張 杰 張文剛 黨 斌 楊希娟,*

(1 青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海 西寧 810016；2 青海省農(nóng)林科學(xué)院，青海省青藏高原農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016；3 青藏高原種質(zhì)資源研究與利用實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

我國(guó)青藏高原地區(qū)是青稞的起源中心之一，富含多種黑青稞資源[1-3]。黑青稞具有高的膳食纖維、蛋白質(zhì)、維生素及β-葡聚糖含量[4-5]，同時(shí)必需氨基酸、微量元素及花青素類物質(zhì)的含量[6-7]也普遍高于普通大麥。

目前針對(duì)青稞的研究大多集中在不同品種青稞籽粒營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)評(píng)價(jià)、活性成分提取工藝優(yōu)化、活性成分組成分析及功能活性研究等方面，而關(guān)于青稞發(fā)酵研究的相關(guān)報(bào)道較少，且主要以青稞酒[8-9]、青稞面制品[10]、青稞酸奶[11]、青稞甜醅[12]為主。而在黑青稞的加工利用研究中也大多以常規(guī)青稞加工方式為主，產(chǎn)品種類較為單一。甜醅是一種以青稞或燕麥為原料，經(jīng)米根霉發(fā)酵制成的風(fēng)味食品[13]，由于其作為一種地方特色小吃，其發(fā)酵工藝參數(shù)大多以經(jīng)驗(yàn)為主，導(dǎo)致甜醅產(chǎn)品穩(wěn)定性差、營(yíng)養(yǎng)功能成分不明確、風(fēng)味及口感不理想，嚴(yán)重影響了青稞甜醅產(chǎn)品的消費(fèi)。因此，將黑青稞作為發(fā)酵原料，明確其最佳發(fā)酵工藝，不僅可為甜醅產(chǎn)品提供更多的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，同時(shí)可為其穩(wěn)定性及安全性提供保障，有利于黑青稞的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

青海省青藏高原農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)米根霉發(fā)酵制備的黑青稞制品風(fēng)味不理想，而酵母菌J7發(fā)酵的黑青稞制品具有較好的風(fēng)味，但其發(fā)酵不徹底、青稞基料利用率低。有關(guān)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)混菌發(fā)酵具有一定優(yōu)勢(shì)，如Chen等[14]采用霉菌和酵母進(jìn)行混合發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)混合發(fā)酵后得到的黃酒呈現(xiàn)較濃的花香、酒香、曲香和米香，且風(fēng)味化合物的總濃度優(yōu)于市售黃酒；Ong等[15]以豆渣和啤酒糟為基料，比較米曲霉和枯草芽孢桿菌的單一發(fā)酵和混合發(fā)酵對(duì)基料的影響，結(jié)果表明混合發(fā)酵的豆渣產(chǎn)生總酚含量最高，且能夠顯著增加底物的營(yíng)養(yǎng)成分?；谀壳扒囡瘐嬖诘膯?wèn)題及混菌發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用潛力，本研究選擇混菌發(fā)酵方式，在提高其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的同時(shí)改進(jìn)其風(fēng)味，增加其功能成分，旨在為開(kāi)發(fā)新的具有特殊風(fēng)味的甜醅產(chǎn)品，提高黑青稞的高附加值和利用率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酵母菌J7，由青海省青藏高原農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離西藏靈菇乳得到，經(jīng)鑒定為單胞釀酒酵母菌；米根霉發(fā)酵劑，湖北安琪酵母股份有限公司；黑青稞昆侖16號(hào)，由青海省農(nóng)林科學(xué)院作物育種栽培研究所提供；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(100 mg)，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

pHS-3C型精密酸度計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司；Retavapor R-215 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士布奇有限公司；N4S 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；SW-CJ-2型雙人凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；TGL-20 M 型高速冷凍離心機(jī)，湖南長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化 參照何國(guó)慶[16]的方法。用接種環(huán)挑取酵母菌J7斜面培養(yǎng)物兩環(huán)于裝有100 mL的酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基(yeast extact peptone dextrose, YEPD)的三角瓶中，在28℃下培養(yǎng)48 h進(jìn)行活化，活化3次。

