張 昱 石 玲 張亞琳 馬海娟 任新雅 張哲誠(chéng) 朱 璇

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院， 新疆 烏魯木齊 830000)

杏(PrunusarmeniacaL.)屬薔薇科(Rosaceae)杏屬(Armeniaca)，是新疆的一種特色水果，其品種繁多，酸甜可口，風(fēng)味獨(dú)特，深受人們喜愛(ài)[1]。杏屬于呼吸躍變型果實(shí)，其采收季節(jié)相對(duì)集中，采后生理代謝旺盛，易在貯藏運(yùn)輸中被微生物侵染，引起腐爛，從而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由鏈格孢(Alternariaalternata)侵染引起的黑斑病是杏果實(shí)主要的采后病害之一[2]。目前，主要通過(guò)化學(xué)殺菌劑來(lái)控制杏果實(shí)采后病害，但由于其存在藥劑殘留、易產(chǎn)生抗藥菌株及污染環(huán)境等問(wèn)題而逐漸受到限制，因此迫切需要尋求一種安全有效的病害控制手段。

誘導(dǎo)抗性是一種利用安全性較高的外源刺激因子來(lái)誘導(dǎo)果蔬提升抗病性的新策略。果蔬在受到誘導(dǎo)因子刺激后，其自身會(huì)產(chǎn)生一系列的信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)刺激進(jìn)行應(yīng)答[3-5]。在信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中，信號(hào)分子不僅單獨(dú)介導(dǎo)防御反應(yīng)，還與其他信號(hào)傳導(dǎo)途徑相互作用。研究表明，植物激素和諸多第二信使在誘導(dǎo)抗性中起著重要作用[6]。油菜素內(nèi)酯是公認(rèn)的第六大類植物激素，是誘導(dǎo)植物在各個(gè)階段抵抗逆境的一種甾醇類化合物[7-8]。2,4-表油菜素內(nèi)酯(2,4-epibrassinolide, EBR)是一種人工合成且價(jià)格相對(duì)低廉的油菜素甾體化合物。在草莓[9]和葡萄[10]等果實(shí)中的研究表明，EBR可延緩果蔬衰老速度，延長(zhǎng)貯藏時(shí)間。此外，EBR對(duì)桃[11]的軟腐病，棗[12]的青霉病也有明顯的抑制效果。鈣是植物體內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的第二信使[13]，可加固果實(shí)細(xì)胞壁，維持細(xì)胞膜的完整性[14-15]。果實(shí)中鈣含量與病原菌侵染引起的采后病害密切相關(guān)[16]。已有研究表明，鈣處理可顯著降低甜櫻桃灰霉病[17]和桃果實(shí)褐腐病[18]的發(fā)病率。目前，有研究已證實(shí)了復(fù)合保鮮劑相較于單一保鮮劑效果更優(yōu)[18-19]。因此本試驗(yàn)采用EBR結(jié)合鈣處理杏果實(shí)，從苯丙烷代謝角度出發(fā)，研究其代謝途徑關(guān)鍵限速酶活性與抗病相關(guān)物質(zhì)含量的變化，探究EBR與鈣結(jié)合是否可協(xié)同增效，增強(qiáng)杏果實(shí)對(duì)黑斑病的抗性，旨在為杏果實(shí)貯藏保鮮提供理論依據(jù)與技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料賽買提杏果實(shí)于 2021年 6月 18日采自新疆英吉沙縣烏恰鎮(zhèn)19村試驗(yàn)田，剔除帶有機(jī)械損傷和病蟲(chóng)害的杏果實(shí)，選取成熟度(可溶性固形物14.0%±0.5%、硬度25.0±0.5 N)、大小相近的杏果實(shí)，24 h內(nèi)運(yùn)回，于通風(fēng)陰涼處除去田間熱。

供試菌株：交孢鏈格孢(Alternariaalternata)，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器與試劑

