李素方，蘇金龍，張楚瑤，郭婉君，高慧

（西北大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安 710069）

獼猴桃是原產(chǎn)于我國的一種特色漿果，它皮薄多汁、口味酸甜清香，營養(yǎng)甚為豐富，故深為全世界消費者所喜愛。獼猴桃果實以鮮銷為主，生產(chǎn)實踐中，普遍使用低溫貯藏技術(shù)以保持其貨架品質(zhì)，延長保鮮期[1]。但長時間的低溫環(huán)境下，獼猴桃果實易發(fā)生冷害，并表現(xiàn)出果皮凹陷、果肉組織水漬化、木質(zhì)化等冷害癥狀，嚴(yán)重影響其商品價值[2]。針對這一問題，1-甲基環(huán)丙烯[3]、草酸[4]、水楊酸[5]、多胺[6]和24-表油菜素內(nèi)酯[7]等化學(xué)處理已被用于提高低溫貯藏獼猴桃果實抗冷性，并獲得了較為理想的效果。

褪黑素（Melatonin，MT）是一種吲哚胺類植物激素，具有調(diào)節(jié)植物分化、生長、衰老以及應(yīng)對生物、非生物脅迫等多種功能[8]。近年來，人們對MT 的認(rèn)識不斷深入，最近的研究發(fā)現(xiàn)其在園藝產(chǎn)品采后冷害的預(yù)防上也具有良好效應(yīng)[9,10]。目前，關(guān)于MT 用于獼猴桃低溫貯藏方面的報道較少，有研究認(rèn)為0.1 mmol/L MT 處理通過促進(jìn)抗氧化酶如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶活性以及抗壞血酸和還原型谷胱甘肽含量，減少了活性氧自由基的積累，繼而保持了“華優(yōu)”獼猴桃果實的冷藏品質(zhì)[11]。前人研究表明，碳水化合物在植物抵御低溫脅迫過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。植物會動員儲備淀粉，釋放能量、可溶性糖及其衍生代謝物以對抗脅迫[12]。吳煉等[13]發(fā)現(xiàn)浸鈣處理可有效減緩獼猴桃果實的淀粉降解，降低果糖和蔗糖積累，從而延長低溫貯藏期。但在其他一些冷敏果實上，研究人員則認(rèn)為較高水平的可溶性糖有利于提高果實抗冷性。如蔗糖有利于減緩桃和梨等果實冷害的發(fā)生[14-16]，而果糖、山梨醇和葡萄糖則在杏果實抗低溫脅迫中發(fā)揮了一定作用[17]。這些結(jié)果表明碳水化合物代謝與冷害的關(guān)系可能因果實種類的不同而不同。那么，MT處理減輕獼猴桃果實冷害與碳水化合物代謝關(guān)系如何呢？相關(guān)內(nèi)容還鮮有較為系統(tǒng)的報道。本研究以“徐香”獼猴桃為試材，探究MT 處理對冷害、碳水化合物代謝的影響，以期為MT 在獼猴桃果實低溫貯藏保鮮中的應(yīng)用提供理論依據(jù)，同時為生產(chǎn)實踐提供一定的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“徐香”獼猴桃（商業(yè)成熟度）采摘于陜西省西安市城郊一管理規(guī)范的果園，之后立即運回實驗室，取果形端正、大小均勻、無微生物侵染和機(jī)械損傷的果實用于試驗。

MT（純度≥99.0%），合肥博美生物科技有限公司；乙腈（色譜純），美國Tedia 公司；果糖、葡萄糖和蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma 公司；所用其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-20bR 高速低溫冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-2600 紫外可見分光光度計，島津公司；高效液相色譜儀（配備Shodex RI-201H 示差折光檢測器），中國江蘇漢邦科技有限公司；KQ-100DE 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料處理

將獼猴桃果實隨機(jī)分為兩組，每組210 個果實。分別采用濃度為0（對照）和0.05 mmol/L 的MT 溶液浸泡10 min[18]，果實晾干表面水分后裝入聚乙烯薄膜袋，置于0～1 ℃的機(jī)械冷庫貯藏90 d。期間每15 d 取樣，并測定果實的硬度。取果肉樣品在液氮中快速冷凍，之后立即于-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)指標(biāo)的測定。同時，按上述處理另準(zhǔn)備相同數(shù)量的獼猴桃用于確定冷害指數(shù)。為準(zhǔn)確獲得數(shù)據(jù)，需將果實從0～1 ℃移至常溫下（20 ℃）貯藏3 d，以模擬貨架期[2]。

