雷露，余波，周景瑞，王川南，吳天祥,3*

（1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，貴州貴陽(yáng) 550005）（2.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025）（3.貴州食品工程職業(yè)學(xué)院糧油食品工程系，貴州貴陽(yáng) 551400）

灰樹(shù)花（Grifola frondosa）隸屬于多孔菌科樹(shù)花菌屬，又名重菇、蓮花菌等，是一種名貴的食藥兩用真菌[1]。通過(guò)液體深層發(fā)酵的培養(yǎng)方法可高效、快速的獲取灰樹(shù)花中的多酚、蛋白質(zhì)、多糖、萜類、氨基酸、甾醇等生物活性物質(zhì)[2,3]，其中胞外多糖（EPS)是灰樹(shù)花發(fā)酵液的重要活性成分之一，具有抗氧化[4]、抗腫瘤[5]、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力[6]、抗HIV[7]等生理功效。在灰樹(shù)花EPS 的合成過(guò)程中酶起著舉足輕重的作用，灰樹(shù)花菌體合成EPS 的途徑如圖1 所示[8]，菌體將葡萄糖作為碳源物質(zhì)，在激酶（Glucokinase，GK）催化作用下轉(zhuǎn)化成葡萄糖-6-磷酸（Glucose-6-phosphate，GSP)，進(jìn)入兩條代謝路徑，一條是在磷酸葡萄糖異構(gòu)酶（GPI ）的作用下轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸（Fructose-6-phosphate，F(xiàn)SP)，經(jīng)過(guò)一系列轉(zhuǎn)化反應(yīng)后生成乳酸（LA)；另外一條通路則是在磷酸葡萄糖變位酶（PGM）和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase)的作用下將GSP在轉(zhuǎn)化成UDP-葡萄糖（UDP-glucose，UDPG）參與糖鏈的連接，該途徑與靈芝EPS 合成途徑相類似[9,10]?？煽闯?，GPI、PGM、UGPase 是胞外多糖合成的關(guān)鍵酶[11]。

圖1 灰樹(shù)花EPS 生物合成途徑Fig.1 The EPS biosynthesic pathway of Grifola frondosa

隨著人們生活品質(zhì)的提高，有氧運(yùn)動(dòng)成為主流，但當(dāng)前的運(yùn)動(dòng)飲料多以糖類、鹽類為主要成分，僅起到預(yù)防運(yùn)動(dòng)后身體中的水鹽紊亂作用[12]，因此研究藥食用真菌發(fā)酵液的抗疲勞功效，研發(fā)新型運(yùn)動(dòng)飲料極具開(kāi)發(fā)價(jià)值。焦迎春等[13]從柴達(dá)木大肥菇發(fā)酵液中提取的EPS灌胃小鼠35 d后能夠顯著提高其體內(nèi)肝糖原（HG）含量和血清中的乳酸脫氫酶（LDH）活性，降低血清尿素氮（BUN）和LA 含量，表現(xiàn)出良好的抗疲勞功效。胡振宇[14]發(fā)現(xiàn)用姬松茸發(fā)酵液連續(xù)灌胃小鼠30 d 后，小鼠的負(fù)重游泳與爬桿時(shí)間得到明顯延長(zhǎng)，同時(shí)肝組織中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性也顯著提升；劉洋等[15]研究發(fā)現(xiàn)，添加人參水煎液的靈芝發(fā)酵液可明顯延長(zhǎng)小鼠游泳耗竭時(shí)間，并降低血液中LA 含量，從而表現(xiàn)出良好的抗疲勞效果。近年來(lái)，在藥食用真菌領(lǐng)域上開(kāi)發(fā)運(yùn)動(dòng)保健型飲料逐漸得到重視，但有關(guān)灰樹(shù)花抗疲勞作用的相關(guān)研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本課題組前期研究表明在灰樹(shù)花深層發(fā)酵體系中添加7 g/L 的天麻醇提物和5 g/L 的苦蕎醇提物，可顯著提升灰樹(shù)花EPS 的產(chǎn)量（與空白組相比提高49.08%）[16]。為進(jìn)一步探明EPS 產(chǎn)量的提升與EPS生物合成途徑中的酶是否有一定的相關(guān)性，本研究通過(guò)向灰樹(shù)花深層發(fā)酵體系中添加7 g/L 天麻醇提物、5 g/L 苦蕎醇提物以及這兩種醇提物的復(fù)配液，動(dòng)態(tài)測(cè)定PGM、GPI 和UGPase 三種關(guān)鍵酶活性的變化。用發(fā)酵液連續(xù)灌胃試驗(yàn)小鼠30 d 后，測(cè)定小鼠負(fù)重游泳的首次下沉?xí)r間、力竭時(shí)間，以及游泳試驗(yàn)結(jié)束后肝臟HG 含量和血清中LA、LDH、BUN 含量。該文旨在為研究酶活的改變以誘導(dǎo)灰樹(shù)花更高效的發(fā)酵給予相應(yīng)的理論基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和試驗(yàn)依據(jù)，以期開(kāi)發(fā)出優(yōu)質(zhì)的灰樹(shù)花發(fā)酵液保健品。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與編號(hào)

