夏 杰，趙 娜，王 璟，李百俠，徐 波*

（1.華東師范大學(xué) 體育與健康學(xué)院，上海 200241；2.華東師范大學(xué)“青少年健康評價與運動干預(yù)”教育部重點實驗室，上海 200241）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種起病隱襲、呈進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)退行性疾病，臨床特征主要為認(rèn)知障礙、精神行為異常和社會生活功能減退（中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會，2020）。2020年數(shù)據(jù)顯示，中國60歲及以上的人群中，AD患者達(dá)到983萬例，輕度認(rèn)知障礙患病高達(dá)3 877萬人（Jia et al.，2020）。然而目前臨床上尚缺乏對AD有效的治療藥物或手段，其發(fā)病機制和治療措施尚需進(jìn)一步探究。流行病學(xué)研究表明，運動可以降低老年人認(rèn)知能力下降和患老年癡呆癥的風(fēng)險（Hamer et al.，2018；Livingston et al.，2017）。然而，運動干預(yù)AD的作用機制尚不清楚。

近年來的研究認(rèn)為，AD屬于蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡的疾病，主要表現(xiàn)為蛋白質(zhì)錯誤折疊和異常蛋白質(zhì)清除途徑受 損（Boland et al.，2018；Hipp et al.，2019；Uddin et al.，2021）。和是AD發(fā)病的2個關(guān)鍵基因，的突變可能導(dǎo)致該基因在蛋白合成過程中錯誤折疊增加；突變可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡（Ryazantseva et al.，2018；Tong et al.，2016）。因此，和基因突變可能是導(dǎo)致AD腦內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡的關(guān)鍵。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是調(diào)控蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的重要細(xì)胞器，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊蛋白質(zhì)累積時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）被誘導(dǎo)并啟動未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR），通過抑制蛋白質(zhì)合成和促進(jìn)降解等途徑恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)（Hetz et al.，2017）。細(xì)胞自噬是神經(jīng)細(xì)胞UPR激活的主要降解途徑，該功能失調(diào)與AD發(fā)病密切相關(guān)（Nijholt et al.，2011）。蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinaselike endoplasmic reticulum kinase，PERK）/真核翻譯起 始 因 子 2α（eukaryotic translation initiation factor2α，eIF2α）是UPR中的關(guān)鍵信號，在AD病理機制中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，AD患者和動物模型腦內(nèi)存在ERS和PERK/eIF2α 過度激活（Murray et al.，2020；Oliveira et al.，2021）。進(jìn)一步研究認(rèn)為，AD腦內(nèi)表現(xiàn)為過度激活的PERK/eIF2α和無效的細(xì)胞自噬，這說明AD腦內(nèi)可能存在ERS-細(xì)胞自噬途徑異常（Cai et al.，2016a）。因此，靶向調(diào)節(jié)ERS和細(xì)胞自噬途徑可能是緩解AD病理的有效途徑。鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT）是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，在蛋白質(zhì)折疊和質(zhì)量控制發(fā)揮作用。近期研究顯示，CRT在ERS狀態(tài)下表達(dá)增加，并可通過與微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubule-associated proteins light chain 3，LC3）結(jié)合偶聯(lián)ERS與自噬，并認(rèn)為激活CRT-細(xì)胞自噬信號的藥理學(xué)或遺傳學(xué)方法可能具有調(diào)節(jié)ERS及其相關(guān)疾病的潛力（Yang et al.，2019）。研究已證實，AD 患者腦內(nèi) CRT的mRNA水平和蛋白水平均有所降低（Taguchi et al.，2000）；血清CRT水平可作為AD患者診斷的生物標(biāo)志物（Lin et al.，2014）。因此，本研究推測CRT介導(dǎo)的ERS-細(xì)胞自噬偶聯(lián)可能參與AD病理機制。

運動科學(xué)領(lǐng)域研究發(fā)現(xiàn)，運動可以緩解糖尿病小鼠、卒中大鼠和AD小鼠腦組織的ERS（Cai et al.，2016b；Hong et al.，2020；Li et al.，2021）。報道的一項研究發(fā)現(xiàn)，有氧運動誘導(dǎo)分泌的Irisin可以阻止Aβ寡聚體導(dǎo)致的ERS相關(guān)分子表達(dá)升高（Lourenco et al.，2019）。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，有氧跑臺運動可以緩解APP/PS1小鼠海馬的ERS、下調(diào)PERK/eIF2α信號和提高自噬活性（趙娜 等，2019；Xia et al.，2019）。這提示，運動可能調(diào)節(jié)AD模型小鼠腦內(nèi)ERS和細(xì)胞自噬。然而，ERS與細(xì)胞自噬在運動改善AD病理中的交互調(diào)控機制尚需深入探討。

