣中的妥布霉素進行特異性檢測，檢測限達5.13×10mol/L。2021 年，Taghdisi 等以雙標(biāo)記適配體作為檢測元件，亞甲藍為氧化還原劑，開發(fā)了一種新型電化學(xué)檢測方法，以亞甲藍電信號變化來檢測人血清、牛奶、自來水中環(huán)丙沙星的含量，在最佳測試條件下，環(huán)丙沙星的檢出限達1×10mol/L。此外，新型電化學(xué)檢測器件具有提高靈敏度的作用。Zhang 等基于微型集成電路芯片，開發(fā)了一種針對4 種高毒性有機磷農(nóng)藥（丙溴磷、水胺硫磷、氧樂果和甲拌磷）的廣譜適配傳感器，無需額外預(yù)處理即可測定水溶液中的目標(biāo)分子，且具有良好的特異性，檢測限達（0.24 ～1.67）fM。電化學(xué)適配體傳感器具有檢測速度快、特異性強、靈敏度高、成本較低、便于攜帶等特點，是一個極具發(fā)展能力的分析工具，但其檢測結(jié)果易受實驗條件和周圍環(huán)境的干擾，對于標(biāo)本預(yù)處理十分必要。因此，如何更快更有效的降低電化學(xué)適配體傳感器所受干擾，將其應(yīng)用于更多領(lǐng)域，有待深入研究。

3.基于納米材料的適配體傳感器

隨著納米技術(shù)的發(fā)展，基于納米材料的適配體傳感器也得到不斷發(fā)展。納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍內(nèi)（1 ～100 nm）或其作為基本單元構(gòu)成的材料。由于納米材料結(jié)構(gòu)特殊、尺寸小，因而具有小尺寸效應(yīng)、量子效應(yīng)、表面效應(yīng)、高反應(yīng)活性等。近年來，量子點、碳點、金納米顆粒（gold nanoparticles,AuNPs）、銀納米顆粒（silver nanoparticles, AgNPs）等納米材料被應(yīng)用到比色、熒光、電化學(xué)適配體傳感器中，基于納米材料的適配體傳感器極大提高了對目標(biāo)分子檢測的特異性、靈敏度以及準(zhǔn)確性。

3.1 基于納米材料的比色適配體傳感器

比色法具有可用肉眼直接觀察、無需復(fù)雜儀器設(shè)備和易于實現(xiàn)即時檢測等特點，將比色法與適配體傳感器結(jié)合形成比色適配體傳感器。比色適配體傳感器是一種將目標(biāo)信號轉(zhuǎn)化為顏色變化，用于檢測靶物質(zhì)的適配體傳感器，具有實驗結(jié)果易于觀察、實驗操作簡單等優(yōu)點。目前，常用的比色法主要是AuNPs、AgNPs 等納米材料聚集或分散引起的顏色變化來對結(jié)果進行直觀判定。Abnous 等將適體互補鏈和雙鏈脫氧核糖核酸結(jié)構(gòu)組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)組裝在AuNPs 上，當(dāng)人血清樣品中存在馬拉硫磷時，互補鏈的發(fā)夾結(jié)構(gòu)被釋放，顏色由紅色變?yōu)樗{色，最低檢出限為1×10mol/L。基于AuNPs 的比色法應(yīng)用較為普遍，但研究表明，AgNPs 的消光系數(shù)大于AuNPs，能夠檢測較低濃度的特定DNA 序列，具有更高的靈敏度和可見度。Bala 等使用適配體、陽離子肽和AgNPs 對水和食品樣品中的馬拉硫磷進行檢測，陽離子肽通過靜電相互作用將帶負電荷的AgNPs 聚集，顏色由黃色變?yōu)槌壬?。該方法具有?yōu)異的選擇性并且最低檢出限低至0.5×10mol/L?？紤]到一種物質(zhì)上可能存在多種農(nóng)藥，Liu 等建立了基于廣譜適配體的有機磷農(nóng)藥殘留比色檢測方法，對不同類型的有機磷農(nóng)藥進行初步篩查，并解決了高通量檢測農(nóng)藥殘留的問題。此外，Yang 等采用捕獲-選擇電極法（Capture-SELEX）篩選出與1-氯氟氰菊酯農(nóng)藥結(jié)合的適體LCT-1，l-氯氟氰菊酯可截短適體LCT-1 序列獲得LCT-1-39，該團隊利用LCT-1 和LCT-1-39 作為識別分子，首次建立了檢測l-氯氟氰菊酯的比色適體傳感器，最低檢測限分別為0.019 7 mg/mL 和0.018 6 mg/mL。Sun 等以適體共軛磁性納米顆粒為探針，基于G-四聯(lián)體脫氧核酶建立了比色適配體傳感器。當(dāng)鮭魚樣本中存在副溶血弧菌時，適配體與副溶血弧菌結(jié)合，其互補鏈與氯高鐵血紅素構(gòu)成G-四聯(lián)體，導(dǎo)致溶液中的3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫被催化為藍色，進而檢測副溶血弧菌含量。Tao Z 等將石墨烯/FeO-AuNPs 作為酶模擬物，Pb的適配體修飾于胺磁珠表面。當(dāng)自來水中存在Pb時，通過磁分離將適配體-Pb復(fù)合物去除，適配體的互補鏈吸附于石墨烯/FeO-AuNPs 復(fù)合材料表面，抑制催化活性與顯色反應(yīng)，Pb的濃度與溶液顏色成反比，最低檢出限達6.3×10mg/mL。2021 年，Liu 等將適配體嵌于亞穩(wěn)態(tài)發(fā)夾DNA 結(jié)構(gòu)中，當(dāng)卡那霉素存在時，鉑納米顆粒催化3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺-HO產(chǎn)生比色反應(yīng)，進一步提高了比色法檢測的靈敏度，牛奶中卡那霉素的檢出限低至0.2×10mg/mL。基于納米材料的比色適配體傳感器具有快速篩查的優(yōu)勢，而基于模擬酶或各種酶催化顯色反應(yīng)的比色適配體傳感器，不僅可直接肉眼查看檢測結(jié)果還能提高檢測的靈敏度，因此將其與基于納米材料的比色適配體傳感器進行結(jié)合應(yīng)用是目前的研究方向。

