鄒曉悅，劉 佳，李志勇，馬繼芳，王永芳，全建章，劉 磊，白 輝，董志平

(1.河北省農林科學院 谷子研究所，國家谷子改良中心，河北省雜糧重點實驗室，河北 石家莊 050035；2.河北師范大學 生命科學學院，河北 石家莊 050024)

bHLH(Basic helix-loop-helix)家族是真核生物中最廣泛的一類轉錄因子，也是植物中僅次于MYB轉錄因子的第二大類轉錄因子，它可以通過與靶基因中的特定基序相互作用來調節(jié)基因表達，在植物生長發(fā)育以及應對逆境脅迫中發(fā)揮重要作用[1]。

已有研究表明，bHLH轉錄因子對于調控植物器官的生長發(fā)育、根毛和表皮毛的發(fā)育都起到重要作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，bHLH轉錄因子SPEECHLESS(SPCH)、MUTE和FAMA在氣孔發(fā)育過程中起不同作用，該基因的任何突變都會導致氣孔發(fā)育不當[3]。水稻中的bHLH轉錄因子LAX在莖尖分生組織和新分生組織形成區(qū)域之間的邊界表達，是腋芽原基形成的主要調節(jié)因子[4]。擬南芥中，GL3編碼的bHLH蛋白參與根毛的發(fā)育過程，過表達玉米的轉錄因子ZmbHLH4有利于促進種子萌發(fā)[5-6]?？梢?，bHLH轉錄因子參與了植物的多種生長發(fā)育過程。

bHLH轉錄因子在應對植物干旱、鹽、寒冷、缺鐵等逆境脅迫方面均有重要作用[7]。目前，對bHLH轉錄因子參與植物逆境脅迫的研究較多，如在水稻、小麥和玉米等主要作物中都鑒定到許多 bHLH轉錄因子參與了對非生物脅迫的響應[8]。此外，bHLH轉錄因子還參與了植物對生物脅迫的響應。擬南芥中，bHLH轉錄因子基因FAMA功能缺失導致灰霉菌(B.cinerea)的易感性增加，而過表達則對病原菌的抗性增加，證明FAMA基因有利于提高擬南芥對病原菌灰霉菌的抗病性[9]。水稻中，OsbHLH6在稻瘟病菌侵染過程中上調表達，并通過動態(tài)調節(jié)水楊酸(Salicylic acid，SA)和 茉莉酸(Jasmonic acid，JA)之間的拮抗來調控水稻的抗病性[10]。此外，有研究在甘蔗、大豆、黃瓜、棉花等作物中也分別鑒定到SsbHLH03/04/27/36/37、GmPIB1、CsIVP、GhbHLH171等bHLH轉錄因子，它們在植物與病原物互作過程中起正調控作用[11-14]。

谷子(Setariaitalica)是我國重要的雜糧作物，抗旱耐瘠、營養(yǎng)豐富、適應性強。由粟單胞銹菌(Uromycessetariae-italicae)引起的谷子銹病是世界范圍內谷子最重要的病害之一，該病害可在短期內流行，造成大量減產[15]。生產上選育抗病品種是防治谷銹病經濟有效的方法，但是抗銹品種因谷銹病原菌生理小種的變異會喪失抗病性。所以，解析抗銹病相關基因，對于抗銹機理的深入了解、抗銹品種的培育與抗病品種使用年限的延長具有重要意義。Wang等[16]對谷子中bHLH轉錄因子家族與谷子干旱脅迫的潛在相關性進行了研究，Bai等[17]發(fā)現(xiàn)，bHLH轉錄因子PPLS1調控谷子葉枕葉鞘的顏色，但是關于bHLH轉錄因子參與谷子抗病過程的研究，目前尚未見報道。