基于此，本研究從ERS與細(xì)胞自噬偶聯(lián)的角度，探究3個月的中等強度有氧運動對APPswe/PS1dE9（APP/PS1）小鼠海馬Aβ病理、ERS、細(xì)胞自噬以及ERS-細(xì)胞自噬偶聯(lián)的影響，以闡明運動調(diào)節(jié)APP/PS1小鼠海馬ERS-細(xì)胞自噬偶聯(lián)機制。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物及分組

C57BL/6系的雄性 APPswe/PS1dE9（APP/PS1）轉(zhuǎn)基因小鼠及雄性野生型（Wild Type，WT）小鼠購自南京大學(xué)模式動物研究所。所有小鼠在控制溫度（22±2）℃、濕度50%±10%和12 h的明暗循環(huán)條件中飼養(yǎng)，自由攝取水和飼料。自3月齡開始，將APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠和WT小鼠分為4組：野生型對照組（WT-Sed，=11）、野生型運動組（WT-Exe，=11）、APP/PS1對照組（APP/PS1-Sed，=11）和APP/PS1運動組（APP/PS1-Exe，=11）。本實驗經(jīng)華東師范大學(xué)實驗動物保護(hù)與使用委員會批準(zhǔn)（m20190405）。

1.2 運動方案

1.3 取材

實驗干預(yù)結(jié)束后，每組取5只小鼠，進(jìn)行深度麻醉（i.p.10%水合氯醛，3.5 mL/kg體質(zhì)量），經(jīng)心臟灌注預(yù)冷的PBS，隨后取腦組織。將左側(cè)半腦的海馬組織取出，提取組織總RNA，用于Real-time PCR實驗。將右側(cè)半腦置于多聚甲醛（4%）中進(jìn)行固定，于次日進(jìn)行脫水、包埋、制成石蠟切片（4 μm），用于免疫組化和免疫熒光實驗。每組另取6只小鼠，經(jīng)深度麻醉后處死，剝離左右雙側(cè)海馬，提取組織總蛋白，用于Western blotting和Simple western實驗。

1.4 蛋白質(zhì)樣品制備

使用含有蛋白磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取海馬組織總蛋白。簡明操作步驟如下：將海馬組織（20 mg）裝入含有500 μLRIPA裂解液的勻漿管中，裝入3顆磁珠。以3.55 m/s的速度進(jìn)行勻漿，勻漿時間為30 s，重復(fù)3次。勻漿結(jié)束后，在4℃條件下以12 000 g的速度離心10 min，收集上清液。采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，收集的蛋白質(zhì)樣品用于Western blotting和Simple western實驗。

1.5 Western blotting

Western blotting按以下步驟進(jìn)行：將提取的蛋白質(zhì)樣品與5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液混合，使最終濃度為5 μg/μL。在95 ℃條件下變性5 min，制成Western blotting待測樣本。隨后依次進(jìn)行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗、顯影等步驟。最后采用FluorChem FC2軟件計算條帶的灰度值，以β-Actin為內(nèi)部參照，計算出目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。抗體信息如下：LC3（1∶1 000，Affinity，AF5402）、P62（1∶1 000，Affinity，AF5384）、β-Actin（1∶1 000，Affinity，T0022）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔（1∶3 000，Affinity，S0001）。

1.6 Simple western

Simple western實驗采用Wes全自動蛋白表達(dá)分析系統(tǒng)（ProteinSimple，美國）進(jìn)行。采用ProteinSimple公司提供的試劑盒（12-230kDa Wes Separation Module 8×25 capillary cartridges，SM-W004）和二抗（Anti-Rabbit Detection Module for Wes，DM001）完成實驗。簡明操作步驟如下：1）準(zhǔn)備蛋白質(zhì)樣品。將提取的蛋白質(zhì)樣本進(jìn)行BCA定量，將蛋白濃度稀釋為5 μg/μL。2）準(zhǔn)備Wes儀器并運行開機自檢程序。3）加樣。首先配置DTT、5×Master Mix（即Loading Buffer）、Ladder（即分子量標(biāo)準(zhǔn)品）、樣品（檢測常規(guī)蛋白和磷酸化蛋白的樣品終濃度分別為1.5 μg/μL和3 μg/μL）、抗體和發(fā)光液。開始加樣，從ProteinSimple試劑盒里取出微孔板，將配制好的試劑依次加入微孔板的A～F行。加樣完成后，蓋上微孔板蓋子，RT條件下2 500 r/min離心10 min，檢查并確認(rèn)微孔板的底部無氣泡。4）上機操作。打開軟件，按照說明書上的步驟設(shè)置運行參數(shù)。打開Wes儀的倉門，并將ProteinSimple試劑盒里的毛細(xì)管放入Wes儀器。將微孔板放入Wes儀器。關(guān)閉倉門，鎖止后點擊Start運行。5）運行結(jié)束和數(shù)據(jù)分析。運行結(jié)束后，依次完成檢查熒光內(nèi)參、Ladder、Sample，數(shù)據(jù)和圖片導(dǎo)出等步驟。6）目的蛋白相對表達(dá)量的計算。對于常規(guī)蛋白，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，計算目的蛋白的相對表達(dá)量。對于磷酸化蛋白，則以該蛋白的總蛋白為內(nèi)部參照，計算磷酸化蛋白的相對表達(dá)量。本實驗使用的抗體信息如下：PERK（1∶50，Affinity，AF5304） 、p-PERK（1∶ 100，Affinity，DF7576）、eIF2α（1∶50，Affinity，AF6087）、p-eIF2α（1∶50，Affinity，AF3087）、ATF4（1∶50，Affinity ，DF6008）、CRT（1∶50，Affinity，DF6211）、GAPDH（1∶150，Affinity，AF7021）。