1.3.2 黑青稞發(fā)酵工藝流程[17]黑青稞挑選、去雜→清洗→浸泡→瀝干→蒸煮→冷卻→接菌→發(fā)酵→成品。

將發(fā)酵后的黑青稞樣品進(jìn)行冷凍干燥并粉碎，過(guò)60目篩網(wǎng)備用。

1.3.3 黑青稞混菌固態(tài)發(fā)酵單因素試驗(yàn) 取昆侖16號(hào)青稞，在浸泡時(shí)間24 h、常壓蒸煮30 min、酵母J7與米根霉比例1∶1(v∶m)、接種量5%、發(fā)酵溫度28℃、發(fā)酵時(shí)間48 h的恒定條件下，分別考察發(fā)酵溫度(20、24、28、32、36和40℃)、發(fā)酵時(shí)間(12、24、36、48、60和72 h)、接種量(1%、3%、5%、7%、9%)及酵母J7與米根霉比例(5∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶5)對(duì)黑青稞發(fā)酵物pH值及氨基酸態(tài)氮含量的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，以發(fā)酵溫度、酵母J7和米根霉比例、接種量為顯著影響因素，以氨基酸態(tài)氮含量為響應(yīng)值設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Coded values and corresponding actual values of independent variables used for Box-Behnken design

1.3.5 理化指標(biāo)測(cè)定 氨基酸態(tài)氮含量測(cè)定采用甲醛滴定法[18]；總酚含量測(cè)定采用Folin-Ciocalteu法；黃酮含量測(cè)定采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法；DPPH自由基清除活性參照楊希娟等[19]的方法進(jìn)行測(cè)定；風(fēng)味物質(zhì)參照文獻(xiàn)[20]用氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)檢測(cè)法分析。色譜系統(tǒng)采用 GC-MS QP2020，色譜柱型號(hào)為SH-Rxi-5 Sil MS。色譜條件：DB-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度250℃；載氣He，流速1.0 mL·min-1，不分流；升溫程序：始溫40℃保持2 min，以1℃·min-1升溫至100℃，再以4.5℃·min-1升至240℃，保持4 min。質(zhì)譜條件：EI電離源，能量70 eV；離子源溫度230℃，四級(jí)桿溫度150℃，掃描范圍(45～650)m/z。

1.3.6 感官評(píng)分 參照文獻(xiàn)[21]的方法，以混菌發(fā)酵得到的黑青稞制品的外觀、香氣、口感、質(zhì)地為評(píng)定指標(biāo)，組織9名(4男5女)經(jīng)過(guò)基礎(chǔ)培訓(xùn)的人員對(duì)其進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，取平均值，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 黑青稞發(fā)酵制品感官品質(zhì)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[21]Table 2 Sensory evaluation standard of sweet fermented black highland barley[21]

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示；采用 Design-Expert 8.06、SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P<0.05表示顯著，P<0.01表示極顯著。所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 混菌發(fā)酵最佳工藝的確定

2.1.1 不同接種量對(duì)混菌發(fā)酵黑青稞制品的影響 由圖1可知，隨著接種量的增加，黑青稞發(fā)酵物的氨基酸態(tài)氮含量及感官評(píng)分均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)接種量為5%時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分最高，分別為10.48 mg·100 g-1和84.44分。這主要是由于米根霉在發(fā)酵過(guò)程中自身會(huì)代謝蛋白酶系，從而降解黑青稞的蛋白質(zhì)，其中一部分氮源供微生物利用，而另一部分則分解成為游離氨基酸[17]，使得氨基酸態(tài)氮含量增加。同時(shí)，接種量過(guò)低時(shí)，黑青稞發(fā)酵物表現(xiàn)出發(fā)酵不徹底，發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)地較硬、香氣不足、口味較淡的特點(diǎn)，這與Paranthaman等[22]的研究結(jié)果一致。

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different letters indicate significant difference at 0.05 level. The same as following.圖1 不同接種量對(duì)混菌發(fā)酵黑青稞氨基酸態(tài)含量及感官評(píng)分的影響Fig.1 Effect of inoculums amount on the content of amnio acid nitrogen and sensory score of mixed bacteria fermented black hulless barley

