李 楠 張香飛 楊春杰

板棗，別名稷山板棗，是一種藥食兼用果品，主要分布于山西省稷山縣，為山西十大名棗之一。板棗果肉厚，肉質(zhì)致密，甜味濃，汁液較少，多以干制為主，除基本營養(yǎng)物質(zhì)還含有維生素、糖類、黃酮、多酚、腺苷類、皂甙類等多種植物化學(xué)成分[1-3]。

多糖是一類由至少10個(gè)單糖縮合而成的高分子物質(zhì)，具有良好的抗氧化、抗腫瘤、降血糖、免疫調(diào)節(jié)及促進(jìn)腸道健康等生物活性[4-5]。研究[6]發(fā)現(xiàn)，多糖的生物功能與其單糖組成、分子量、鏈鏈相互作用和糖苷鍵構(gòu)象等密切相關(guān)。目前有關(guān)板棗多糖的研究主要集中在測(cè)定其多糖含量、優(yōu)化其提取工藝上，王小媛等[7]以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，通過苯酚—硫酸法測(cè)定不同產(chǎn)地紅棗的多糖含量，結(jié)果顯示稷山板棗多糖含量為25.53 g/100 g ·DW；楊萍芳等[8]采用酶法提取稷山板棗多糖，得出酶解溫度55 ℃，酶解時(shí)間80 min，纖維素酶添加量0.05%時(shí)，多糖得率為3.61%。然而，有關(guān)板棗多糖的理化性質(zhì)、單糖組成，光譜學(xué)性質(zhì)，抗氧化活性等研究較少。

研究擬以板棗為原料，采用水提醇沉、脫蛋白、脫色等方法制備板棗多糖，測(cè)定其多糖理化參數(shù)，利用離子色譜分析其單糖組成，結(jié)合紫外和紅外光譜分析多糖的初級(jí)結(jié)構(gòu)特征，并測(cè)定多糖的抗氧化活性，以期為進(jìn)一步研究板棗多糖結(jié)構(gòu)與其功能活性的關(guān)系及天然抗氧化劑的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

板棗：采摘于山西省運(yùn)城市稷山縣；

氫氧化鈉、葡萄糖、抗壞血酸、三氯乙酸、無水乙醇、丙酮、考馬斯亮蘭G250：分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；

30%過氧化氫、硫酸、苯酚、硫酸亞鐵、水楊酸、過硫酸鉀、四硼酸鈉(硼砂)、乙二胺四乙酸(EDTA)、三氯化鐵、碳酸氫鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉：分析純，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；

ABTS(2,2-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽)、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、3-羥基聯(lián)苯、牛血清白蛋白：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；

1-萘酚、D-半乳糖醛酸、透析袋(截留分子量：3 500)：索萊寶化學(xué)試劑有限公司；

單糖標(biāo)準(zhǔn)品：色譜純，美國Sigma公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

傅立葉紅外光譜儀：TENSOR 27型，Bruker公司；

雙光束紫外可見分光光度計(jì)：UV-9000S型，上海元析儀器有限公司；

離子色譜：ICS5000型，賽默飛世爾科技公司；

低速臺(tái)式離心機(jī)：TD6M型，湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；

冷凍干燥機(jī)：SCIENTZ-10N型，寧波新芝生物有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 板棗多糖提取 將板棗去核，60 ℃烘干、粉碎，用石油醚浸泡12 h脫脂，干燥后得脫脂棗粉；然后參照王曉琴等[9]的方法制備板棗粗多糖。配置10 mg/mL的粗多糖溶液，按體積比1∶1加入10%三氯乙酸溶液，振搖30 min 后，冰箱靜置12 h， 4 000 r/min離心15 min，取上清液12 mL，用6 mol/L氨水調(diào)節(jié)pH至9，然后加入30%的過氧化氫1 mL，45 ℃脫色2 h，直至溶液顏色澄清透明[10]；將脫色后的溶液透析3 d，冷凍干燥得板棗多糖。