1.7 Real-time PCR

使用Trizol試劑提取海馬組織總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用HieffqPCR SYBR Green Master Mix（Low Rox Plus）試劑盒（上海翊圣，11202ES03），按照 10 μL的 HieffqPCR SYBR Green Master Mix，7.6 μL蒸餾水，0.2 μL上游引物，0.2 μL下游引物，2 μL的cDNA樣本，配制20 μL的反應(yīng)體系。在QuantStudio3 and 5 Real-time PCR系統(tǒng)上完成檢測。根據(jù)檢測的Ct值，以為內(nèi)參基因，采用2的方法計算出目的基因mRNA相對表達(dá)量?；蛞镄蛄腥缦拢海‵：AATGTGTCCGTCGTGGATCTGA；R：AGTGTAGCCCAAGATGCCCTTC）、（F：AAGGTACAAGGGAGTGGGTG；R：ACCCGGAATACCCTAGACCT）、（F：AGGTAACCCAACGCCTTCTT；R：GAGACGAGAGCAAGGAATGG）、（F：GTCCCCAAGGAGGATGGTAT；R：ACCAAGCCCATCTCAACATC）、（F：AACATTCGTTGCCCAAACTC；R：TTTCATGCCCACAGTCACAT）、（F：CACCTGTGAGTGGGGCTAAT；R：CACCTTGACTGGTCCCTTGT）。

1.8 免疫組織化學(xué)實驗

1.8.1 Aβ染色

簡明步驟如下：1）脫蠟至水。2）抗原修復(fù)。使用檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液（pH：6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)。3）阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。在含有3%（HO）的0.1 mol/L Tris-HCl緩沖鹽水（pH：7.4）中處理10 min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性。4）BSA封閉。5）加一抗。一抗采用Anti-Aβ antibody（1∶1 000，Abcam，ab201060）。6）加二抗。采用HRP標(biāo)記的山羊抗兔（1∶200，Servicebio，GB23303）。7）DAB顯色。加入DAB顯色液并控制顯色時間，陽性為棕黃色。8）復(fù)染細(xì)胞核。蘇木素復(fù)染、分化、返藍(lán)。9）脫水封片。10）鏡檢。利用顯微鏡（Nikon，E100）和成像系統(tǒng)（Nikon，DS-U3）采集圖像。11）圖像分析。利用Image-Pro Plus 6.0（IPP 6.0）分析背側(cè)海馬齒狀回（Dentate gyrus，DG）的Aβ斑塊水平。

1.8.2 APP/GRP78、CRT/LC3免疫熒光雙重標(biāo)記

免疫熒光雙重標(biāo)記實驗采用TSA熒光雙重染色試劑盒（Servicebio，G1235-100T），按照說明書進(jìn)行。簡明步驟如下：1）脫蠟至水。2）抗原修復(fù)：EDTA抗原修復(fù)緩沖液（pH：8.0）進(jìn)行抗原修復(fù)，并微波爐加熱處理。3）畫圈標(biāo)記。4）滴加組織自發(fā)熒光淬滅劑（Servicebio，G1221）A液，室溫孵育30 min。5）阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：同步驟3。6）BSA封閉。7）一抗孵育：加入第一種一抗，Anti-GRP78 antibody（1∶50，Affinity，AF5366）、Anti-CRT antibody（1∶50，Affinity，DF6211），4 ℃孵育過夜。8）二抗孵育：HRP標(biāo)記的山羊抗兔（1∶200，Servicebio，GB23303），室溫孵育50 min。9）加TSA-FITC染色工作液，室溫避光孵育10 min。10）微波處理：使用EDTA抗原修復(fù)緩沖液（pH：8.0）進(jìn)行抗原修復(fù)，并進(jìn)行微波爐加熱處理。11）重復(fù)步驟7：加第二種一抗 ，Anti-APP antibody（1∶100，Affinity，AF7687）、Anti-LC3 antibody（1∶1 000，Affinity，AF5402），4℃孵育過夜。12）重復(fù)步驟8。13）滴加TSA-CY3染色工作液，室溫避光孵育10 min。14）細(xì)胞核復(fù)染：滴加DAPI染色液，室溫避光孵育10 min。15）組織自發(fā)熒光淬滅：加組織自發(fā)熒光淬滅劑B液，室溫孵育5 min。16）封片及鏡檢：滴加抗熒光淬滅封片劑封片。采用熒光顯微鏡（Nikon Eclipse C1）和成像系統(tǒng)（Nikon DS-U3）采集圖像。紫外激發(fā)下DAPI發(fā)藍(lán)光，F(xiàn)ITC發(fā)綠光，CY3發(fā)紅光。17）圖像分析。利用Image-Pro Plus6.0軟件分析背側(cè)海馬DG區(qū)分子層（molecular layer，ML）APP與GRP78、CRT與LC3的熒光強度及共定位水平（Pearson’s correlation coefficient）。