1.3.2 冷害指數(shù)和硬度的測定

參考Yang 等[2]方法并略修改后測定。果實的冷害程度分為5 級，0 級：無冷害癥狀；1 級：冷害面積小于20%；2 級：冷害面積20%～40%；3 級：冷害面積40%～60%；4 級：冷害面積大于60%。冷害指數(shù)計算公式如下：

式中：

CII——冷害指數(shù)；

s——冷害級數(shù)；

ns——該等級果實個數(shù)；

nt——果實總個數(shù)。

采用GY-3 型果實硬度計測定赤道兩側(cè)去皮果肉硬度，探頭直徑為8 mm，結(jié)果表示為N。

1.3.3 丙二醛含量的測定

參考Gao 等[19]方法測定。稱取果肉樣品2 g，以6 mLw=10%三氯乙酸溶液（含w=0.5%硫代巴比妥酸）勻漿。混合物在沸水中煮沸10 min，流動水迅速冷卻后，于5 000 r/min 離心15 min。取上清液，測定其在450、532、600 nm 處吸光度值。丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量以鮮重計，單位：μmol/g。

1.3.4 淀粉、可溶性糖含量測定

淀粉的提取和測定參考曹建康等[20]方法，采用碘-淀粉比色法測定。稱取果肉樣品2 g，依次以5 mL乙醚和80%乙醇勻漿，過濾，棄去濾液，重復(fù)上述步驟3 次。將濾渣完全轉(zhuǎn)移至燒杯中，并于沸水浴中加熱至淀粉完全糊化，冷卻后用蒸餾水定容至25 mL，即為淀粉提取液。將2 mL 淀粉提取液與7.8 mL 蒸餾水混勻，再加入0.2 mL 5 g/L碘液，混勻并靜置10 min。測定其在660 nm 處吸光度值。淀粉含量根據(jù)淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，以鮮質(zhì)量計，%。

果糖、葡萄糖和蔗糖的提取參考Zhou 等[21]方法。稱取果肉樣品2 g，以6 mL 乙腈-水溶液（V/V=4:6）勻漿，75 ℃熱水浸提20 min，超聲波提取30 min，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min 后取上清液，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后用于高效液相色譜分析。色譜條件：Athena NH2-RP 色譜柱（4.6×250 mm，5 μm），柱溫35 ℃，檢測器：示差折光檢測器，流動相：乙腈-水溶液=78:22（V/V），流速：1 mL/min，進(jìn)樣體積：10 μL。果糖、葡萄糖和蔗糖含量分別根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，以鮮重計，單位：mg/g。

1.3.5 碳水化合物代謝相關(guān)酶活性測定

總淀粉酶活性參考曹建康等[20]方法測定。稱取果肉樣品3 g，以5 mL 蒸餾水勻漿，室溫下放置提取20 min。4 ℃、8 000 r/min 離心20 min 后，收集上清液為淀粉酶粗提液。淀粉酶粗提液和10 g/L 淀粉溶液置于40 ℃水浴中預(yù)保溫10 min 后，取1 mL 淀粉酶粗提液與1 mL 淀粉溶液混勻，于40 ℃水浴中準(zhǔn)確保溫反應(yīng)5 min，再加入2 mL DNS 試劑，混勻并于沸水浴中煮沸5 min，流動水迅速冷卻。以滅活的酶液為對照，測定其在540 nm 處的吸光度值?？偟矸勖富钚砸悦糠昼娒靠缩r重果肉樣品中酶催化產(chǎn)生的麥芽糖含量表示，單位：mg/(g·min)。

蔗糖代謝相關(guān)酶的提取參考Deng 等[22]方法。蔗糖磷酸合成酶（Sucrose Phosphate Synthase，SPS）、蔗糖合酶（Sucrose Synthase，SS）、酸性轉(zhuǎn)化酶（Acid Invertase，AI）和中性轉(zhuǎn)化酶（Neutral Invertase，NI）活性參考Sun 等[23]方法測定。SPS 活性以每小時每克鮮重果肉樣品中酶催化產(chǎn)生的蔗糖含量表示，將每小時催化反應(yīng)體系生成1 mg 蔗糖所需的酶量定義為1個酶活性單位（U），單位：U/g。SS、AI 和NI 活性均以每小時每克鮮重果肉樣品中酶催化產(chǎn)生的還原性糖含量表示，將每小時催化反應(yīng)體系生成1 mg 還原性糖所需的酶量定義為1 個酶活性單位（U），單位：U/g。