河北省農林科學院谷子研究所植保室前期對谷子銹菌侵染抗病、感病谷子材料的葉片組織進行了比較轉錄組分析，篩選出差異表達上調基因SibHLH19，本研究以SibHLH19基因作為研究對象，克隆獲得了SibHLH19CDS全長序列和啟動子序列，對其生物學特征通過生物信息學軟件進行了分析，采用Real-time PCR技術檢測了SibHLH19基因在谷子不同組織以及谷銹菌侵染過程中的表達模式，并檢測了該基因的原核表達水平，旨在為深入研究SibHLH19基因在谷子抗銹病過程中的功能提供科學參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及試劑

試驗所用材料為谷子抗銹病材料十里香和感銹病材料豫谷1號，供試菌株為粟單胞銹菌強毒性小種A57的單孢菌系93-5，均由河北省農林科學院谷子研究所植保室保存。經多年鑒定，十里香(SLX)和豫谷1號(YG1)對谷銹菌單孢菌系93-5的侵染分別表現(xiàn)抗病和感病。

2×Phanta Flash Master Mix(Dye Plus)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司、RNA Easy Fast植物組織RNA快速提取試劑盒(RNA Easy Fast Plant Tissue Kit)購自天根生化科技(北京)有限公司、FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒(FastKing RT Kit With gDNase)購自天根生化科技(北京)有限公司；pMD19-T載體、TB GreenTMPremix EX TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)購自TaKaRa；引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗材料處理 采集豫谷1號苗期地上部分、地下部分以及孕穗期的根、莖、葉、穗6個部位樣品，液氮速凍樣品后-80 ℃冰箱保存。選取生長21 d長勢一致的十里香和豫谷1號幼苗，采用新鮮谷銹菌單孢菌系93-5制備的孢子懸浮液(濃度為1.0×105個/mL)對葉片進行噴霧接種，分別于接種后0，8，12，16，24 h共5個時間點剪取葉樣，液氮速凍樣品后-80 ℃冰箱保存。

1.2.2SibHLH19全長CDS序列克隆 通過谷子豫谷1號參考基因組(https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/info/Sitalica_v2_2)獲得SibHLH19(Seita.2G277700)的全長編碼序列(Coding sequence，CDS)，利用Primer Premier 5.0設計特異性引物，見表1。以谷子銹菌處理后的十里香葉片cDNA為模板，用2×Phanta Flash Master Mix(Dye Plus)進行PCR擴增。50 μL PCR反應體系：2×Phanta Flash Master Mix(Dye Plus)25 μL、100 ng/μL模板DNA 2 μL、10 μmol/L上、下游引物各2 μL、滅菌ddH2O 19 μL。PCR擴增程序：98 ℃預變性30 s；98 ℃變性10 s，56 ℃退火5 s，72 ℃延伸5 s，35個循環(huán)反應；最后72 ℃再延伸1 min。

電泳檢測切膠回收的產物與pMD19-T載體連接，連接產物轉化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆進行測序。

1.2.3SibHLH19啟動子序列克隆與啟動子順式作用元件分析 根據(jù)谷子豫谷1號參考基因組序列，選擇SibHLH19起始密碼子上游2 000 bp序列作為候選啟動子，設計特異性引物，見表1。以十里香基因組DNA為模板，利用2×Phanta Flash Master Mix(Dye Plus)進行PCR擴增，PCR反應體系見1.2.2。PCR擴增程序：98 ℃預變性30 s；98 ℃變性10 s，56 ℃退火5 s，72 ℃延伸15 s，35個循環(huán)反應；最后72 ℃再延伸1 min。

利用PlantCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)數(shù)據(jù)庫對SibHLH19啟動子序列進行順式作用元件分析。

1.2.4 谷子SibHLH19蛋白生物信息學分析 通過谷子豫谷1號參考基因組獲得SibHLH19的蛋白質序列，參考宋振君等[18]的方法對其進行蛋白質結構域預測、理化性質分析、蛋白質二級結構預測、蛋白質三級結構預測、蛋白質序列比對生物信息學分析，選擇相似性程度最高的來自9個物種的bHLH19同源基因的蛋白質序列，利用ClustalX 2.0進行多重序列比對，利用MEGA 7以鄰近法(Bootstrap設為1 000)構建系統(tǒng)進化樹，分析其親緣關系的遠近。