1.9 生物信息學(xué)分析

利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫iLIR Autophagy Database（Kalvari et al.，2014）（https：//ilir.warwick.ac.uk/）對 CRT 蛋白序列進(jìn)行分析，根據(jù)CRT蛋白序列中是否具有LIR motif（LC3結(jié)合區(qū)域）來預(yù)測該蛋白能否介導(dǎo)自噬。具體方法如下，利用 UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）查詢CRT的蛋白序列，將獲得的CRT蛋白序列（FASTA格式）輸入iLIR數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行LC3結(jié)合區(qū)域分析。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用雙因素方差分析，以基因和運動作為兩個因素，多重比較采用Bonferroni法。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（±）形式呈現(xiàn)，統(tǒng)計學(xué)意義設(shè)為＜0.05或＜0.01。

2 實驗結(jié)果

2.1 運動對小鼠海馬Aβ斑塊水平的影響

采用免疫組化檢測各組小鼠海馬組織Aβ斑塊水平，并利用IPP 6.0軟件對Aβ染色進(jìn)行光密度分析。結(jié)果如圖1所示，與WT-Sed組相比，APP/PS1-Sed組小鼠海馬Aβ斑塊水平顯著升高（＜0.01）。與APP/PS1-Sed組相比，APP/PS1-Exe組小鼠海馬Aβ斑塊水平顯著降低（＜0.05）。

圖1 APP/PS1轉(zhuǎn)基因和運動對小鼠海馬Aβ斑塊水平的影響Figure 1.Effects of APP/PS1 Transgene and Exercise on Aβ Plaque in Mice Hippocampus

2.2 運動對小鼠海馬APP/GRP78共定位水平的影響

采用免疫熒光技術(shù)對海馬組織APP和GRP78進(jìn)行免疫熒光染色，如圖2A所示，熒光顯微鏡視野中的紅色熒光為APP，綠色熒光為GRP78，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核。采用IPP 6.0軟件對各組小鼠海馬DG區(qū)APP/GRP78共定位水平、APP和GRP78的平均熒光強度進(jìn)行分析。與WT-Sed組相比，APP/PS1-Sed組小鼠海馬DG區(qū)APP/GRP78共定位水平顯著升高（＜0.01，圖 2B）、APP（＜0.05，圖2C）和GRP78（＜0.01，圖2D）的平均熒光強度顯著增加；APP/PS1-Exe組小鼠海馬DG區(qū)APP/GRP78共定位水平顯著升高（＜0.05，圖2B）。與APP/PS1-Sed組相比，APP/PS1-Exe組小鼠海馬DG區(qū)APP/GRP78共定位水平顯著降低（＜0.01，圖2B），GRP78的平均熒光強度顯著減少（＜0.05，圖2D）。

圖2 各組小鼠海馬APP和GRP78免疫熒光分析Figure 2.Immunofluorescence Analysis of APP and GRP78 in Mice Hippocampus

2.3 運動對小鼠海馬PERK/eIF2α信號通路的影響

采用Simple western技術(shù)對小鼠海馬組織PERK/eIF2α信號通路蛋白進(jìn)行定量分析。如圖3所示，與WT-Sed組相比，APP/PS1-Sed組小鼠海馬p-PERK（＜0.05，圖3A、D）和 p-eIF2α（＜0.01，圖3B、D）的蛋白水平顯著升高。與APP/PS1-Sed組相比，APP/PS1-Exe組小鼠海馬p-PERK（＜0.05，圖3A、D）和p-eIF2α（＜0.01，圖3B、D）的蛋白水平顯著降低。與WT-Sed組相比，APP/PS1-Sed組小鼠海馬ATF4的蛋白水平顯著升高（＜0.01，圖3C、D）。與APP/PS1-Sed組相比，APP/PS1-Exe組小鼠海馬ATF4的蛋白水平顯著降低（＜0.01，圖3C、D）。