SPF 級(jí)體質(zhì)量為20±2 g 的雄性昆明小鼠，長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0013。

1.2 菌種與試劑

灰樹(shù)花5.404 菌種，中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）；天麻和苦蕎籽粒，貴州德江縣和威寧縣。

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、α-葡萄糖-1-磷酸鈉鹽、D-果糖-6-磷酸二鈉、α-磷酸葡萄糖變位酶、β-NADP+、UDP-葡萄糖，美國(guó)Sigma 公司；Tris-HCl、焦磷酸鉀，北京索萊寶科技有限公司；無(wú)水乙醇、MgCl2、NaCl，國(guó)藥集團(tuán)；血清尿素氮（BUN）、乳酸脫氫酶（LDH）、糖原、血乳酸（LA）測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

Thermo-17R 型離心機(jī)，德國(guó)賽默飛儀器公司；BXM-30R 型滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)醫(yī)療設(shè)備廠；SPECTRA MAX 190 型酶標(biāo)儀，昆明納瑞科技有限公司；CP114 型電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；SW-CJ-1D 型超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.4 灰樹(shù)花培養(yǎng)

培養(yǎng)溫度：25 ℃。方法：從母種試管中挑取少量菌體接種至PDA 斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)10～14 d，轉(zhuǎn)移至150 r/min 搖床液體種子培養(yǎng)4 d 后，再轉(zhuǎn)移至同轉(zhuǎn)速搖床發(fā)酵培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)組加入天麻、苦蕎醇提物）培養(yǎng)7 d。

1.5 制備醇提物

分別取洗凈烘干的天麻、苦蕎，用高速磨粉機(jī)粉碎后過(guò)80 目篩，用φ=75%乙醇（天麻常溫下浸提48 h，苦蕎60 ℃冷凝回流2 h）提取醇提物，80 r/min 旋蒸除乙醇，最后用蒸餾水（1 g 天麻或苦蕎用10 mL 蒸餾水）定容，既得到醇提液（每10 mL 醇提液中含1 g天麻或苦蕎）[8,16]。將7 g/L 天麻醇提物與5 g/L 苦蕎醇提物按體積比1:1 混合得試驗(yàn)用天麻苦蕎復(fù)配液。

1.6 酶活力的測(cè)定

1.6.1 粗酶液的提取

灰樹(shù)花發(fā)酵液用濾紙過(guò)濾，得到菌絲體，用4 ℃的細(xì)胞提取緩沖液（0.02 mol/L 磷酸鉀鹽pH 值6.5）洗滌菌絲體表面殘留的發(fā)酵液，轉(zhuǎn)移菌絲體至預(yù)冷的研缽中，加入5 mL 細(xì)胞提取緩沖液后順著同一方向研磨至漿狀，在4 ℃，15 000 r/min 條件下離心20 min，取上清液。上清液中的蛋白濃度測(cè)定采用Bradford 法[17]。

1.6.2 酶活力的測(cè)定

參照聶文強(qiáng)[18]、李陽(yáng)[19]的方法，根據(jù)PGM、UGpase 和GPI 三種酶活力測(cè)定的反應(yīng)體系，添加各反應(yīng)物于具塞試管中，加入1 mL 粗酶液，混勻。取200 μL 放入微孔酶標(biāo)板中，在30 ℃，340 nm 處測(cè)定NAD(P)H 的變化。1 個(gè)酶活單位（U）定義為每分鐘增加或減少的1 μmol NAD(P)H 所需酶量。計(jì)算公式見(jiàn)下。

式中：

ΔA/Δt——吸光值在60 s 的變化率；

Vq——所加酶液體積，mL；

Vy——反應(yīng)體系總體積，mL；

ε——6.22×103L/(mol·cm)；

d——吸收光徑，cm。

1.7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.7.1 灌胃方法

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，每組隨機(jī)選取8 只分成6組，共48 只。分別為：空白組（生理鹽水）、對(duì)照組（灰樹(shù)花發(fā)酵液）、復(fù)配液對(duì)照組（天麻苦蕎復(fù)配液）、三個(gè)實(shí)驗(yàn)組（分別灌胃添加天麻醇提物、添加苦蕎醇提物和添加天麻苦蕎復(fù)配液的灰樹(shù)花發(fā)酵液）。