1.2.5 谷子中SibHLH19的實時熒光定量PCR檢測與分析 采用RNA Easy Fast植物組織RNA快速提取試劑盒提取不同處理谷子樣品的總RNA，反轉錄獲得cDNA作為Real-time PCR的模板。選用谷子肌動蛋白基因Act2作為內參基因。Real-time PCR反應參考白輝等[19]的方法(表達倍數(shù)的閾值設定為>1.5，<0.67)，使用SPSS 26.0進行顯著性分析。用于Real-time PCR的引物信息見表1。

1.2.6 原核表達載體的構建與誘導表達 將帶有KpnⅠ和Hind Ⅲ酶切位點的SibHLH19PCR擴增產物與KpnⅠ和Hind Ⅲ雙酶切的pET30a載體進行瓊脂糖凝膠回收、連接、轉化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆進行測序驗證。將測序正確的重組質粒pET30a-SibHLH19轉化大腸桿菌BL21(DE3)。之后參考白輝等[19]的方法加入0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)誘導蛋白表達并獲得樣品，隨后用SDS-PAGE分離檢測。

2 結果與分析

2.1 SibHLH19基因CDS全長序列和啟動子序列的克隆及分析

克隆所得SibHLH19基因CDS序列全長為843 bp，編碼氨基酸為280個(圖1-A、B)，與谷子豫谷1號參考基因組注釋基因Seita.2G277700序列完全一致。氨基酸序列分析表明，SibHLH19編碼蛋白具有bHLH轉錄因子的保守DNA結合結構域，位于116—165氨基酸，包括2個高度保守且功能不同的區(qū)域：氨基末端可以將 DNA 與具有保守六核苷酸序列的E 盒 (CANNTG)結合，羧基末端是 HLH 區(qū)域，能夠與其他蛋白質相互作用形成同源和異源二聚體。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

克隆得到SibHLH19基因啟動子序列，測序比對發(fā)現(xiàn)，其與谷子豫谷1號參考基因組序列一致(圖1-C)。對啟動子序列進行順式作用元件分析表明，該啟動子區(qū)域除了具有CAAT-box、TATA-box保守元件外，還具有9種37個與激素、脅迫等相關的重要順式作用元件(表2)，其包括脫落酸應答元件(ABRE)，茉莉酸甲酯應答元件(CGTCA-motif、 TGACG-motif)，脫水、低溫、鹽脅迫應答元件(DRE)，干旱脅迫應答元件(MBS)，厭氧脅迫響應元件(ARE)，光響應元件(Box4、BoxⅡ、GATA-motif、G-box)以及與分生組織表達相關的應答元件(CAT-box)。

A.SibHLH19 CDS的PCR擴增；B.SibHLH19的氨基酸序列(下劃線代表SibHLH19蛋白的保守結構域)；C.SibHLH19啟動子的PCR擴增；M.DNA分子量標準DL2000。A.PCR amplification of SibHLH19 CDS；B.The amino acid sequences of SibHLH19(The underline represents the conservative domain of SibHLH19 protein)；C.PCR amplification of SibHLH19 promoter；M.DNA molecular weight standard DL2000.