圖3 APP/PS1轉(zhuǎn)基因和運動對小鼠海馬PERK/eIF2α信號通路的影響Figure 3.Effects of APP/PS1 Transgene and Exercise on Hippocampal PERK/eIF2α Signaling in Mice

2.4 運動對小鼠海馬自噬相關(guān)分子表達(dá)的影響

采用Real-time PCR檢測了自噬相關(guān)基因的和的mRNA水平。如圖4A～D所示，與WT-Sed組相比，WT-Exe組小鼠海馬的mRNA水平顯著升高（＜0.01，圖4B），的mRNA水平顯著降低（＜0.05，圖4C）；APP/PS1-Sed組小鼠海馬（＜0.05，圖4A）和（＜0.01，圖4C）的 mRNA水平顯著降低，的mRNA水平顯著升高（＜0.05，圖4D）；APP/PS1-Exe組的mRNA水平顯著降低（＜0.01，圖4C），的 mRNA 水平顯著升高（＜0.01，圖4D）。與WT-Exe組相比，APP/PS1-Exe組小鼠海馬（＜0.01，圖4A）和（＜0.01，圖4B）的mRNA水平顯著降低，的mRNA水平顯著升高（＜0.01，圖4D）。與APP/PS1-Sed組相比，APP/PS1-Exe組小鼠海馬的mRNA水平顯著升高（＜0.01，圖4D）。

圖4 APP/PS1轉(zhuǎn)基因和運動對小鼠海馬細(xì)胞自噬的影響Figure 4.Effects of APP/PS1 Transgene and Exercise on Autophagy in Mice Hippocampus

采用Western blotting技術(shù)檢測了小鼠海馬LC3和P62的蛋白水平。如圖4E、F所示，與WT-Sed組相比，APP/PS1-Sed組小鼠海馬LC3Ⅱ（＜0.05，圖4E）和P62（＜0.05，圖4F）的蛋白水平顯著升高。與APP/PS1-Sed組相比，APP/PS1-Exe組小鼠海馬P62的蛋白水平顯著降低（＜0.05，圖4F）。

2.5 運動對小鼠海馬CRT介導(dǎo)的ERS-細(xì)胞自噬偶聯(lián)的影響

采用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫iLIR web server對CRT蛋白序列進(jìn)行分析，如圖5A所示，CRT蛋白序列的結(jié)合域（Pfam）存在LC3結(jié)合區(qū)，說明CRT可能介導(dǎo)細(xì)胞自噬。采用Real-time PCR技術(shù)和Simple western技術(shù)檢測海馬組織CRT的表達(dá)。如圖5B、C所示，與WT-Sed組相比，APP/PS1-Sed組小鼠海馬的mRNA水平（＜0.01，圖5B）和蛋白水平（＜0.01，圖5C）均顯著降低。與WT-Exe組相比，APP/PS1-Exe組小鼠海馬的mRNA水平顯著降低（＜0.05，圖5B），而CRT的蛋白水平顯著升高（＜0.05，圖5C）。與APP/PS1-Sed組相比，APP/PS1-Exe組小鼠海馬CRT的蛋白水平顯著升高（＜0.05，圖5C）。

圖5 各組小鼠海馬CRT和LC3免疫熒光分析Figure 5.Immunofluorescence Analysis of CRT and LC3 in Hippocampus of Mice

采用免疫熒光技術(shù)對海馬組織CRT和LC3進(jìn)行熒光染色，如圖5D所示，熒光顯微鏡視野中觀察到的綠色熒光為CRT，紅色熒光為LC3，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核。采用IPP 6.0軟件對各組小鼠海馬DG區(qū)CRT/LC3共定位水平、CRT和LC3的平均熒光強度進(jìn)行分析。分析結(jié)果顯示，與WT-Sed組相比，APP/PS1-Sed組小鼠海馬DG區(qū)CRT的平均熒光強度顯著減少（＜0.01，圖5F），LC3的平均熒光強度顯著增加（＜0.01，圖5G）；APP/PS1-Exe組小鼠海馬DG區(qū)LC3的平均熒光強度顯著增加（＜0.01，圖5G）。與APP/PS1-Sed組相比，APP/PS1-Exe組小鼠海馬DG區(qū)CRT的平均熒光強度顯著增加（＜0.01，圖5F）。