1.3.2 多糖理化指標(biāo)測(cè)定

(1) 溶解性：分別稱取0.5 g多糖放入水、無水乙醇、正丁醇、丙酮、乙酸乙酯中，攪拌，觀察多糖的溶解性。

(2) 酯化度：采用化學(xué)滴定法[11]。

(3) 顏色反應(yīng)：碘—碘化鉀反應(yīng)、三氯化鐵反應(yīng)和斐林試劑反應(yīng)參照戴艷[12]的方法；Molish反應(yīng)參照王曉琴等[9]的方法；茚三酮反應(yīng)：取1 mg/mL多糖溶液1 mL，加入茚三酮溶液0.5 mL，沸水浴10 min，觀察有無藍(lán)紫色化合物生成。

(4) 總糖含量：采用苯酚硫酸法[13]。

(5) 蛋白質(zhì)含量：采用考馬斯亮藍(lán)法[14]。

(6) 糖醛酸含量：分別移取100 μg/mL半乳糖醛酸溶液 0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 mL于25 mL比色管中，用蒸餾水補(bǔ)加至1.0 mL。冰水浴冷卻后，加入0.012 5 mol/L四硼酸鈉—硫酸溶液5 mL，混勻，沸水浴加熱5 min，冰水浴冷卻后，加入100 μL 0.15%間羥基聯(lián)苯溶液，混勻，靜置5 min，測(cè)定524 nm處吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]。

取質(zhì)量濃度為50 μg/mL的稷山板棗多糖溶液1 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法操作，進(jìn)行3次平行測(cè)定，結(jié)果取平均值，代入回歸方程求出樣品液中半乳糖醛酸的含量，按式(1)計(jì)算樣品中糖醛酸含量。

(1)

式中：

D——樣品中糖醛酸含量，%；

m——樣品中半乳糖醛酸質(zhì)量，μg；

W——樣品的質(zhì)量，μg。

1.3.3 紫外和紅外光譜分析 配制1 mg/mL的多糖溶液，以蒸餾水為空白對(duì)照，在200～800 nm內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，觀察多糖溶液在260 nm和280 nm處有無核酸和蛋白質(zhì)吸收峰。取1 mg多糖與100 mg KBr，研磨均勻，壓片，在4 000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描[15]。

1.3.4 單糖組成分析 單糖組成測(cè)定參照Wang等[6]的方法并做修改，稱量多糖樣品(5±0.05) mg，加入2 mol/L三氟乙酸溶液1 mL，105 ℃加熱6 h；氮?dú)獯蹈桑患尤爰状记逑?，再吹干，重?fù)2次；加入無菌水溶解，轉(zhuǎn)入色譜瓶中待測(cè)。離子色譜參數(shù)：Dionex CarboPac PA10(250 mm×4.0 mm，10 μm)液相色譜柱，電化學(xué)檢測(cè)器；流動(dòng)相A為0.1 mol/L NaOH，流動(dòng)相B為0.1 mol/L NaOH、0.2 mol/L CH3COONa溶液，進(jìn)樣量5 μL，流速0.5 mL/min，柱溫30 ℃；梯度洗脫條件：0 min，95%A；30 min，80%A；30.1～45 min，60% A；45.1～60 min，95% A。

1.3.5 抗氧化活性分析

(1) DPPH自由基(DPPH·)清除能力：分別取質(zhì)量濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL的多糖溶液2.0 mL，加入2 mL 0.08 mmol/L的DPPH乙醇溶液，混勻，25 ℃避光反應(yīng)30 min，測(cè)定517 nm處吸光度[16]。VC作陽性對(duì)照。按式(2)計(jì)算DPPH·清除率。

(2)