己糖激酶（Hexokinase，HK）和果糖激酶（Fructokinase，F(xiàn)K）活性參考Cao 等[24]方法測定。均以每分鐘每克鮮重果肉樣品中酶催化反應(yīng)體系在340 nm 處吸光度變化表示，將每分鐘催化反應(yīng)體系吸光度變化0.01所需的酶量定義為1個酶活性單位（U），單位：U/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有指標(biāo)的測定均完全隨機(jī)重復(fù)3 次，實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2019 軟件進(jìn)行統(tǒng)計，相關(guān)性系數(shù)采用SPSS 21.0 數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，Origin 8.5 軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗和作圖，p＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 MT 處理對獼猴桃果實冷害指數(shù)、硬度和MDA 含量的影響

如圖1a 所示，對照果實在貯藏第45 d 時開始表現(xiàn)出冷害癥狀，冷害指數(shù)為0.02，之后，隨貯藏時間延長，冷害指數(shù)不斷增大。MT 處理將冷害癥狀的出現(xiàn)時間延遲了15 d，且顯著抑制了貯藏60～90 d 果實冷害指數(shù)的升高（p＜0.05）。貯藏結(jié)束時，MT 處理果實的冷害指數(shù)為0.19，較對照果實（0.36）低47.22%。表明0.05 mmol/L MT 處理有利于獼猴桃果實抗冷性的提高。這與胡苗等以0.1 mmol/L MT 處理“華優(yōu)”獼猴桃得到的結(jié)論相似[11]。硬度是獼猴桃果實貯藏品質(zhì)的重要評價指標(biāo)之一。如圖1b 所示，對照和MT處理果實的硬度均呈下降趨勢變化，且均在貯藏30～60 d 損失較快，貯藏45～90 d 時差異顯著（p＜0.05）。貯藏第90 d 時，對照和MT 處理果實的硬度分別由采收當(dāng)天的117.60 N 降至32.67 N 和41.16 N，下降了72.22%和65.00%。冷害的發(fā)生往往伴隨著獼猴桃果實的軟化[25]。對對照和MT 處理果實的硬度與冷害指數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，均呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.898 和r=-0.925，p＜0.01）（圖1d）。由此可知，MT 處理可以通過延緩冷害的發(fā)生進(jìn)而一定程度上保持了果實的硬度。細(xì)胞膜是果實冷害發(fā)生的原初部位。低溫脅迫下，細(xì)胞膜相變導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的發(fā)生，并引發(fā)細(xì)胞膜氧化損傷。MDA 是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，是公認(rèn)的細(xì)胞膜氧化損傷標(biāo)識物[2]。如圖1c 所示，對照和MT 處理果實的MDA含量均隨貯藏時間的延長而呈上升趨勢變化，但MT處理果實的MDA 含量在整個貯藏期內(nèi)始終低于對照（p＜0.05）。貯藏第90 d 時，MT 處理果實的MDA含量為9.40 μmol/g，而對照果實的MDA 含量為11.45 μmol/g，是MT 處理果實的1.22 倍。結(jié)果表明MT處理可以減輕低溫對獼猴桃果實細(xì)胞膜的損傷，抑制MDA 的生成，促進(jìn)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整與功能的穩(wěn)定，進(jìn)而提高了獼猴桃果實的抗冷性，延緩了冷害的發(fā)生。這與前人在桃、石榴、杏等果實上的研究結(jié)果一致[9,10]。

圖1 MT 處理對獼猴桃果實冷害指數(shù)(a)、硬度(b)和MDA 含量（c）的影響及對照、MT 處理果實冷害指數(shù)與硬度（d）的相關(guān)性Fig.1 Effect of MT treatment on chilling injury index (a),firmness (b) and MDA content (c) in kiwifruit and correlations between chilling injury index and firmness (d) in control and MT-treated fruit