3 分析與討論

3.1 跑臺運動減少APP/PS1小鼠海馬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)APP積累

瑞典突變型（APPswe）和基因 dE9突變（PS1dE9）是家族性AD中篩選出的2個突變基因。然而，和基因突變導(dǎo)致的AD病理發(fā)生機制目前尚不明確。因此，本研究采用表達(dá)APPswe和PS1dE9的雙轉(zhuǎn)基因小鼠探究AD的發(fā)病機制，并在此基礎(chǔ)上探究運動干預(yù)的效果和分子機制。以往研究表明，APP/PS1小鼠自3月齡開始，Aβ生成逐漸增加，至6月齡時期已經(jīng)形成Aβ斑塊，并表現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知缺陷（Zhou et al.，2020）。本研究發(fā)現(xiàn)，APP/PS1轉(zhuǎn)基因?qū)е滦∈笤?月齡時期表現(xiàn)出海馬Aβ斑塊顯著增加，而跑臺運動可以顯著降低APP/PS1小鼠海馬Aβ斑塊水平。因此，3個月的跑臺運動可以預(yù)防APP/PS1轉(zhuǎn)基因所誘導(dǎo)的AD標(biāo)志性病理。

鑒于APP和PS1可定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，基因突變可以破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，而的突變可以引起其在合成過程中錯誤折疊的增加（Ryazantseva et al.，2018；Tong et al.，2016）。因此，和基因突變導(dǎo)致的AD病理可能與ERS有關(guān)。GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的伴侶分子，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊蛋白質(zhì)增加，GRP78則合成增加并與錯誤折疊蛋白質(zhì)結(jié)合，因此GRP78也是反映ERS的標(biāo)志分子。有研究顯示，在ERS狀態(tài)下，GPR78可以與APP結(jié)合并將錯誤折疊的APP滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，進(jìn)而促進(jìn)APP在分泌途徑早期在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)積累（Kudo et al.，2006）。因此，本研究推測，APP/PS1轉(zhuǎn)基因可能會導(dǎo)致APP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累并導(dǎo)致ERS。為了驗證這一假設(shè)，本研究采用免疫熒光染色檢測了小鼠海馬APP與GRP78的共定位水平和熒光強度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織中APP和GRP78的熒光強度以及APP/GRP78的共定位水平增加。與本研究結(jié)果一致，Li等（2019）在APP/PS1小鼠海馬組織中觀察到APP和GRP78蛋白水平的一致上調(diào)。Plácido等（2015）對大鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞（RBE4）進(jìn)行ERS誘導(dǎo)劑處理，發(fā)現(xiàn)RBE4中APP和GRP78蛋白水平，以及APP/GRP78共定位水平均提高。這提示，在本研究中，APP/PS1轉(zhuǎn)基因可能增加了APP在小鼠海馬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的錯誤折疊，并導(dǎo)致ERS水平的升高。

研究表明，在轉(zhuǎn)染APP突變的HEK293和COS7細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中APP的滯留與Aβ生成增加有關(guān)（Nishitsuji et al.，2009）。這提示，APP/PS1轉(zhuǎn)基因引起的Aβ生成增加可能與APP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的滯留有關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，運動可以減少APP/PS1轉(zhuǎn)基因?qū)е碌男∈蠛ｑRAβ生成增加（Yu et al.，2021；Zhang et al.，2022）。另有研究發(fā)現(xiàn)，游泳運動可以下調(diào)Aβ注射誘導(dǎo)的GRP78表達(dá)上調(diào)（劉濤，2012）。而本研究發(fā)現(xiàn)，跑臺運動降低了APP/PS1小鼠海馬GRP78的表達(dá)和APP/GRP78共定位水平，并減少了Aβ斑塊水平。這提示，運動可減少APP/PS1小鼠海馬Aβ生成，可能與APP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的積累減少有關(guān)。

3.2 跑臺運動抑制APP/PS1小鼠海馬PERK/eIF2α過度激活和細(xì)胞自噬異常

PERK/eIF2α是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中緩解ERS的關(guān)鍵信號，然而該信號在AD患者腦內(nèi)過度激活（Murray et al.，2020）。本研究在APP/PS1小鼠海馬中發(fā)現(xiàn)p-PERK和p-eIF2α水平增加，這說明PERK/eIF2α通路過度激活與AD的發(fā)病機制有關(guān)。與本研究一致，Wu等（2021）在APP/PS1小鼠腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)PERK/eIF2α信號通路的過度激活。然而，本研究發(fā)現(xiàn)跑臺運動降低了APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬p-PERK和p-eIF2α 的蛋白水平，提示運動可能抑制了 PERK/eIF2α 信號通路的過度激活。以往研究顯示，12周的自主跑輪運動可抑制PS2突變小鼠海馬PERK/eIF2α過度激活介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡（Kang et al.，2013）。抑制PERK信號通路還參與了運動對卒中小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用（Li et al.，2021）。課題組前期研究顯示，跑臺運動抑制APP的淀粉樣蛋白生 成途徑與 PERK/eIF2α 信 號 的下調(diào)有關(guān)（Xia et al.，2019）。因此，抑制PERK/eIF2α信號通路過度激活可能是運動預(yù)防AD的潛在作用途徑。