灌胃周期30 d，根據(jù)小鼠體質(zhì)量按量給藥，每日一次（灌胃體積：0.01 mL/g）。

1.7.2 指標(biāo)的測(cè)定

第30 d 灌胃后0.5 h 稱量小鼠體質(zhì)量→尾巴中下部捆綁質(zhì)量為小鼠質(zhì)量5%的鉛皮→放入水槽中（25±0.5）℃游泳（記錄首次下沉的時(shí)間與沉入水面8 s 無(wú)法上游時(shí)間即為游泳力竭時(shí)間）→摘眼球取血→解剖取出肝臟→測(cè)定BUN、LA、LDH、HG 的含量。

1.8 數(shù)據(jù)處理

以平均值（X）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示數(shù)據(jù)，分析顯著性用IBM SPSS Statistics 23 軟件，繪圖軟件用Origin 2017。

2 結(jié)果與討論

2.1 醇提物對(duì)灰樹(shù)花EPS 合成酶類的影響

2.1.1 磷酸葡萄糖變位酶

以7 g/L 的天麻醇提物（天麻組）、5 g/L 的苦蕎醇提物（苦蕎組）和天麻7 g/L、苦蕎5 g/L 復(fù)配液（復(fù)配組）為三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，不添加醇提物的發(fā)酵液為空白組進(jìn)行試驗(yàn)。每2 d 取一次樣，測(cè)定PGM 活力，繪制動(dòng)態(tài)變化曲線如圖2 所示，在發(fā)酵前期，各組PGM活力迅速提升，且復(fù)配組的活力最強(qiáng)。發(fā)酵的第7 d，所有組別的PGM活力均達(dá)到頂峰值后開(kāi)始緩慢下降，這是由于在發(fā)酵的1～3 d，菌體處于調(diào)整期，發(fā)酵液中菌絲體極少，使得產(chǎn)PGM 活力較低；3～7 d，菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，PGM 活力迅速提高；7～13 d，菌體生長(zhǎng)處于穩(wěn)定期并逐漸進(jìn)入衰亡期，PGM 活力開(kāi)始降低。在第7 天時(shí)，酶活具體表現(xiàn)在：復(fù)配組為最高0.32 U，其次是天麻組0.27 U，再次是苦蕎組0.26 U，最后是空白組0.17 U，復(fù)配組、天麻組、苦蕎組的PGM活力與空白組相比提高了88.26%、58.82%、52.94%，且差異顯著（p＜0.05）。表明天麻、苦蕎醇提物復(fù)配添時(shí)能夠?qū)GM 活力起到最佳效果（p＜0.05），使得合成EPS 過(guò)程中，葡萄糖轉(zhuǎn)化成GSP 之后在PGM 活力提升的影響下，合成葡萄糖-1-磷酸（Glucose-1-phosphate，GOP）的效率和產(chǎn)量也得到提高，為灰樹(shù)花EPS 的合成提供更充足的糖原物質(zhì)。

圖2 發(fā)酵過(guò)程中PGM 活力的變化Fig.2 Change of PGM activity during Grifola frondosa fermentation

2.1.2 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶

UGPase 是灰樹(shù)花菌體合成胞外多糖的途徑（GSP→GOP→UDPG→…→EPS 重復(fù)單元）中重要的關(guān)鍵酶之一，通過(guò)該途徑可得出，EPS 產(chǎn)量高低與其活力大小呈正相關(guān)。試驗(yàn)期間，整個(gè)發(fā)酵周期的UGPase 活力變化如圖3 所示。從發(fā)酵的第3 天開(kāi)始，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的UGPase 活力呈明顯上升趨勢(shì)且均顯著高于空白組（p＜0.05）。在第7 天，UGPase 活力變化與PGM 表現(xiàn)一致，達(dá)到最高值，其中復(fù)配組的UGPase活力為0.25 U，與天麻組0.22 U、苦蕎組0.20 U 和空白組0.15 U相比分別增加了13.63%、25.00%、66.67%。Wu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，PGM和UGPase是影響灰樹(shù)花EPS種類和單糖成分的關(guān)鍵酶。結(jié)合上一步試驗(yàn)可得出，天麻和苦蕎醇提物中存在某些對(duì)PGM和UGPase活力增效的成分，且這些成分有著協(xié)同增效的作用，使得在EPS 的合成中，通過(guò)改變多糖種類和單糖成分，進(jìn)一步為EPS 的合成提供更多前體物質(zhì)，此結(jié)論與唐家毅等[21]的研究相一致。