式中：

WDPPH·——DPPH·清除率，%；

Ai，517 nm——測(cè)定管吸光度；

Aj，517 nm——乙醇代替DPPH溶液的本底吸光度；

A空白，517 nm——蒸餾水代替樣品的空白吸光度。

(2) 羥自由基(·OH)清除能力：參照教小磐等[16]的方法， VC作為陽性對(duì)照。

(3) ABTS自由基(ABTS+·)清除能力：ABTS+·工作液的配制方法參照李楠等[17]的方法。分別取0.2 mL 質(zhì)量濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL的多糖溶液，加入4 mL 7 mol/L ABTS+·工作液，混勻，常溫避光反應(yīng)6 min，測(cè)定734 nm處吸光度[18]。VC為陽性對(duì)照。按式(3)計(jì)算ABTS+·清除率。

(3)

式中：

WABTS+·——ABTS+·清除率，%；

Ai，734 nm——測(cè)定管吸光度；

Aj，734 nm——蒸餾水代替ABTS+·溶液的本底吸光度；

A空白，734 nm——蒸餾水代替樣品的空白吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶解度、酯化度、顏色反應(yīng)

多糖不溶于有機(jī)溶劑，如乙醇、正丁醇、丙酮、乙酸乙酯等，難溶于冷水，易溶于常溫水和熱水。化學(xué)滴定法測(cè)定其酯化度為64.7%，說明板棗多糖是一種酸性果膠多糖，另外Zhao等[19]測(cè)定河北冬棗多糖的酯化度為49%，王曉琴等[9]測(cè)定陜西木棗粗多糖的酯化度為38.4%，因此多糖酯化度不僅受到棗果實(shí)品種差異的影響，還可能與產(chǎn)地、生長氣候、多糖提取方式等因素有關(guān)。碘—碘化鉀反應(yīng)陰性，Molish反應(yīng)陽性，說明板棗多糖不屬于淀粉型多糖[20]。三氯化鐵反應(yīng)、茚三酮反應(yīng)均為陰性，說明板棗多糖不含酚羥基和氨基酸。斐林試劑反應(yīng)陰性，溶液為淺藍(lán)色無磚紅色沉淀，說明板棗多糖無還原糖存在。

2.2 總糖、蛋白質(zhì)和糖醛酸含量

經(jīng)測(cè)定，板棗多糖的總糖含量為52.30%，蛋白質(zhì)含量為0.90%。由圖1可知，半乳糖醛酸在質(zhì)量濃度0～80 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系較好，多糖中糖醛酸含量較高，為46.22%。綜上，板棗多糖是一種果膠多糖。

2.3 光譜分析

2.3.1 紫外光譜分析 由圖2可知，板棗多糖在260 nm處無吸收峰，說明其不含核酸；在280 nm處有較弱的蛋白質(zhì)吸收峰，與多糖中蛋白質(zhì)含量為0.90%的測(cè)定結(jié)果相符合，說明多糖中幾乎不含蛋白質(zhì)。

2.4 單糖組成分析

圖4為單糖標(biāo)準(zhǔn)品和多糖樣品的離子色譜圖。根據(jù)單糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間確定板棗多糖中單糖的種類，利用不同濃度單糖標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品峰面積確定單糖含量。由表1可知，半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖在板棗多糖中含量較高，葡萄糖、鼠李糖、木糖和甘露糖含量次之，還有較低含量的葡萄糖醛酸、巖藻糖和鹽酸氨基葡萄糖，說明板棗多糖是一類組成復(fù)雜的雜多糖，與袁月鵬[23]的研究結(jié)果一致。板棗多糖中半乳糖醛酸含量較高，為141.96 μg/mg，推測(cè)其為果膠多糖，Chang等[24]對(duì)臺(tái)灣大棗粗多糖的單糖組成進(jìn)行了分析，結(jié)果為粗多糖中半乳糖醛酸含量占比70.8%，二者研究結(jié)果一致。有研究[25]表明，糖醛酸含量高的多糖其生物活性會(huì)更強(qiáng)，因?yàn)樘侨┧釟埢梢允苟嗵腔瘜W(xué)特性和溶解性發(fā)生改變。板棗多糖含有較高的糖醛酸，因此其生物活性可能較高。