研究發(fā)現(xiàn)，PERK/eIF2α信號通路可以調(diào)控細(xì)胞自噬，PERK/eIF2α的下游分子ATF4和CHOP可介導(dǎo)自噬基因轉(zhuǎn)錄，如和（B’Chir et al.，2013）。本研究發(fā)現(xiàn)APP/PS1小鼠海馬組織PERK/eIF2α信號和表達(dá)上調(diào)，因此本研究進(jìn)一步檢測了自噬相關(guān)基因和的表達(dá)。其中，編碼的蛋白質(zhì)Beclin1是自噬的成核因子，調(diào)控自噬的啟動。ATG7是一種泛素E1樣酶，調(diào)控ATG5與ATG12的共價結(jié)合，三者主要參與自噬體的形成。本研究發(fā)現(xiàn)，APP/PS1轉(zhuǎn)基因可以下調(diào)小鼠海馬組織和的mRNA水平，上調(diào)的mRNA水平，說明APP/PS1轉(zhuǎn)基因可能影響了自噬的啟動和自噬體的形成。與本研究一致，Panagaki等（2018）發(fā)現(xiàn)，APP/PS1小鼠海馬 Beclin1和ATG7表達(dá)下調(diào)；Mohammadi等（2016）在Aβ誘導(dǎo)的AD大鼠海馬中發(fā)現(xiàn)ATG12的表達(dá)升高。和是PERK/eIF2α信號的下游靶分子，本研究發(fā)現(xiàn)，伴隨著PERK/eIF2α激活，APP/PS1小鼠海馬中只有表達(dá)上調(diào)。因此，表達(dá)升高可能是AD病理狀態(tài)下UPR過度激活的結(jié)果。而本研究發(fā)現(xiàn)，跑臺運動下調(diào)APP/PS1小鼠海馬PERK/eIF2α信號的同時，卻上調(diào)了的表達(dá)。造成這一結(jié)果的原因可能是，跑臺運動增強了APP/PS1小鼠海馬的自噬活性，提高了自噬效率，因而出現(xiàn)的代償性升高。為了驗證這一假設(shè)，本研究進(jìn)一步檢測了自噬效率的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，APP/PS1小鼠海馬LC3Ⅱ的蛋白水平升高，P62的蛋白水平降低。值得注意的是，以往研究發(fā)現(xiàn)，PERK誘導(dǎo)的eIF2α磷酸化可以導(dǎo)致 ATG12 依賴的 LC3I向 LC3II的轉(zhuǎn)化（Kouroku et al.，2007）。而本研究發(fā)現(xiàn)，伴隨著PERK/eIF2α信號的激活，APP/PS1小鼠海馬LC3Ⅱ表達(dá)升高，P62表達(dá)下調(diào)，說明PERK/eIF2α雖然激活了自噬，但自噬的效率并未提高。這些結(jié)果支持了Cai等（2016b）的觀點，即AD腦內(nèi)可能存在過度激活的UPR和無效的細(xì)胞自噬。近期研究發(fā)現(xiàn)，采用藥理學(xué)手段下調(diào)APP/PS1小鼠皮質(zhì)UPR后，自噬效率增加（Guo et al.，2018）。藥理性下調(diào)ERS可以逆轉(zhuǎn)APP/PS1小鼠腦內(nèi)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)抑制，進(jìn)而減少Aβ負(fù)荷（Panagaki et al.，2018）。這提示，靶向調(diào)節(jié)ERS和細(xì)胞自噬途徑可能有助于緩解Aβ病理。關(guān)于運動的研究表明，跑臺運動可以提高APP/PS1小鼠海馬細(xì)胞自噬活性，并降低Aβ水平（Zhao et al.，2018）。本研究發(fā)現(xiàn)，跑臺運動下調(diào)了APP/PS1小鼠海馬P62的蛋白水平，說明跑臺運動提高了小鼠海馬細(xì)胞自噬活性。而伴隨著細(xì)胞自噬活性的提高，跑臺運動還下調(diào)了PERK/eIF2α信號。這提示，ERS-細(xì)胞自噬途徑可能參與了AD的運動干預(yù)機制。

綜上，APP/PS1轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)小鼠海馬PERK/eIF2α過度激活，自噬相關(guān)基因表達(dá)異常，自噬效率降低；而跑臺運動可以下調(diào)APP/PS1小鼠海馬PERK/eIF2α信號，并提高自噬活性，證實了AD海馬內(nèi)存在ERS-細(xì)胞自噬途徑異常，而運動可改善AD海馬ERS-細(xì)胞自噬途徑的異常。

3.3 跑臺運動上調(diào)APP/PS1小鼠海馬CRT介導(dǎo)的ERS-細(xì)胞自噬偶聯(lián)