3.2 基于納米材料的熒光適配體傳感器

近年來，基于納米材料的熒光適配體傳感器得到了快速發(fā)展。YI 等建立了適配體-納米金-SYBR GreenⅠ熒光探針體系，基于熒光嵌入劑SYBR Green Ⅰ對的自來水、河水和人工尿液中氧氟沙星（ofloxacin, OFL）的殘留進行檢測，SYBR Green Ⅰ是一種選擇性嵌入染料，能與DNA 結(jié)合并增強熒光值。如果OFL 存在時，OFL 將與其適體結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，導(dǎo)致OFL 適體結(jié)構(gòu)改變，SYBR Green Ⅰ從OFL 適體釋放到溶液中，進而使SYBR Green Ⅰ的熒光值下降。熒光強度在1.1 ～200.0 nm 的氧氟沙星濃度范圍內(nèi)呈線性下降，檢出限達0.34 nmol/L。Saberi 等以西曲溴銨為原料，通過水熱法合成具有藍色熒光的陽離子碳點。當(dāng)（加標(biāo)）廢水、自來水和番茄中存在啶蟲脒時，適配體由于靜電吸附于碳點表面并與啶蟲脒結(jié)合，熒光強度隨啶蟲脒濃度成比例增加。該傳感器具有較高的靈敏度，檢出限達0.3×10mol/L。隨著我國的環(huán)保意識不斷加強，非標(biāo)記型熒光適配體傳感器也在不斷發(fā)展。Fan 等以富含AT 的雙鏈DNA 模板與銅納米顆粒結(jié)合作為熒光探針，建立了一種用于啶蟲脒檢測的無標(biāo)記、無酶熒光適配體傳感器。當(dāng)蘋果和生姜樣品中存在啶蟲脒時，適配體可與啶蟲脒形成靶適配體復(fù)合物并與另一條鏈雜交形成富含AT 的dsDNA（AT-rich dsDNA）。當(dāng)AT-rich dsDNA 與Cu和抗壞血酸相互作用時產(chǎn)生強烈熒光，該方法的檢出限低至2.37×10mol/L。值得一提的是，Zhu 等基于氧化石墨烯的信息計算、編碼、加密等系統(tǒng)構(gòu)建了一個熒光適配體傳感器，用于檢測魚類病原體嗜水氣單胞菌和遲緩愛德華菌。以氧化石墨烯作為鎖，靶標(biāo)病原體作為公共密鑰，適配體與病原菌結(jié)合作為加密密鑰，進而對適配體進行編碼或解碼，拓寬了分子水平上多功能器件或機器的發(fā)展。2021 年，Wang 等基于適配體與金屬有機框架制備了一種分子印跡傳感器，將病毒適配體修飾于識別載體表面，并通過硅酸四乙酯自聚合進行表面印跡，檢測限低至1.8×10mol/L。該方法以雙重識別和比率熒光測定來降低環(huán)境干擾，提高傳感器的抗干擾能力，進一步推動了分子印跡技術(shù)在生物傳感器中的應(yīng)用?；诩{米材料的熒光適配體傳感器與比色適配體傳感器在檢測特點上相似，雖能進行快速、靈敏的測定，但易受檢測體系中共存物的干擾，影響測定結(jié)果的可靠性，因此降低環(huán)境對檢測的干擾，將分子印跡技術(shù)應(yīng)用于生物傳感器以及將多功能器件或機器與基于納米材料熒光適配體傳感器結(jié)合應(yīng)用還需進一步研究。