2.2 MT 處理對獼猴桃果實淀粉、果糖、葡萄糖和蔗糖含量的影響

淀粉具有維持果實細(xì)胞膨壓，支持果實硬度的作用。淀粉還能降解為可溶性糖為果實提供呼吸底物，對果實的品質(zhì)和保鮮期產(chǎn)生影響[26]。獼猴桃是典型的淀粉積累型果實，貯藏期間，保持果實中較高的淀粉含量是促進(jìn)貯藏品質(zhì)、延長貯藏期限的有效方法。如圖2a 所示，對照和MT 處理果實的淀粉含量均隨貯藏時間的延長逐漸降低，但MT 處理果實的淀粉降解較為緩慢，均與對照差異顯著（p＜0.05）。對照和MT處理果實在貯藏期內(nèi)的淀粉含量損失分別為98.02%和84.89%，貯藏結(jié)束時，MT 處理果實的淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.07%。果糖、葡萄糖和蔗糖是獼猴桃果實中最主要的三種可溶性糖。如圖2b、2c 所示，對照果實的果糖和葡萄糖含量在貯藏的0～45 d 幾乎線性上升，第45 天時，兩者的含量分別較采收當(dāng)天升高了2.37 倍和2.68倍，隨后上升變緩。MT 處理果實的果糖和葡萄糖含量在貯藏前30 d 亦表現(xiàn)為近乎線性上升，且與對照無明顯差異（p＞0.05），之后上升變緩，但始終低于對照，到貯藏結(jié)束，分別為21.57 和21.19 mg/g，分別較對照果實低10.09%和10.85%（p＜0.05）。對照和MT 處理果實的蔗糖含量在貯藏期間均呈先上升后下降趨勢變化，且在貯藏第45 天時達(dá)到最大值30.03 和26.85 mg/g，但MT 處理抑制了貯藏中后期果實中蔗糖的積累（p＜0.05）（圖2d）。以上結(jié)果表明，MT 處理在抑制獼猴桃果實淀粉降解，延緩果糖、葡萄糖和蔗糖累積方面發(fā)揮了正向的調(diào)控作用，促進(jìn)了果實貯藏品質(zhì)的保持。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，對照和MT 處理果實的淀粉含量與冷害指數(shù)均呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.863 和r=-0.820，p＜0.01）（圖2e），與硬度間均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（r=0.974 和r=0.941，p＜0.01）（圖2f）。由此可知，較高的淀粉含量有利于獼猴桃果實抵御低溫脅迫，MT 處理對淀粉降解的抑制作用是其減輕獼猴桃果實冷害和硬度損失的重要原因之一。

圖2 MT 處理對獼猴桃果實淀粉（a）、果糖（b）、葡萄糖（c）和蔗糖（d）含量的影響及對照、MT 處理果實淀粉含量與冷害指數(shù)（e）和硬度（f）的相關(guān)性Fig.2 Effect of MT treatment on the contents of starch (a),fructose (b),glucose (c) and sucrose (d) in kiwifruit and correlations between starch content and chilling injury index (e) and firmness (f) in control and MT-treated fruit

2.3 MT 處理對獼猴桃果實總淀粉酶活性的影響

淀粉酶是引起果實中淀粉降解的起始酶，其活性升高可直接導(dǎo)致獼猴桃果實的快速軟化[27]。如圖3 所示，貯藏第45 d 時，對照和MT 處理果實的總淀粉酶活性均達(dá)到峰值，分別為7.40 mg/(g·min)和3.95 mg/(g·min)，其中MT 處理果實的總淀粉酶活性僅為對照的53.38%（p＜0.05）。貯藏結(jié)束時，MT 處理果實的淀粉酶活性為1.91 mg/(g·min)，較對照低41.77%（p＜0.05）。整個貯藏期內(nèi)，MT 處理果實的總淀粉酶活性平均較對照低41.27%，表明MT 處理有效抑制了果實的總淀粉酶活性，并進(jìn)一步延遲了淀粉向可溶性糖的轉(zhuǎn)化，使MT 處理果實較對照保持了較高的淀粉含量。淀粉對細(xì)胞的支撐作用賦予了MT 處理果實較高的硬度，再結(jié)合其較低的冷害指數(shù)綜合考慮認(rèn)為，MT 處理介導(dǎo)的獼猴桃果實抗冷性提高與其對總淀粉酶活性的調(diào)控密切相關(guān)。因此，我們推測淀粉可能是獼猴桃果實冷害發(fā)生的一個重要生物標(biāo)志物。

圖3 MT 處理對獼猴桃果實總淀粉酶活性的影響Fig.3 Effect of MT treatment on the activity of total amylase in kiwifruit