圖1 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of galacturonic acid

圖2 板棗多糖紫外光譜圖Figure 2 UV spectra of polysaccharide from Z. jujuba cv. Banzao

圖3 板棗多糖紅外光譜圖Figure 3 FT-IR spectrum of polysaccharide from Z. jujuba cv. Banzao

1. 巖藻糖 2. D-氨基半乳糖鹽酸鹽 3. 鼠李糖 4. 阿拉伯糖 5. 鹽酸氨基葡萄糖 6. 半乳糖 7. 葡萄糖 8. 木糖 9. 甘露糖 10. 果糖 11. 核糖 12. 半乳糖醛酸 13. 古羅糖醛酸 14. 葡萄糖醛酸 15. 甘露糖醛酸圖4 單糖混標(biāo)和多糖的離子色譜圖Figure 4 Ion chromatograms of standard monosaccharide mixture and the polysaccharide

2.5 抗氧化活性分析

由圖5可知，板棗多糖可以清除DPPH·、·OH和ABTS+·，且成劑量依賴性。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度相同時(shí)，對(duì)自由基清除率大小為： DPPH·>·OH> ABTS+·。

當(dāng)板棗多糖質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率為23.64%，而王曉琴等[9]的研究結(jié)果表明，1.0 mg/mL 的木棗多糖對(duì)DPPH·的清除率小于20%，原因可能是板棗多糖含有較多的半乳糖醛酸，高含量的半乳糖醛酸有助于提高多糖的抗氧化活性[25]。

當(dāng)質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，板棗多糖對(duì)·OH清除率為21.01%，而0.05 mg/mL的 VC對(duì)·OH的清除率為18.28%，所以板棗多糖有較強(qiáng)的·OH清除能力，可以通過加大多糖劑量達(dá)到與VC對(duì)·OH的清除能力。

當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，對(duì)ABTS+·的清除率為13.84%，低于0.02 mg/mL的VC對(duì)ABTS+·的清除率(20.28%)。因此，板棗多糖對(duì)ABTS+·的清除能力相對(duì)較弱。板棗多糖對(duì)不同自由基的清除能力不同，可能與多糖的單糖組成、結(jié)構(gòu)及分子量大小有關(guān)。

表1 板棗多糖中單糖種類及含量Table 1 Types and contents of monosaccharide in from polysaccharide of Z. jujube cv. Banzaoμg/mg

圖5 多糖對(duì)自由基的清除能力Figure 5 The free-radical scavenging activity of polysaccharide

圖6 抗壞血酸(VC)對(duì)自由基的清除能力Figure 6 The free-radical scavenging activity of VC

3 結(jié)論

以稷山板棗為原料，經(jīng)水提醇沉、脫蛋白、脫色得到板棗多糖，經(jīng)測(cè)定，板棗多糖總糖含量52.30%，糖醛酸含量46.22%，酯化度為64.7%，說明板棗多糖是一種酸性果膠多糖。多糖用三氟乙酸水解后進(jìn)行離子色譜測(cè)定，得知板棗多糖是一類組成復(fù)雜的雜多糖，其主要單糖組成為半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖和甘露糖，其中半乳糖醛酸含量最高，為141.96 μg/mg。傅里葉變換紅外光譜顯示，板棗多糖具有多糖的特征吸收峰，是含有α-糖苷鍵的吡喃糖?？寡趸钚越Y(jié)果表明，板棗多糖可以清除DPPH自由基、羥自由基和ABTS自由基且呈劑量依賴性。后續(xù)將進(jìn)一步評(píng)價(jià)板棗多糖的體內(nèi)抗氧化活性并深入研究其構(gòu)效關(guān)系及抗氧化活性作用機(jī)制。