以往研究發(fā)現(xiàn)，ERS誘導(dǎo)劑可以激活細(xì)胞自噬，錯誤折疊蛋白質(zhì)聚集可通過PERK/eIF2α通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca失衡也參與誘導(dǎo)細(xì)胞自噬（Fedeli et al.，2019；Ogata et al.，2006）。然而，ERS究竟是如何偶聯(lián)細(xì)胞自噬目前尚不完全清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，在APP/PS1小鼠海馬組織中，UPR激活后細(xì)胞自噬雖然被啟動，但自噬效率并未提高；并且，運動雖然抑制了APP/PS1小鼠海馬UPR，但提高了自噬活性。這說明，在AD病理狀態(tài)下，ERS與細(xì)胞自噬之間存在復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系。最近研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的CRT可偶聯(lián)ERS和細(xì)胞自噬，在ERS狀態(tài)下，CRT受UPR的誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，高表達(dá)的CRT通過與LC3結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，從而降解累積的異常折疊蛋白（Yang et al.，2019）。這提示，激活CRT介導(dǎo)的ERS-細(xì)胞自噬偶聯(lián)可能具有緩解AD腦內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡的潛力。

通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CRT蛋白序列的結(jié)合域（Pfam）存在LC3結(jié)合區(qū)，說明CRT具有介導(dǎo)細(xì)胞自噬的潛在可能?；谠撋镄畔W(xué)預(yù)測，本研究首先采用Realtime PCR和Simple western技術(shù)檢測了小鼠海馬CRT的表達(dá)。結(jié)果顯示，APP/PS1小鼠海馬的mRNA水平和蛋白水平均出現(xiàn)下調(diào)，而運動可以上調(diào)APP/PS1小鼠海馬CRT的蛋白水平。隨后，本研究采用免疫熒光技術(shù)，檢測了CRT與LC3的共定位情況和表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，APP/PS1轉(zhuǎn)基因并未影響小鼠海馬CRT/LC3共定位水平，跑臺運動也未引起APP/PS1小鼠海馬CRT/LC3共定位水平的變化。但在分子表達(dá)水平上，APP/PS1小鼠海馬中伴隨著LC3表達(dá)上調(diào)，CRT表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)。運動雖沒有影響APP/PS1小鼠海馬LC3的表達(dá)，但上調(diào)了CRT的表達(dá)。因此，本研究推測，在PERK/eIF2α過度激活狀態(tài)下，APP/PS1小鼠海馬自噬活性降低可能與CRT的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。而在運動干預(yù)下，APP/PS1小鼠海馬自噬活性增加可能與CRT的水平上調(diào)有關(guān)。支持這一推測的證據(jù)如下：1）生物信息學(xué)預(yù)測，CRT可能介導(dǎo)細(xì)胞自噬；2）Yang等（2019）通過免疫共沉淀實驗確定了CRT與LC3相互作用的位點，并在誘導(dǎo)ERS的條件下發(fā)現(xiàn)CRT與LC3的相互作用增強，在Yang等（2019）的研究中，過表達(dá)CRT可促進(jìn)使細(xì)胞自噬水平并緩解ERS，而敲減CRT則導(dǎo)致ERS條件下自噬受損；3）AD患者腦內(nèi)存在自噬異常也存在CRT表達(dá)下調(diào)（Hubbard et al.，2022；Taguchi et al.，2000），而本研究發(fā)現(xiàn)運動可以上調(diào)CRT的表達(dá)并提高自噬活性。綜上，CRT可能是運動提高細(xì)胞自噬的效應(yīng)因子，其可能通過介導(dǎo)ERS-細(xì)胞自噬偶聯(lián)，促進(jìn)AD腦內(nèi)錯誤折疊蛋白質(zhì)清除。

4 結(jié)論

和突變可能破環(huán)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，增加APP錯誤折疊和Aβ聚集，誘發(fā)ERS并導(dǎo)致PERK/eIF2α過度激活，從而降低自噬效率，抑制AD腦內(nèi)異常蛋白質(zhì)的清除。跑臺運動可以預(yù)防和基因突變導(dǎo)致的AD病理，其生物學(xué)機制可能與ERS-細(xì)胞自噬偶聯(lián)有關(guān)（圖6），即跑臺運動可以降低Aβ斑塊水平，減少APP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累，緩解ERS并抑制PERK/eIF2α過度激活，進(jìn)而提高細(xì)胞自噬活性并上調(diào)CRT介導(dǎo)的ERS-細(xì)胞自噬偶聯(lián)，從而有益于減少AD腦內(nèi)錯誤折疊蛋白質(zhì)的生成和聚集。

圖6 運動調(diào)控ERS-細(xì)胞自噬偶聯(lián)緩解AD病理的可能機制Figure 6.Possible Mechanism of Exercise Alleviating AD Pathology by Regulating ERS-autophagy Coupling