表2 SibHLH19啟動子部分順式作用元件Tab.2 Partial cis-acting elements of SibHLH19 promoter

2.2SibHLH19基因的生物信息學分析

2.2.1SibHLH19編碼蛋白質的理化性質 為分析SibHLH19編碼蛋白質的理化性質，利用ExPASy-ProtParam tool對其進行預測，發(fā)現(xiàn)蛋白質分子質量為29.97 ku，理論等電點pI為5.85，編碼蛋白質化學式為C1296H2071N397O400S11，屬于不穩(wěn)定親水性蛋白質：脂肪指數(shù)為79.39，不穩(wěn)定指數(shù)為67.10，平均親水性系數(shù)為-0.392。SibHLH19基因編碼的280個氨基酸中，帶負電荷氨基酸(天冬氨酸Asp+谷氨酸Glu)有36個，帶正電荷氨基酸(精氨酸Arg+賴氨酸Lys)30個，丙氨酸Ala含量最高(14.3%)，色氨酸Trp含量最低(0.7%)。

2.2.2SibHLH19編碼蛋白質的二級、三級結構預測 為分析SibHLH19編碼蛋白質的結構，分別利用SOPMA和SWISS-MODEL軟件對其進行二級、三級結構預測(圖2-A、B)，發(fā)現(xiàn)該蛋白的二級結構中最大結構元件是無規(guī)則卷曲(Random coil)占48.93%，最小的元件為β-轉角(Beta turn)占1.79%，另外α-螺旋(Alpha helix)占41.79%、延伸鏈(Extended strand)占7.50%。對其二級和三級結構預測結果進行比對表明結果較為一致。

A.二級結構；B.三級結構。A.Secondary structure；B.Tertiary structure.

2.2.3SibHLH19編碼蛋白質的同源性分析 通過在NCBI上進行Protein Blast比對，結果顯示，SibHLH19編碼的氨基酸序列屬于bHLH家族中的MYC2轉錄因子。按照序列相似性程度選擇了來自糜子(Panicummiliaceum)、哈氏黍(Panicumhallii)、柳枝稷(Panicumvirgatum)、玉米(Zeamays)、高粱(Sorghumbicolor)、小麥(Triticumaestivum)、節(jié)節(jié)麥(Aegilopstauschiisubsp.strangulata)、南荻(Miscanthuslutarioriparius)和硬粒小麥(Triticumturgidumsubsp.durum)中的SibHLH19同源基因的蛋白質序列構建系統(tǒng)進化樹，結果表明(圖3)，SibHLH19與禾本科植物糜子(RLM85279.1)、哈氏黍(PUZ71581.1)和柳枝稷(XP_039835205.1)氨基酸序列的同源性較高，與小麥(KAF7059972.1)、節(jié)節(jié)麥(XP_040244423.1)同源性最低。

圖3 SibHLH19的系統(tǒng)進化樹分析Fig.3 The phylogenetic tree analysis of SibHLH19

2.3SibHLH19基因的組織表達分析

為了解谷子不同組織部位中SibHLH19基因的表達情況，對該基因在谷子豫谷1號苗期地上部分(SD-shoot)、地下部分(SD-root)以及孕穗期根(BT-root)、莖(BT-stem)、葉(BT-leaf)和穗(BT-panicle)6個部位的表達量利用Real-time PCR技術進行了檢測，結果如圖4所示，SibHLH19主要在谷子苗期表達，孕穗期幾乎無表達。其中，SibHLH19在苗期地上部分的表達量是地下部分的2.29倍。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖5同。Different lowercase indicate significant difference at 0.05 level.The same asFig.5.

2.4 生物脅迫下SibHLH19基因的表達分析

對SibHLH19基因在谷子抗病材料十里香和感病材料豫谷1號葉片接種谷銹菌以及十里香葉片接種水作對照的0，8，12，16，24 h共5個時間點的表達情況利用Real-time PCR技術進行檢測分析。結果如圖5所示，SibHLH19在抗病和感病材料中的表達模式不同。谷銹菌侵染處理后，SibHLH19基因在抗病材料十里香中從8 h開始上調表達并達到峰值，16 h繼續(xù)上調表達，分別是0 h表達量的14.8，11.0 倍；而在感病材料豫谷1號中，16 h表達量是0 h表達量的2.15倍，略微上調表達，其余時間點都表現(xiàn)下調表達。在谷銹菌侵染處理的8，16 h，SibHLH19基因在十里香中的表達量顯著高于在對照及豫谷1號中的表達量(P<0.05)，分別為對照表達量的17.0，3.6倍、為感病材料表達量的89.3，5.1倍。在谷銹菌侵染處理的12 h，SibHLH19基因在十里香中的表達量顯著高于在對照及在豫谷1號中的表達量(P<0.05)，分別為對照和感病材料表達量的10.4，2.7倍。相比感病材料可見，SibHLH19基因在抗病材料中表現(xiàn)出更早、更劇烈、更持久的誘導表達，推測SibHLH19基因可能正調控谷子早期抗病反應。