圖3 發(fā)酵過(guò)程中UGPase 活力變化Fig.3 Change of UGPase activity during Grifola frondosa fermentation

2.1.3 磷酸葡萄糖異構(gòu)酶

由圖4 可知，GPI 活力的變化與PGM 和UGPase正好相反。從發(fā)酵第5 d 開(kāi)始，實(shí)驗(yàn)組的GPI 活力均顯著低于空白組（p＜0.05），這說(shuō)明一定濃度醇提物的添加能夠讓GPI 活力受到抑制，且抑制作用最為明顯的是復(fù)配組。各組的GPI 活力在第7 d 達(dá)到最大，這是由于在灰樹(shù)花整個(gè)發(fā)酵階段，第7 d 為菌體生長(zhǎng)的最旺盛時(shí)期[17]。與空白組（0.19 U）相比，苦蕎組（0.17 U）、天麻組（0.15 U）和復(fù)配組（0.11 U）的GPI 活力分別降低了11.76%、26.67%、72.73%。GPI活力的減弱，會(huì)提升糖異生途徑（EPS 合成途徑）的碳通量，提升GSP 轉(zhuǎn)化為UDPG 的效率，有利于灰樹(shù)花菌體合成EPS，使得實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵液中EPS 含量增加。

圖4 發(fā)酵過(guò)程中GPI 活力的變化Fig.4 Change of GPI activity during Grifola frondosa fermentation

2.2 小鼠抗疲勞指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

2.2.1 體質(zhì)量分析

觀測(cè)灌胃30 d 后，小鼠體質(zhì)量的增長(zhǎng)率。結(jié)果如表1 所示，所有試驗(yàn)小鼠體質(zhì)量在灌胃30 d 后均增加，空白組雖然增長(zhǎng)率稍低一些。但與其余組別比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05），說(shuō)明發(fā)酵液和醇提物均不會(huì)加速小鼠體質(zhì)量的增長(zhǎng)，同時(shí)也未影響試驗(yàn)小鼠的正常生長(zhǎng)發(fā)育。

表1 小鼠體質(zhì)量的對(duì)比分析Table 1 Comparative analysis of the body weight of mice(X±SD,n=8)

2.2.2 負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果

運(yùn)動(dòng)耐力試驗(yàn)被普遍用于評(píng)估疲勞現(xiàn)象，負(fù)重游泳試驗(yàn)是通常被作為檢驗(yàn)抗疲勞的試驗(yàn)方法之一[22]。通過(guò)表2 對(duì)比發(fā)現(xiàn)，灌胃了灰樹(shù)花發(fā)酵液的小鼠，首次下沉?xí)r間和游泳力竭時(shí)間均得到延長(zhǎng)，與空白組和復(fù)配液對(duì)照組比較均有顯著性差異（p＜0.05），復(fù)配液對(duì)照組與空白組相比無(wú)顯著性差異（p＞0.05），表明未與灰樹(shù)花共同發(fā)酵的天麻、苦蕎醇提物不能提高小鼠的運(yùn)動(dòng)能力，由此可排除醇提物自身所帶來(lái)的干擾因素。此外，復(fù)配組的小鼠游泳耐力效果最好，其作用優(yōu)于除天麻組以外的其余組別，并分別是空白組和對(duì)照組的2.92 倍和1.22 倍，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，醇提物的添加使得灰樹(shù)花發(fā)酵液中的EPS 含量提升，糖類作為主要能源物質(zhì)在運(yùn)動(dòng)中由線粒體通過(guò)有氧呼吸分解后合成ATP，并直接釋放能量，提升小鼠游泳耐力。

表2 小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的對(duì)比分析Table 2 Comparative analysis on the swimming time of mice with loads (X±SD, n=8)

2.2.3 尿素氮和肝糖原含量的測(cè)定結(jié)果

由表3 可知，兩個(gè)對(duì)照組和三個(gè)實(shí)驗(yàn)組均能不同程度的降低小鼠負(fù)重游泳結(jié)束后血清中BUN 含量，而肝臟中HG 含量得到提升。BUN 是評(píng)價(jià)機(jī)體承受能力的特征指標(biāo)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)開(kāi)始代謝參與供能時(shí)，BUN含量提升，其含量與運(yùn)動(dòng)時(shí)間呈正相關(guān)，增幅越大表明機(jī)體運(yùn)動(dòng)負(fù)荷能力越差[23]。從表3 得知，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組BUN 含量與空白組和復(fù)配對(duì)照組相比均顯著降低（p＜0.05），空白組和對(duì)照組與復(fù)配組相比分別降低了52.57%和31.66%，由此說(shuō)明在灰樹(shù)花發(fā)酵體系中添加天麻苦蕎復(fù)配液能夠使發(fā)酵液中抗疲勞因子總量增多，提高機(jī)體的運(yùn)動(dòng)承受能力，延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)時(shí)間。