3.3 基于納米材料的電化學(xué)適配體傳感器

基于納米材料的電化學(xué)適配體傳感器具有易于操作、靈敏度高、易微型化等特點，目前也廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域。Wang 等基于磁性納米顆粒對牛奶中大腸桿菌O157:H7進行檢測，通過尿素酶使阻抗信號的放大并用印刷電路板金電極進行測量，用適配體和尿素酶修飾AuNPs 并注入捕獲免疫多克隆抗體的毛細管中與大腸桿菌O157:H7進行結(jié)合形成MNP-抗體-細菌-適體-GNP-脲酶復(fù)合物，催化毛細管中尿素水解，根據(jù)鍍金印刷電路板電極檢測大腸桿菌O157:H7。Roushani 等基于AgNPs/3-氨基甲基吡啶功能化氧化石墨烯/玻碳電極構(gòu)建了適配體分子印跡傳感膜，通過適配體與CAP 結(jié)合形成的氧化電流信號變化，對牛奶中的CAP 進行檢測且檢出限達3×10mol/L。Xie 等開發(fā)了一種基于AuNPs/鉑納米顆粒-碳納米纖維/碳離子液體電極復(fù)合材料的電化學(xué)適配體傳感器，用于檢測飲用水中Hg的濃度，檢測限為3.33×10mol/L。YI 等基于三維納米多孔電極制備了一種新型無標(biāo)記電化學(xué)適配傳感器，用于檢測茶葉中啶蟲脒殘留，檢出限達71.2 fM。電化學(xué)適配體傳感器在完成檢測后，目標(biāo)分子容易使電極表面發(fā)生鈍化現(xiàn)象，影響二次使用。為了解決這一問題，F(xiàn)u 等基于疏水電極和磁性納米復(fù)合材料開發(fā)了一種可刷新電化學(xué)適配體傳感器，合成的氧化石墨烯-四氧化三鐵磁性納米復(fù)合材料與適配體結(jié)合可定性檢測蔬菜中有機磷農(nóng)藥。由聚二甲基硅氧烷修飾絲網(wǎng)印刷碳電極而制成的疏水電極可避免分子吸附于電極表面，實現(xiàn)電極的重復(fù)使用?；诩{米材料的電化學(xué)適配體傳感器可實現(xiàn)高靈敏度、強選擇性的檢測，但其穩(wěn)定性還有待進一步提高。

4.小結(jié)與展望

熒光適配體傳感器和比色適配體傳感器易受到檢測體系中共存物的干擾，電化學(xué)適配體傳感器也易受環(huán)境干擾。但由于適配體傳感器的應(yīng)用對我們的健康、環(huán)境、食品等領(lǐng)域帶來巨大保障，因此非熒光標(biāo)記適配體傳感器與芯片相結(jié)合的應(yīng)用以及降低環(huán)境對檢測干擾的方法將會成為未來的研究熱點。此外，基于模擬酶或各種酶催化顯色反應(yīng)的比色適配體傳感器與納米材料結(jié)合應(yīng)用，不僅可直接肉眼查看檢測結(jié)果，還能提高檢測的靈敏度。目前，基于納米材料的適配體傳感器研究較為廣泛，對檢測選擇性、靈敏度帶來一定提升，但仍存在檢測穩(wěn)定性不高、易受干擾等不足?；诩{米材料的適配體傳感器具有巨大潛力，是未來發(fā)展的重要方向。