圖5 SibHLH19在抗、感反應中不同時間點的表達模式分析Fig.5 Relative expression of SibHLH19 after inoculation with Uromyces setariae-italicae in resistance material SLX and susceptible material YG1

2.5 SibHLH19基因的原核表達分析

SibHLH19原核表達的SDS-PAGE結果表明(圖6)，較未被IPTG誘導的對照相比，由0.1 mmol/L的IPTG誘導1 h出現(xiàn)明顯的特異表達條帶，表觀分子質量約為44 ku，該條帶的強度隨誘導時間延長而明顯增強。結果表明，SibHLH19能夠在大腸桿菌BL21中本底表達，而且能被較低濃度的IPTG成功誘導表達。

M.蛋白分子量標準；1—6.IPTG誘導0，1，2，4，6，8 h。M.Protein molecular weight Marker；1—6.IPTG induced 0，1，2，4，6，8 h，respectively.

3 結論與討論

真核基因表達是一個復雜的過程，既受內源信號調控也受外源信號調控，如表觀調控、轉錄調控、RNA加工調控、翻譯調控等[20]。通過對抗病谷子十里香的CDS與啟動子序列進行克隆，進而將其與感病谷子豫谷1號序列進行對比，結果發(fā)現(xiàn)，抗、感病谷子的CDS序列與啟動子序列完全一致。SibHLH19基因在抗、感銹病谷子中基因表達的不同可能不是由啟動子以及編碼序列引起，增強子等其他順式作用元件以及環(huán)境因素和上下游基因的相互作用均可以引起基因表達的變化，需要進一步深入研究。

已有大量研究表明，bHLH家族的MYC2基因可以參與調節(jié)植物的種子、根、葉片等的生長發(fā)育，在植物發(fā)育過程中對光的質量以及波長等具有很高的敏感性，光在植物發(fā)育的早期階段具有重要作用，而植物對光信號的接收與調節(jié)需要一系列的轉錄因子參與[21]。香鱗毛蕨中DfMYC2基因在葉片中表達量最高，在根中表達量最低，在北柴胡中組織特異性分析發(fā)現(xiàn)，MYC2在莖、葉中表達量較高，在根中表達量最低[22-23]。本研究通過Real-time PCR技術，分析了SibHLH19基因在谷子豫谷1號不同發(fā)育時期的6個部位的表達情況，結果表明，該基因主要在苗期表達，苗期地上部分表達量最高，在孕穗期幾乎不表達，可見在不同的植物中，MYC2表達的部位及時期有所不同。研究報道，一組Z-box結合轉錄因子MYC2、GBF1和CAM7在擬南芥幼苗期光形態(tài)發(fā)生中起著至關重要的作用[24]，對基因的啟動子順式作用元件進行分析同樣得到啟動子中存在多個光響應元件以及與分生組織表達相關的應答元件，所以推測SibHLH19基因可能在豫谷1號幼苗時期通過調節(jié)整合光信號進而調節(jié)谷子幼苗發(fā)育。

