朱育連，陳丹丹，歐陽小娟，王旭洲，朱靈華

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院病理科，福建 福州 350000)

結核病是臨床多發(fā)的慢性傳染性疾病，通常侵及肺部，結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)是引起結核病的病原菌[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查統(tǒng)計，全球每年結核病病例達800～1 000萬，其作為造成死亡人數(shù)最多的單一傳染病，已成為威脅全球民眾健康安全的公共衛(wèi)生問題[2]。MTB可經(jīng)消化道、呼吸道及皮膚黏膜損傷侵入機體，早期潛伏在人體內(nèi)，并在組織細胞內(nèi)大量繁殖，其菌體成分和代謝物質(zhì)毒性可誘導機體發(fā)生免疫損傷，故早期檢測MTB至關重要。

實時熒光定量核酸擴增檢測技術(Xpert Mtb/RIF)為一種以利福平耐藥相關rpoΒ基因為靶基因的全自動半巢式實時PCR體外診斷技術，可在2 h內(nèi)快速檢測MTB和利福平耐藥[3]。經(jīng)過對既往文獻[4]的總結，本研究發(fā)現(xiàn)該技術在結核病診斷及其利福平耐藥中具有檢測高效快速，短時間獲取結果的優(yōu)勢，可為初診患者爭取最佳治療時間。但國內(nèi)外鮮有研究報道該技術在不同類型標本中的診斷效能。本研究對比Xpert Mtb/RIF檢測痰標本、肺泡灌洗液、漿膜腔積液及膿液等不同類型標本中MTB陽性率及利福平耐藥性的靈敏度。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年2月至2019年2月中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院收治的497例肺結核患者，年齡(49.35±8.71)歲，男性257例,女性240例。納入標準：所有患者均符合肺結核診斷標準[5]；入組前未接受抗結核藥物治療。剔除臨床資料不完整者。收集痰標本205例，肺泡灌洗液221例，漿膜腔積液202例，膿液179例，其中有135例患者同時獲得4種標本。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 Xpert MTB/RIF GeneXpert系統(tǒng)(美國Cepheid公司)，BACTEC MGIT 960系統(tǒng)及配套培養(yǎng)基(美國BD公司)、抗酸染色試劑、消化液(美國BD公司)，抗酸染液(珠海BASO公司)等。

1.2.2 MTB檢測 取2 mL標本用N-乙酰-L-半胱氨酸-氫氧化鈉化處理，強力旋渦震蕩后室溫靜置，加入磷酸鹽緩沖液，離心15 min后棄去上清液，沉淀后制備成懸濁液，取0.5 mL接種于培養(yǎng)管，采用BACTEC MGIT 960系統(tǒng)進行培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性的樣本進一步以最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)法進行結核藥敏試驗。

1.2.3 Xpert Mtb/RIF檢測 取1 mL體液標本加入前處理管中，視樣本性狀加入兩倍處理液，旋緊螺旋蓋，灌洗液經(jīng)離心后加入處理液，渦旋振蕩15～30 s，室溫靜置。充分液化后用專用無菌吸管吸取2 mL處理后樣本緩慢加入Cartridge單獨反應盒內(nèi)，放入檢測模塊開始進行自動化檢測，約2 h后加入盒子，在Xpert MTB/RIF GeneXpert系統(tǒng)中直接讀取MTB和利福平耐藥性結果。對MTB結果判讀根據(jù)DNA拷貝的高低分為高、中、低、極低和未檢出5個量級；RIF藥敏結果分為RIF Resistance檢出，RIF耐藥和RIF Resistance未檢出，RIF敏感[6]。

1.2.4 質(zhì)量控制 本實驗操作人員均參加并通過中國疾病預防控制中心組織的結核病實驗室藥敏測試及全國結核病分子診斷技術能力驗證等培訓及考試。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理與分析。分類變量資料以[n(%)]表示，組間采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同標本中MTB培養(yǎng)和Xpert Mtb/RIF檢測MTB的陽性率對比

807例標本中MTB培養(yǎng)檢測陽性515例，Xpert Mtb/RIF檢測陽性584例，陽性率分別為63.82%、72.37%。Xpert Mtb/RIF多標本聯(lián)合檢測及各標本單獨檢測的陽性率均高于MTB培養(yǎng)(P<0.05)。

MTB培養(yǎng)和Xpert Mtb/RIF多標本聯(lián)合檢測的陽性率均高于單一標本檢測，MTB培養(yǎng)和Xpert Mtb/RIF在肺泡灌洗液、痰標本、膿液和漿膜腔積液中檢測出MTB的陽性率不同，其中在肺泡灌洗液中檢測出MTB的陽性率最高，其次是膿液；第三是痰標本；最低的是漿膜腔積液，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同標本中MTB培養(yǎng)和Xpert Mtb/RIF檢測MTB的陽性率對比[n(%)]