2.1.2 不同發(fā)酵溫度對(duì)混菌發(fā)酵黑青稞制品的影響 由圖2可知，隨著發(fā)酵溫度的不斷升高，混菌型黑青稞發(fā)酵制品的氨基酸態(tài)氮含量及感官評(píng)分均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵溫度為32℃時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量最高，達(dá)到8.58 mg·100 g-1，此時(shí)感官評(píng)分也最高，達(dá)到83.56分，混菌型黑青稞制品表現(xiàn)出濃郁的發(fā)酵香味、口感較為適宜。這可能是由于所選取的米根霉和酵母菌適宜發(fā)酵溫度在32℃左右，在該溫度下更利于菌株的生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物的形成，發(fā)酵物風(fēng)味不斷積累，發(fā)酵較為徹底，感官品質(zhì)增加，同時(shí)微生物生長(zhǎng)旺盛，蛋白酶不斷產(chǎn)生，從而使氨基酸態(tài)氮含量增加。

圖2 不同發(fā)酵溫度對(duì)混菌發(fā)酵黑青稞氨基酸態(tài)含量及感官評(píng)分的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on the content of amnio acid nitrogen and sensory score of mixed bacteria fermented black hulless barley

2.1.3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)混菌發(fā)酵黑青稞制品的影響 由圖3可知，氨基酸態(tài)氮含量在0～48 h內(nèi)隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而逐漸增加，且不同發(fā)酵時(shí)間下均存在顯著性差異；在48～72 h氨基酸態(tài)氮含量趨于穩(wěn)定，基本保持在8.30～8.46 mg·100 g-1之間。感官評(píng)分在0～36 h內(nèi)隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而逐漸增加；在36～60 h趨于穩(wěn)定，在81.00～83.00分之間；而當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過(guò)60 h時(shí)，感官評(píng)分略有下降。這是因?yàn)楫?dāng)發(fā)酵時(shí)間過(guò)短時(shí)，微生物增殖較慢、數(shù)量較少，導(dǎo)致發(fā)酵不徹底，使得青稞中的營(yíng)養(yǎng)成分未被完全利用，感官品質(zhì)及氨基酸態(tài)氮含量較低；而發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，由于養(yǎng)分不足，微生物間相互作用，同時(shí)大量代謝產(chǎn)物累積使得整個(gè)發(fā)酵體系的pH值等發(fā)生變化[23]，影響發(fā)酵感官及氨基酸態(tài)氮含量。根據(jù)感官評(píng)分和氨基酸態(tài)氮含量結(jié)果，最終確定發(fā)酵時(shí)間為48 h較為適宜。

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)混菌發(fā)酵黑青稞氨基酸態(tài)含量及感官評(píng)分的影響Fig.3 Effect of fermentation time on the content of amnio acid nitrogen and sensory score of mixed bacteria fermented black hulless barley

2.1.4 不同菌種比例對(duì)混菌發(fā)酵黑青稞制品的影響 由圖4可知，不同菌種比例的黑青稞發(fā)酵制品的氨基酸態(tài)氮含量存在顯著性差異，其中J7∶米根霉比例為1∶3時(shí)氨基酸態(tài)氮含量最高，為8.77 mg·100 g-1，且當(dāng)米根霉含量較高時(shí)，黑青稞發(fā)酵制品的氨基酸態(tài)氮含量相對(duì)較高，這可能是菌種特性不同所致。與酵母菌相比，米根霉在生長(zhǎng)和發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生更多的蛋白酶，這些蛋白酶會(huì)作用于黑青稞蛋白，從而產(chǎn)生更多的氨基酸態(tài)氮。當(dāng)J7∶米根霉比例為1∶1、1∶3、1∶5時(shí)，感官評(píng)分結(jié)果無(wú)顯著性差異，在82.78～84.11分之間。該結(jié)果可能是由于米根霉含量更高時(shí)能夠代謝產(chǎn)生更多的淀粉酶和蛋白酶，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解及利用[24-25]，增強(qiáng)酵母菌的發(fā)酵利用效率，促進(jìn)風(fēng)味物質(zhì)的積累，得到較高品質(zhì)的青稞甜醅制品。