UF-103型紫外分光光度計(jì)，上海優(yōu)尼克儀器有限公司；3HBRI型高速冷凍離心機(jī)，湖南海瀾儀器設(shè)備有限公司；DYS-475型電導(dǎo)率儀，上海永儀電科學(xué)儀器有限公司；DCGS-6電熱恒溫水浴鍋，北京永民醫(yī)療儀器廠；JA1003B型萬(wàn)分天平，三克(重慶)儀器有限公司。

β-巰基乙醇、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextroseagar, PDA)、馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基(potato dextrose broth, PDB)、昆布多糖、苯甲基磺酰氟、反式肉桂酸、p-香豆酸、輔酶 A、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)，北京索萊寶科技有限公司；L-苯丙氨酸、亮抑酶肽，天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。試劑均為分析純。

1.3 A. alternata離體抑菌試驗(yàn)

1.3.1A.alternata孢子懸浮液的配置 參考Bi等[20]的方法。在無(wú)菌操作條件下，用無(wú)菌藥匙刮下在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d的A.alternata孢子于錐形瓶中，加入適量的含有 0.05% Tween-80的無(wú)菌水，搖勻后用脫脂棉濾去絮狀物，并將孢子懸浮液濃度調(diào)節(jié)到1×106個(gè)·mL-1。

1.3.2A.alternata菌落直徑和孢子萌發(fā)率的測(cè)定 參照Yao等[21]的方法并略作改進(jìn)，將PDA培養(yǎng)基滅菌后，晾至45～50℃，分別加入3.0 mg·L-1EBR、2% CaCl2和3.0 mg·L-1EBR復(fù)合2% CaCl2溶液，以無(wú)菌水為對(duì)照。將6 mm交孢鏈格孢菌餅接種在凝固后的培養(yǎng)基中心，于28℃培養(yǎng)7 d后，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理組重復(fù)3次。

參照王迪等[22]的方法并略作改進(jìn)，將配置好的孢子懸浮液(1×106個(gè)·mL-1)置于PDB培養(yǎng)基中，分別加入3.0 mg·L-1EBR、2% CaCl2及3.0 mg·L-1EBR結(jié)合2% CaCl2溶液，以無(wú)菌水作為對(duì)照，于28℃培養(yǎng)，連續(xù)數(shù)小時(shí)鏡檢，直至對(duì)照組完全萌發(fā)，每次鏡檢100個(gè)孢子，每個(gè)處理組重復(fù)3次。按公式(1)計(jì)算孢子萌發(fā)率。

孢子萌發(fā)率=(萌發(fā)個(gè)數(shù)/100)×100%

(1)

1.4 原料處理

參照前期研究基礎(chǔ)[23]及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇3.0 mg·L-1EBR及2% CaCl2作為處理濃度，分別用3.0 mg·L-1EBR、2% CaCl2、3.0 mg·L-1EBR結(jié)合2% CaCl2對(duì)果實(shí)進(jìn)行減壓處理，以0.05 MPa保持2 min后于常壓下浸泡5 min的杏果實(shí)作為處理組，以含0.1%無(wú)水乙醇的蒸餾水處理的杏果實(shí)作為對(duì)照組，各組處理均3次重復(fù)，每次重復(fù)處理3.0 kg果實(shí)。待果皮表面無(wú)水滴后貯藏于溫度1.0±0.5℃、相對(duì)濕度90%～95%的冷庫(kù)中，48 h后進(jìn)行損傷接種。

參考 Deng等[24]的接種方式進(jìn)行損傷接種。先后分別用醫(yī)用酒精及無(wú)菌水擦拭果實(shí)表面，晾干后用無(wú)菌鐵釘于果實(shí)縱向中心線穿刺1個(gè)直徑 2.5 mm、深 4.0 mm的小孔，而后注入15 μL孢子懸浮液，損傷完成后套好保鮮袋，于上述條件下貯藏49 d。定期取樣，并測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.5 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.5.1 發(fā)病率與病斑直徑的測(cè)定 發(fā)病率的統(tǒng)計(jì)：定期測(cè)定并統(tǒng)計(jì)貯藏期間杏果實(shí)的發(fā)病孔數(shù)(病斑直徑大于等于2.5 mm記為發(fā)病孔)。