2.2 Xpert Mtb/RIF在不同標本中檢測結核分枝桿菌利福平耐藥性的靈敏度和特異度對比

497例患者在痰標本、肺泡灌洗液、漿膜腔積液、膿液標本及多標本聯(lián)合中Xpert Mtb/RIF檢測利福平耐藥性的靈敏度、特異度分別為79.27%、72.11%；84.15%、80.08%；86.59%、86.06%；93.09%、83.27%；97.15%、85.26%，不同類型標本檢測結核分枝桿菌利福平耐藥性的靈敏度和特異度比較,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表2。

表2 Xpert Mtb/RIF在不同標本中檢測結核分枝桿菌利福平耐藥性的靈敏度和特異度對比[n(%)]

3 討論

抗結核治療的原則是盡早治療，制定合理的聯(lián)合用藥方案，并按制定的方案完成全部療程。臨床上，結核的治療主要以口服抗結核藥物為主，并輔助對癥治療及手術治療[7-8]。一般情況下，耐藥性肺結核患者由于體內(nèi)的結核分枝桿菌對一種或多種抗結核藥產(chǎn)生耐藥性，多為獲得性耐藥，此類患者的治療周期需更長時間，給家庭和社會帶來沉重負擔[9-10]。由于耐多藥結核病的篩查率低、發(fā)現(xiàn)率低、耐藥率高，而傳統(tǒng)的涂片抗酸染色法的檢測靈敏度較低，MTB培養(yǎng)法需獲取活菌培養(yǎng)2～6周，耗時較長。因此耐藥結核的規(guī)范治療關鍵是盡早診斷及進行藥敏試驗指導的個體化治療。

長期以來，肺結核的診斷以實驗室、影像學和病理學檢查為主，MTB培養(yǎng)陽性率亦相對較低[11-12]。本研究結果顯示，Xpert Mtb/RIF多標本聯(lián)合檢測及各標本單獨檢測的陽性率均高于MTB培養(yǎng)(P<0.05)，與既往研究[13]基本一致，證實Xpert Mtb/RIF檢測在早期診斷肺結核中的優(yōu)勢。Xpert Mtb/RIF檢測是近年來研發(fā)的一種分子生物學診斷技術，其可不受MTB影響，因此可將MTB及利福平耐藥檢測縮短至2 h，進而最大程度簡化MTB檢測[14]。已有大量研究就Xpert Mtb/RIF檢測在結核病診斷應用中的價值進行過評估，如熊夢園等[15]在2020年的一項研究中就指出，與涂片抗酸染色鏡檢等傳統(tǒng)方法相比，Xpert Mtb/RIF檢測技術的靈敏度、特異度更高，并且對結核桿菌利福平耐藥性的鑒定準確性高。盡管如此，Xpert Mtb/RIF檢測在利福平耐藥和結核分枝桿菌培養(yǎng)檢測中只有平均敏感度，標本類型對該技術的檢測效能的影響尚無定論[16]。

本研究結果顯示，Xpert Mtb/RIF在肺泡灌洗液、漿膜腔積液、膿液和痰標本這四種不同類型標本中的陽性率以肺泡灌洗液最高，其次為膿液；且以藥物敏感試驗為金標準，不同類型標本檢測結核分枝桿菌利福平耐藥性的靈敏度和特異度比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這提示臨床采用Xpert Mtb/RIF測定MTB陽性情況時收集不同類型的結核標本，將對肺結核的診斷大有裨益，對加快診斷速度亦有積極意義，其中以肺泡灌洗液的診斷價值最高。進一步分析其中的原因，肺泡灌洗液是利用纖維支氣管鏡對肺段和肺亞段灌洗后所采集的肺泡表面襯液[17-18]。肺泡灌洗液是距離肺結核患者發(fā)生炎癥或病變部位最近的標本，因此該標本獲得的陽性率遠高于痰標本和漿膜腔積液[19]。另外，在肺結核發(fā)病早期，由于MTB數(shù)量多，變態(tài)反應性較強，此時組織器官中的炎性介質(zhì)及蛋白質(zhì)因血管滲透性較高而滲出到血管外，故此時病變以滲出的膿液為主，收集患者膿液也有助于檢測MTB陽性情況[20-21]。同時，本研究結果顯示多標本聯(lián)合檢測的陽性率均高于單一標本檢測(P<0.05)，表明多標本聯(lián)合檢測可進一步提高患者早期診斷的陽性率。

綜上，GeneXpert Mtb/RIF檢測結核MTB均有較高的靈敏度，可作為檢測結核分枝桿菌的有效方法。聯(lián)合檢測多種標本，特別是肺泡灌洗液有助于提高Xpert Mtb/RIF診斷肺結核及利福平耐藥性的準確性。