圖4 不同發(fā)酵溫度對(duì)混菌發(fā)酵黑青稞氨基酸態(tài)含量及感官評(píng)分的影響Fig.4 Effect of strain ratio on the content of amnio acid nitrogen and sensory score of mixed bacteria fermented black hulless barley

2.1.5 響應(yīng)面試驗(yàn) 本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以氨基酸態(tài)氮含量及感官評(píng)分為考察響應(yīng)值，以不同發(fā)酵溫度(X1)、不同菌種比例(X2)和不同接種量(X3)為因素，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)黑青稞混菌發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表3～5。

表3 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 3 Experimental design and results for Box-Behnken response surface analysis

表4 回歸模型方差分析(氨基酸態(tài)氮含量)Table 4 Analysis of variance for regression model (Amnio acid nitrogen content)

表5 回歸模型方差分析(感官評(píng)分)Table 5 Analysis of variance for regression model (sensory score)

對(duì)上述試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸擬合，建立的回歸方程分別為Y1(氨基酸態(tài)氮含量)=7.53+1.37X1-1.56X2+0.26X3-1.22X1X2-0.77X1X3-2.67X2X3-2.47X12-2.43X22-0.58X32；Y2(感官評(píng)分)=-434.93+27.53X1+24.58X2+16.95X3-0.28X1X2-0.77X1X3-1.44X2X3-0.39X12-1.88X22-0.33X32。

由表4可知，氨基酸態(tài)氮的回歸模型極顯著(P=0.000 7)，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.563 8)，說(shuō)明該模型擬合程度良好，可用于黑青稞發(fā)酵工藝條件的分析和預(yù)測(cè)。對(duì)回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，一次項(xiàng)X1和X2、二次項(xiàng)X12、X22以及X2和X3之間的交互作用對(duì)黑青稞氨基酸態(tài)氮含量的影響極顯著，X1和X2之間的交互作用對(duì)黑青稞氨基酸態(tài)氮含量的影響顯著，而X3、X32、X1和X3之間的交互作用對(duì)黑青稞氨基酸態(tài)氮含量的影響均不顯著。由表5可知，感官評(píng)分的回歸模型極顯著(P=0.001 5)，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.194 7)，說(shuō)明該模型擬合程度良好。對(duì)回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，一次項(xiàng)X1和X2、二次項(xiàng)X12、X22以及X2和X3之間的交互作用對(duì)黑青稞感官評(píng)分的影響極顯著，而X3、X32以及X1和X2、X1和X3之間的交互作用對(duì)黑青稞感官評(píng)分的影響均不顯著。

根據(jù)回歸方程得出不同因子的響應(yīng)面分析圖及相應(yīng)等高線圖。圖5～7為因素間具有顯著性影響的響應(yīng)面分析圖及等高線圖。各參數(shù)間的等高線呈橢圓形，響應(yīng)值存在最大值。利用Design-Expert 8.0.6.0軟件求解方程最大值，得到工藝一：當(dāng)發(fā)酵溫度為33℃，發(fā)酵時(shí)間為48 h，菌種比例為 1∶1.24， 接種量為6.70%時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量最高，達(dá)到9.12 mg·100 g-1。 工藝二：當(dāng)發(fā)酵溫度為33℃，發(fā)酵時(shí)間為48 h，菌種比例為1∶1.20，接種量為6.81%時(shí)，感官評(píng)分最大，為95.22 分。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性，在上述兩種發(fā)酵條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果如表6所示，經(jīng)兩次試驗(yàn)得到工藝二中氨基酸態(tài)氮含量平均值為9.32 mg·100 g-1， 感官評(píng)分為95.48 分，均高于工藝一。最終選取工藝二為混菌發(fā)酵黑青稞制品的最佳工藝。

圖5 發(fā)酵溫度與菌種比例的交互作用對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.5 Interaction effects of fermentation temperature and strain ratio on the amino acid nitrogen content