表3 尿素氮和肝糖原含量的對(duì)比分析Table 3 Comparative analysis of BUN and HG content(X±SD,n=8)

隨著運(yùn)動(dòng)時(shí)間的延長(zhǎng)，糖原物質(zhì)的耗盡是產(chǎn)生疲勞的主要原因之一[24]，因此，有效的緩解運(yùn)動(dòng)疲勞可通過(guò)增加機(jī)體中的糖原儲(chǔ)備量，以此提升運(yùn)動(dòng)耐力。從表3 可看出，對(duì)照組和復(fù)配對(duì)照組與空白組相比較，HG 含量有小范圍的提高，但不顯著（p＞0.05）；而三個(gè)實(shí)驗(yàn)組與空白組相比，均能顯著提高小鼠肝臟中HG 含量（p＜0.05），說(shuō)明含有醇提物的灰樹(shù)花發(fā)酵液對(duì)小鼠進(jìn)行一段時(shí)間的灌胃后，發(fā)酵液中的EPS 作為外源性糖分可有效提高其肝臟合成糖原的速度，以此來(lái)提高機(jī)體內(nèi)糖原物質(zhì)的儲(chǔ)備量，延緩疲勞發(fā)生。

2.3.4 血清中乳酸脫氫酶、乳酸含量的測(cè)定結(jié)果

LA 含量是評(píng)價(jià)機(jī)體疲勞的指標(biāo)之一，在劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，產(chǎn)生的LA 得不到有效分解就會(huì)引起肌肉酸痛，從而產(chǎn)生疲勞感[25]，此時(shí)，LDH 可加快清除無(wú)氧糖酵解所產(chǎn)生的LA，減少其在機(jī)體內(nèi)的堆積，減緩或加速消除疲勞感[26]。由表4 可知，與空白組小鼠相比，除復(fù)配液對(duì)照組外，其余組別小鼠血清中LA 的含量均減少，而LDH 的含量均在一定程度上得到提高。效果最為明顯的組別為復(fù)配組（p＜0.05），其LA 含量與空白組和對(duì)照組相比，降低了46.01%和34.54%，LDH 提升了19.19%和11.30%；復(fù)配液對(duì)照組的LA和LDH 含量與空白組相比均無(wú)顯著影響（p＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，添加天麻苦蕎復(fù)配液的灰樹(shù)花發(fā)酵液可通過(guò)提升LDH 在小鼠機(jī)體內(nèi)的含量，從而分解長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)過(guò)程中無(wú)氧呼吸產(chǎn)生的LA，緩解肌肉酸痛感而達(dá)到抗疲勞效果。

表4 乳酸脫氫酶和乳酸含量對(duì)比分析Table 4 Comparative analysis of LDH and LA contents(X±SD,n=8)

3 結(jié)論

本研究能夠初步證實(shí)添加天麻、苦蕎醇提物后灰樹(shù)花EPS 含量提升與PGM、UGPase 和GPI 三種酶密切相關(guān)。吳彩云等[27]研究發(fā)現(xiàn)在灰樹(shù)花深層發(fā)酵中，菌絲體能消耗天麻醇提物中的天麻素、對(duì)羥基苯甲醛和對(duì)羥基苯甲醇，尤其是對(duì)羥基苯甲醛基本完全吸收。Chen 等[28]在苦蕎醇提物中發(fā)現(xiàn)其含有豐富的蘆丁、槲皮素等活性成分，但具體是哪一種或者哪幾種成分對(duì)改變EPS 合成關(guān)鍵酶活性，提升發(fā)酵液中的抗疲勞因子尚不清楚，需做進(jìn)一步研究。在該研究中，本課題組也首次發(fā)現(xiàn)了灰樹(shù)花發(fā)酵液具有良好的抗疲勞作用，且將天麻苦蕎復(fù)配液與灰樹(shù)花共同發(fā)酵之后，所得發(fā)酵液抗疲勞作用起到1+1＞2 的效果。研究結(jié)果表明，灰樹(shù)花發(fā)酵液能夠作為一種天然的初級(jí)保健產(chǎn)品，可進(jìn)行下一步的深入研究，為灰樹(shù)花功能型飲料的研發(fā)提供理論支撐。