2.4 MT 處理對獼猴桃果實SPS、SS、AI 和NI 活性的影響

SPS 是果實蔗糖代謝的一個限速關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)催化蔗糖的合成。如圖4a 所示，對照果實的SPS 活性在貯藏的第60 天達(dá)到酶活峰值（10.02 U/g），隨后下降。MT 處理果實的SPS 活性則僅在貯藏的前45 d 緩慢上升至峰值8.54 U/g，且除第15 天外，始終低于對照（p＜0.05）。貯藏結(jié)束時，MT 處理果實的SPS 活性為7.51 U/g，較對照果實低9.52%。表明MT 處理從抑制酶活力和縮短酶活力持續(xù)時間兩個方面發(fā)揮作用使獼猴桃果實的SPS 活性處于較低水平。對對照和MT 處理果實的SPS 活性與蔗糖含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（r=0.911 和r=0.955，p＜0.01）（圖4e）。由此可知，SPS 活性與獼猴桃果實的蔗糖合成直接相關(guān)，MT 處理則通過抑制SPS 活性減緩了果實中蔗糖的累積。不同于SPS，SS、AI 和NI 是蔗糖代謝中負(fù)責(zé)將蔗糖催化裂解為果糖和葡萄糖的關(guān)鍵酶。如圖4b 所示，對照和MT 處理果實的SS 活性變化與SPS 活性相似，貯藏30～90 d時，MT 處理對SS 活性呈現(xiàn)了抑制效應(yīng)（p＜0.05）。同時，MT處理也抑制了果實的AI和NI活性（p＜0.05）（圖4c、4d）。貯藏第90 d 時，MT 處理果實的SS、AI 和NI 活性僅為11.96、38.92 和54.96 U/g，分別較對照果實低9.12%、8.55%和9.74%。對對照和MT 處理果實的SS、AI 和NI 活性與蔗糖含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明SS 和NI 活性均與蔗糖含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（r=0.863、r=0.727 和r=0.848、r=0.709，p＜0.01）（圖4f、4h），而AI 活性則與蔗糖含量的相關(guān)性較低（圖4g）。由此可知，SS 和NI 主要參與了獼猴桃果實的蔗糖裂解過程，且與其活性與蔗糖裂解的速率密切相關(guān)，MT 處理則主要通過對SS 和NI 的共抑制，減緩了果實中蔗糖的累積。研究表明，高活性的蔗糖合成-裂解循環(huán)一定程度上可促進(jìn)果實中淀粉向可溶性糖的轉(zhuǎn)化[28]。因此，削弱蔗糖合成-裂解循環(huán)可能是MT 處理延緩淀粉降解的又一可能途徑，是MT 處理減輕獼猴桃果實冷害的又一可能機(jī)制。

圖4 MT 處理對獼猴桃果實SPS（a）、SS（b）、AI（c）和NI（d）活性的影響及對照、MT 處理果實SPS、SS、AI 和NI 活性分別與蔗糖含量（e～h）的相關(guān)性Fig.4 Effect of MT treatment on the activities of SPS (a),SS (b),AI (c) and NI (d) in kiwifruit and correlations between the activities of SPS,SS,AI and NI and sucrose content (e～h) in control and MT-treated fruit

2.5 MT 處理對獼猴桃果實HK 和FK 活性的影響

HK 和FK 是果實己糖代謝的關(guān)鍵酶，主要催化果糖和葡萄糖的磷酸化[29]。如圖5 所示，對照和MT 處理果實的HK 和FK 活性均呈先升高后下降趨勢變化，并在貯藏的第15 d 達(dá)到峰值。整個貯藏期內(nèi)，MT 處理果實具有較高的HK 和FK 活性，MT 處理促進(jìn)了0～15 d 果實HK 和FK 活性的升高，分別由采收當(dāng)天的1.08 U/g 和0.90 U/g 升高至2.44 U/g 和1.65 U/g。同時，MT 處理也抑制了隨后的活性下降，貯藏結(jié)束時，較對照果實高61.54%和67.50%（p＜0.05）。結(jié)果表明MT 處理從促進(jìn)酶活力和延長酶活力持續(xù)時間兩個方面發(fā)揮作用使獼猴桃果實的HK和FK活性處于較高水平。HK 和FK 是糖酵解產(chǎn)生能量的重要影響因素[29]，Zhao 等[30]在油桃果實上發(fā)現(xiàn)較高的HK 和FK活性有助于充足的能量供應(yīng)和果實抗冷性的提高。據(jù)此，我們推測MT 處理可以通過促進(jìn)能量供應(yīng)減緩獼猴桃果實冷害的發(fā)生，但相關(guān)內(nèi)容還待進(jìn)一步驗證。

圖5 MT 處理對獼猴桃果實HK(a)和FK(b)活性的影響Fig.5 Effect of MT treatment on the activities of HK (a) and FK(b) in kiwifruit

3 結(jié)論

0.05mmol/L MT 處理延緩了獼猴桃果實冷害的發(fā)生，具體表現(xiàn)為降低了果實的冷害指數(shù)、硬度損失和MDA 積累。淀粉可能是獼猴桃果實冷害發(fā)生的一個重要生物標(biāo)志物，MT 處理對淀粉含量的影響可能與其對總淀粉酶活性和蔗糖合成-裂解循環(huán)的共調(diào)控直接相關(guān)。