圖6 發(fā)酵溫度與接種量的交互作用對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.6 Interaction effects of fermentation temperature and inoculum amount on the amino nitrogen content

圖7 接種量與菌株比例的交互作用對(duì)感官評(píng)分的影響Fig.7 Interaction effects of inoculum amount and strain ratio on sensory score

表6 最佳工藝結(jié)果表Table 6 The best process results

2.2 不同發(fā)酵方式對(duì)黑青稞制品酚類物質(zhì)含量及抗氧化活性的影響

不同發(fā)酵方式對(duì)黑青稞制品酚類物質(zhì)含量及抗氧化活性的影響如圖8～10所示。不同發(fā)酵方式下黑青稞發(fā)酵制品的酚類物質(zhì)含量及DPPH自由基清除能力存在顯著差異，其中混菌發(fā)酵方式制備的黑青稞制品的酚類物質(zhì)含量及DPPH自由基清除能力顯著高于其他兩種發(fā)酵方式，3種發(fā)酵方式下發(fā)酵得到的黑青稞制品黃酮含量大小依次為J7+米根霉(32.22 mg·100 g-1)>米根霉(27.77 mg·100 g-1)>J7(18.59 mg·100 g-1)；多酚含量大小依次為J7+米根霉(230.68 mg·100 g-1)>米根霉(206.70 mg·100 g-1)>J7(186.82 mg·100 g-1)；DPPH自由基清除能力大小依次為J7+米根霉(95.03 μmol·L-1)>米根霉(89.56 μmol·L-1)>J7(83.46 μmol·L-1)，說(shuō)明混菌發(fā)酵黑青稞制品具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。

圖8 不同發(fā)酵方式對(duì)黑青稞制品黃酮含量的影響Fig.8 Effects of different fermentation methods on the content of flavonoids in black hulless barley products

圖9 不同發(fā)酵方式對(duì)黑青稞制品多酚含量的影響Fig.9 Effects of different fermentation methods on the content of polyphenols in black hulless barley products

圖10 不同發(fā)酵方式對(duì)黑青稞制品DPPH自由基清除能力的影響Fig.10 Effects of different fermentation methods on DPPH radical scavenging ability of black hulless barley products

2.3 黑青稞混菌發(fā)酵對(duì)成品風(fēng)味物質(zhì)的影響

由表7可知，不同菌種發(fā)酵黑青稞的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在種類和含量上均具有較大差異。酵母菌J7單獨(dú)發(fā)酵的黑青稞中共檢出33種揮發(fā)性化合物，米根霉單獨(dú)發(fā)酵的黑青稞中共檢出41種揮發(fā)性化合物，而酵母菌J7和米根霉混菌發(fā)酵的黑青稞中共檢出46種揮發(fā)性化合物，這3種發(fā)酵方式下制備得到的黑青稞制品中酯類和烷烴類物質(zhì)種類最為豐富。

表7 不同發(fā)酵方式下?lián)]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量變化Table 7 Changes of volatile flavor compounds in different fermentation methods

表7(續(xù))

