周秀梅

(吉林市人民醫(yī)院藥劑科，吉林 吉林 132001)

何首烏學(xué)名Fallopiamultiflora(Thunb.) Harald，又名多花蓼，是蓼科蓼族何首烏屬多年生纏繞藤本植物，塊根肥厚，顏色呈黑褐色。主要產(chǎn)于陜西南部、甘肅南部、華東、四川、云南及貴州等地。以塊根入藥，具有安神、養(yǎng)血、活絡(luò)，解毒、消癰的作用，制首烏則具有補(bǔ)益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨、補(bǔ)肝腎的療效[1]。何首烏的化學(xué)成分主要有蒽醌類、二苯乙烯苷類、磷脂類、酚類以及黃酮類等[2]。有研究表明何首烏提取物不但能清除自由基、降血脂，還具有抗病毒、抗菌和增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功效。另外研究證明，黃酮類化合物表現(xiàn)出了很高的抗氧化活性[3]。本實(shí)驗(yàn)以制首烏內(nèi)黃酮類化合物的含量為指標(biāo)，采用單因素結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)法考察制首烏的最佳提取工藝，以期為何首烏的進(jìn)一步合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司，編號(hào)：MUST-12040302)；何首烏(安國(guó)市凱達(dá)中藥飲片有限公司，經(jīng)吉林醫(yī)藥學(xué)院雷鈞濤教授鑒定本品為蓼科蓼族何首烏屬植物何首烏的干燥塊根)；所用試劑均為分析純。

搖擺式中藥粉碎機(jī)(溫嶺市奧力中藥機(jī)械有限公司)；電子天平(JD500-3型，沈陽(yáng)龍騰電子有限公司)；島津UV-1800型紫外分光光度計(jì)。

1.2 制何首烏的制作過程

制何首烏制法：取何首烏片或塊，用黑豆汁拌勻，置燒杯內(nèi)，燉至汁液吸盡；或清蒸或用黑豆汁拌勻后蒸，蒸至內(nèi)外均呈棕揭色，或曬至半干，切片，干燥。每100 kg何首烏片(塊)，用黑豆10 kg[4]。

1.3 制首烏中黃酮類化合物的最佳提取工藝

制首烏的提取試劑選用乙醇，以提取液中黃酮類化合物的含量為指標(biāo)進(jìn)行考察，原料選用黑豆汁炮制的制首烏。

1.3.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用電子天平稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.0076 g，加入30%乙醇溶解后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶，加入30%乙醇準(zhǔn)確定容至刻度線，并且搖晃均勻，備用。分別用移液管準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移上述蘆丁溶液0.00、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00 mL到25 mL容量瓶中，加入30%乙醇到12.5 mL，滴入0.8 mL 5%亞硝酸鈉溶液，靜置5 min，再滴入0.8 mL 5%硝酸鋁溶液，靜置6 min，最后滴入5 mL 4%氫氧化鈉溶液，加入30%乙醇準(zhǔn)確定容到25 mL容量瓶的刻度線，靜置10 min，用紫外分光光度計(jì)在510 nm處測(cè)定吸光度[5-8]，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2乙醇濃度的考察

各取制首烏粉末1 g，以1∶10的料液比分別加入濃度為40%、50%、60%、70%、80%和90%的乙醇，回流提取2 h，抽濾，將抽濾所得的提取液中的乙醇揮發(fā)濃縮到3 mL左右，最后用70%乙醇定容至10 mL[3，5]，測(cè)定制首烏內(nèi)黃酮類化合物的含量。

1.3.3料液比的考察

各取制首烏粉末1 g，分別以1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20的料液比加入濃度為70%的乙醇，回流提取2 h，抽濾，將抽濾所得的提取液中的乙醇盡量揮發(fā)濃縮到3 mL左右，最后用70%乙醇定容至10 mL[3，5]，測(cè)定制首烏內(nèi)黃酮類化合物的含量。

1.3.4提取時(shí)間的考察

各取制首烏粉末1g，以1∶12的料液比加入濃度為70%的乙醇，分別回流提取2、4、6、8、10、12 h，抽濾，將抽濾所得的提取液中的乙醇盡量揮發(fā)濃縮到3 mL左右，最后用70%乙醇定容至10 mL[3，5]，測(cè)定制首烏內(nèi)黃酮類化合物的含量。

1.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)以上三個(gè)單因素確定因素水平表,根據(jù)因素水平表采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選最佳提取工藝，采用L9(33)正交表實(shí)驗(yàn)[9]，見表1。

表 1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖 1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 單因素結(jié)果分析

2.2.1乙醇濃度的考察結(jié)果

當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)，制首烏提取液中黃酮類化合物含量較高,而且60%和80%的吸光度值比其他三個(gè)點(diǎn)都高，所以正交實(shí)驗(yàn)選擇60%、70%、80%三個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)，見圖2。

圖 2 乙醇濃度考察結(jié)果

2.2.2料液比的考察結(jié)果

當(dāng)料液比為1∶14時(shí)，制首烏提取液中黃酮類化合物含量較高，而且1∶12和1∶16的吸光度值比其他三個(gè)點(diǎn)都高，所以正交實(shí)驗(yàn)選擇1∶12、1∶14、1∶16三個(gè)水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，見圖3。

圖 3 料液比考察結(jié)果

2.2.3提取時(shí)間的考察結(jié)果

當(dāng)提取時(shí)間為10 h時(shí)，制首烏提取液中黃酮類化合物含量較高，因在8 h至12 h之間上升趨勢(shì)明顯，加入9 h和11 h兩個(gè)單因素以確定正交實(shí)驗(yàn)的三個(gè)水平，而提取時(shí)間為9、10、11 h的吸光度值比其他的點(diǎn)都高，所以正交實(shí)驗(yàn)選擇9、10、11 h三個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)，見圖4。

圖 4 提取時(shí)間考察結(jié)果

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由極差分析可知，影響何首烏提取的因素主次順序?yàn)椋篈(乙醇濃度)>B(料液比)>C(提取時(shí)間)。最佳工藝條件組合為A2B2C2，即乙醇濃度70%，料液比1∶14，提取時(shí)間10 h。采用A2B2C2的工藝條件對(duì)制首烏進(jìn)行提取，見表2。各因素對(duì)提取效果的影響順序A>B>C，方差分析表明因素A對(duì)提取效果具有顯著性影響，B、C因素則無(wú)顯著性影響。通過比較F值，F(xiàn)A>FB>FC可知各因素對(duì)提取黃酮類化合物的影響次序是A>B>C，見表3。而三次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的吸光度分別為0.246、0.253和0.250，結(jié)果差異不大，說明此提取工藝較為穩(wěn)定。

表 2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

表 3 方差分析表

3 結(jié) 論

在研究何首烏中黃酮類化合物的最佳提取工藝中，通過正交實(shí)驗(yàn)確定了影響何首烏提取因素的主次順序?yàn)椋篈(乙醇濃度)>B(料液比)>C(提取時(shí)間)。最佳的工藝條件組合為乙醇濃度70%，料液比1∶14，提取時(shí)間10 h。相信通過對(duì)最佳的炮制工藝和提取工藝的研究，可以為何首烏的進(jìn)一步合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。