已有報道，MYC2轉錄因子介導植物抗生物脅迫過程，并且在多種植物中對其進行了研究[25]。使用煙草抗性品種 Beinhart 1000-1 和易感品種 K326 研究了與抗褐斑病相關的生理和轉錄特征，結果發(fā)現(xiàn)，當褐斑病菌侵染的時候，抗病與感病品種相比，抗病品種中的MYC2基因的表達水平遠高于感病品種[26]。在楊樹中同樣發(fā)現(xiàn)，當潰瘍病菌入侵時，抗病品種中MYC2基因表達量遠高于感病品種[27]。本研究利用Real-time PCR技術檢測了SibHLH19基因在谷子響應谷銹菌生物脅迫下不同時間點的表達水平，結果顯示，抗病材料十里香和感病材料豫谷1號在谷銹菌侵染后SibHLH19呈現(xiàn)出不同的表達模式。較感病反應，抗病反應中SibHLH19基因的表達表現(xiàn)出上調表達時間早、上調幅度強、持續(xù)時間長的特點，而感病反應和十里香對照中，SibHLH19基因僅在16 h表現(xiàn)出低水平的上調表達，其他時間點均表現(xiàn)出不同程度的下調表達，說明SibHLH19基因是谷子抗病材料十里香在抗谷銹菌侵染的生物脅迫過程中被特異誘導表達的。本研究結果與前人試驗結果一致。在水稻中研究發(fā)現(xiàn)，過表達OsMYC2基因會提高對白葉枯病的抗性，大規(guī)模微陣列分析還發(fā)現(xiàn)，OsMYC2上調OsJAZ10以及許多其他防御相關基因的表達，認為OsMYC2作為正調控因子防御水稻白葉枯病[28]。據(jù)本研究結果推測，SibHLH19基因也是抗銹病反應相關的正調控因子。

在擬南芥以及水稻等植物中，關于MYC2對植物防御的作用機制主要與茉莉酸(JA)信號通路有關。在禾本科單子葉作物水稻中，Ogawa等[29]利用OsMYC2基因敲除植物(osmyc2RNAi)進行RNA測序，對JA合成及信號傳導相關基因的研究發(fā)現(xiàn)，許多由JA誘導的防御相關基因，例如幾丁質酶、β-1，3-葡聚糖酶、泛素連接酶以及蛋白酶抑制劑相關基因的表達受到抑制[29]。JA合成途徑以及信號傳導關鍵基因如編碼丙二烯氧化合酶的OsAOS1和編碼丙二烯氧化環(huán)化酶的OsAOC等同樣受到OsMYC2的調控，除此之外，許多依賴JA誘導產生的防御相關代謝物也明顯減少，說明OsMYC2介導JA誘導的防御反應，通過JA途徑參與對水稻防御反應的調節(jié)控制[30]。谷子同樣為禾本科單子葉作物，防御谷銹病過程中SibHLH19轉錄因子基因的作用機理，需要進一步研究，而JA信號途徑則可能作為分析研究的切入點。并且通過基因啟動子順式作用元件分析得到啟動子區(qū)存在多個MeJA應答元件，所以進一步說明SibHLH19轉錄因子與JA相互聯(lián)系。通過啟動子分析發(fā)現(xiàn)，在啟動子區(qū)還存在脫水、低溫、鹽脅迫，干旱以及厭氧脅迫相關應答元件，推測SibHLH19基因在谷子應對逆境脅迫方面可能也發(fā)揮著一定作用。

原核表達結果表明，SibHLH19融合蛋白雖然有本底水平的表達，但是在0.1 mmol/L IPTG處理1 h即可顯著地被誘導表達，SDS-PAGE分離檢測的表觀分子質量為44 ku，比預測分子質量30 ku略大，可能與表達載體pET30a上SibHLH19插入位點上游表達的38個氨基酸殘基(4.2 ku)以及蛋白修飾造成不同折疊構象有關，所以推測表達的此蛋白條帶是SibHLH19表達的融合蛋白，為SibHLH19抗體制備以及基因功能研究提供抗原基礎。本次試驗結果為進一步研究SibHLH19基因功能與抗病機制奠定了理論基礎。