由表8可知，不同發(fā)酵方式下制備得到的黑青稞制品風(fēng)味物質(zhì)的種類和相對(duì)含量存在差異，醇類和酯類是3種發(fā)酵方式黑青稞制品中主要的風(fēng)味物質(zhì)，其中醇類相對(duì)含量高達(dá)45%以上，是賦予黑青稞發(fā)酵制品的主要風(fēng)味成分。3種發(fā)酵方式中，米根霉單獨(dú)發(fā)酵黑青稞制品的酮類、萜烯類、烷烴類物質(zhì)種類較為豐富，且相對(duì)含量較高，分別達(dá)到了3.13%、3.98%、8.58%。酵母菌J7單獨(dú)發(fā)酵黑青稞制品的醇類含量?jī)H次于混菌發(fā)酵，表現(xiàn)出較濃郁的酒香和果香，且僅在此發(fā)酵方式下檢測(cè)到醛類物質(zhì)，但含量相對(duì)較低，僅為0.63%?；炀l(fā)酵黑青稞制品的風(fēng)味物質(zhì)種類最多，達(dá)到46種，且其醇類、酯類、酸類相對(duì)含量均高于其余兩種發(fā)酵方式，分別達(dá)到59.09%、29.44%和6.46%。其中2-乙基-1-丁醇、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、2-甲基-丙酸乙酯、2-甲基丙酸丙酯、二氧己酸甲酯、2-甲基丁酸丙酯、正丙酸異戊酯、2-丙酸戊醇酯、2-甲基戊酸甲酯、正己酸乙酯、異丁酸2-甲基丁酯、丁酸異戊酯、苯乙酸乙酯、己酸異戊酯、2-苯乙基乙酸酯、正辛酸異丁酯、9-癸烯酸酯、辛酸異戊酯、9-十六碳烯酸乙酯、異丁酸異丁酯、L-乳酸為混菌發(fā)酵黑青稞制品特有的風(fēng)味物質(zhì)。另外，混合發(fā)酵方式制備的黑青稞制品的2，3-丁二醇、2-乙基-1-丁醇、苯乙醇、辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、棕櫚酸甲酯、八甲基環(huán)四硅氧烷均高于其余兩種發(fā)酵方式，風(fēng)味物質(zhì)中的酯類大多賦予發(fā)酵制品芳香味、果香味，如辛酸乙酯有似杏、奶油香、牛奶香、甜的酒香香氣，癸酸乙酯有果香和酒香香氣，2-甲基丁酸乙酯有水果香，苯乙酸乙酯有玫瑰、蜂蜜香氣，月桂酸乙酯有甜香、水果香，丁酸乙酯有菠蘿香、水果香、花香等[20,26]；醇類、酸類賦予發(fā)酵制品花香味、果香味，如苯乙醇有花香味，香氣似梔子花、玫瑰、紫丁香[27]，3-甲基丁醇賦予發(fā)酵制品焦糖味[28]，2，3-丁二醇呈黃油、奶油氣味等，醇類化合物可使發(fā)酵物風(fēng)味濃厚豐滿。綜合而言，混菌發(fā)酵較單一發(fā)酵更利于風(fēng)味物質(zhì)的形成，其香味更為豐富、濃郁，說(shuō)明混菌菌種發(fā)酵黑青稞更具優(yōu)勢(shì)，且在實(shí)際生產(chǎn)實(shí)踐中具有一定的優(yōu)越性。

表8 黑青稞發(fā)酵制品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分類Table 8 Classification of volatile flavor compounds in black hulless barley fermented products

3 討論

混菌發(fā)酵方式能夠提高發(fā)酵制品品質(zhì)，改善其風(fēng)味，但目前對(duì)于應(yīng)用混菌發(fā)酵技術(shù)提升風(fēng)味及品質(zhì)的研究大多集中在黃酒[29]、果酒[30]等制品的發(fā)酵生產(chǎn)中，而針對(duì)青稞混菌發(fā)酵改善發(fā)酵制品風(fēng)味及品質(zhì)的研究較少。青海省青藏高原農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)米根霉單獨(dú)發(fā)酵制備的黑青稞制品風(fēng)味不理想，而酵母菌J7單獨(dú)發(fā)酵的黑青稞制品雖然具有較好的風(fēng)味，但存在發(fā)酵不徹底、青稞基料利用率低的問(wèn)題。已有研究表明，米根霉和酵母菌混菌發(fā)酵后能顯著提高燕麥的總酚含量及抗氧化活性[31]。因此，在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究選取米根霉及酵母菌J7進(jìn)行混菌發(fā)酵，結(jié)果顯示，經(jīng)混菌發(fā)酵的黑青稞制品氨基酸態(tài)氮含量、感官品質(zhì)、酚類物質(zhì)含量及抗氧化活性均得到大幅度提高，表明米根霉與酵母菌J7混菌發(fā)酵具有協(xié)同發(fā)酵作用。Chen等[29]采用霉菌和酵母菌混合發(fā)酵制備黃酒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)混合發(fā)酵的黃酒具有較高的α-淀粉酶含量和感官評(píng)分。Hu等[32]研究發(fā)現(xiàn)混合發(fā)酵的柑橘渣具有更高的營(yíng)養(yǎng)成分、酚類物質(zhì)含量及抗氧化活性。以上研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致，均表明混菌發(fā)酵能夠有效提高發(fā)酵物的營(yíng)養(yǎng)成分、功能物質(zhì)并改善其風(fēng)味。這可能是由于兩種菌株混合發(fā)酵后，米根霉代謝產(chǎn)生更多的淀粉酶[33]、蛋白酶[34]和脂肪酶[35]和琥珀酸等物質(zhì)，促進(jìn)了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解及利用，而酵母菌主要用于酒精發(fā)酵，更能有效利用這些小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)功能成分的生成，從而有效改善發(fā)酵制品的風(fēng)味。此外，酚類物質(zhì)主要以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)存在，其中結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)多與多糖、蛋白、淀粉、纖維等大分子結(jié)合，多數(shù)被細(xì)胞壁束縛，不能被直接提取出來(lái)，而通過(guò)微生物產(chǎn)生的酶系能夠破壞大分子基團(tuán)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)并降低細(xì)胞壁主要成分的分子量及大小[36-37]，從而獲得更多的游離態(tài)多酚類物質(zhì)，提高其生物活性[38]。

風(fēng)味物質(zhì)種類及含量的變化可能與混菌發(fā)酵微生物的相互作用機(jī)制密不可分。洪家麗等[35]研究發(fā)現(xiàn)，混菌發(fā)酵初期黑曲霉、紫色紅曲霉、米根霉和米曲霉米根霉為優(yōu)勢(shì)菌株，發(fā)酵代謝產(chǎn)生多種酶系，使得整個(gè)發(fā)酵體系產(chǎn)生有醇類、酸類，由于氧氣大量消耗，造成后期這些菌株生長(zhǎng)被抑制[39-40]，而到發(fā)酵后期酵母菌作為優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行發(fā)酵[41]。此外，史曉萌等[17]探究米根霉與酵母菌混菌發(fā)酵燕麥過(guò)程中微生物及理化指標(biāo)的變化也得到同樣的結(jié)果。因此，推測(cè)本研究在前期發(fā)酵中以米根霉為優(yōu)勢(shì)菌株，由于其代謝酶系的作用，將淀粉及蛋白質(zhì)進(jìn)行分解，獲得小分子糖類及氮源物質(zhì)，而后期酵母菌為優(yōu)勢(shì)菌株，利用小分子物質(zhì)產(chǎn)生了較多的風(fēng)味組分。為此，在后續(xù)研究中有必要采用相應(yīng)的技術(shù)手段，進(jìn)一步確定米根霉和酵母菌在混菌發(fā)酵過(guò)程中的生長(zhǎng)繁殖、相互作用及代謝通路，為混菌發(fā)酵黑青稞制品的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究采用米根霉和酵母菌J7混菌發(fā)酵黑青稞甜醅，得到最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度33℃，發(fā)酵時(shí)間48 h，菌種比例(酵母菌J7∶米根霉)1∶1.20，接種量6.81%，在此最佳發(fā)酵條件下測(cè)得混菌發(fā)酵制品的氨基酸態(tài)氮含量為9.32 mg·100 g-1， 感官評(píng)分為95.48分?；炀l(fā)酵黑青稞甜醅具有較高的酚類物質(zhì)含量、抗氧化活性、風(fēng)味物質(zhì)組成種類及含量，其中3-甲基丁醇、2，3-丁二醇、2-乙基-1-丁醇、苯乙醇、辛酸乙酯、癸酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、2-甲基-丙酸乙酯、月桂酸乙酯、棕櫚酸甲酯、L-乳酸、3-甲基-1-丁醇乙酸、十甲基環(huán)戊硅氧烷、八甲基環(huán)四硅氧烷為混菌發(fā)酵黑青稞甜醅的主要風(fēng)味物質(zhì)。綜上所述，混菌發(fā)酵制備的黑青稞制品在功能及風(fēng)味方面具有一定的優(yōu)勢(shì)，可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。