發(fā)病率=(發(fā)病孔數(shù)/總孔數(shù))×100%

(2)

病斑直徑的測(cè)定：采用十字交叉法，定期測(cè)量杏果實(shí)病斑直徑，每組各測(cè)量20個(gè)杏果實(shí)，平行3次，取平均值，單位mm。

1.5.2 總酚和類黃酮含量的測(cè)定 參照曹建康等[25]的方法，以每克鮮重果蔬組織在280 nm波長(zhǎng)處的吸光度值表示總酚含量，即OD280 nm·g-1；以每克鮮重果蔬組織在325 nm波長(zhǎng)處的吸光度值表示類黃酮物質(zhì)含量，即OD325 nm·g-1。

1.5.3 木質(zhì)素含量的測(cè)定 參照劉國(guó)強(qiáng)等[26]的方法并略作改動(dòng)，以每克鮮重果蔬組織在280 nm波長(zhǎng)處的吸光度值表示木質(zhì)素含量。

1.5.4 苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL)、4-香豆酸輔酶A 連接酶(4-coumaric acid coenzyme-A-ligase, 4CL)、肉桂酸-4-羥化酶(cinnamate-4-hydroxylase, C4H)活性的測(cè)定 PAL活性測(cè)定參照曹建康等[25]的方法，OD值以每小時(shí)變化 0.01 為 1 個(gè)酶活力單位(U)，單位U·g-1。

C4H、4CL活性測(cè)定參照范存斐等[27]的方法，OD值以每小時(shí)變化 0.01 為 1 個(gè)酶活力單位(U)，單位U·g-1。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用Sigma Plot 14.0和GraphPad Prism 8.0.2軟件作圖，用SPSS 22.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用Duncan’s進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 EBR結(jié)合鈣處理對(duì)A. alternata孢子萌發(fā)率和菌絲生長(zhǎng)的影響

由表1可知，與對(duì)照組相比，EBR處理、氯化鈣處理、EBR結(jié)合鈣處理對(duì)A.alternata的孢子萌發(fā)率與菌落直徑的抑制效果均無(wú)顯著差異，說(shuō)明EBR結(jié)合鈣處理對(duì)A.alternata沒(méi)有直接抑制作用。

表1 EBR結(jié)合鈣處理對(duì)A. alternata孢子萌發(fā)率和菌絲生長(zhǎng)的影響

2.2 EBR結(jié)合鈣處理對(duì)杏果實(shí)接種發(fā)病率和病斑直徑的影響

由圖1-A可知，對(duì)照組杏果實(shí)從貯藏第14天開(kāi)始發(fā)病，較EBR結(jié)合鈣處理組杏果實(shí)提前了14 d。在貯藏第21天時(shí)，對(duì)照組、氯化鈣處理組和EBR處理組的杏果實(shí)均表現(xiàn)出不同程度的發(fā)病情況，而EBR結(jié)合鈣處理組杏果實(shí)尚未發(fā)病。在貯藏第28天時(shí)，EBR結(jié)合鈣處理組杏果實(shí)接種發(fā)病率為38.33%，分別較對(duì)照組、氯化鈣處理組顯著降低了45%、25%(P<0.05)。而與EBR處理組差異不顯著。

注：不同小寫(xiě)字母表示同一貯藏時(shí)間不同處理間差異顯著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant differences at 0.05 level between different treatments for the same storage time圖1 EBR結(jié)合鈣處理對(duì)杏果實(shí)接種發(fā)病率(A)和病斑直徑(B)的影響Fig.1 Effect of EBR combined with calcium treatment on the inoculation incidence rate (A) and lesion diameter (B) of apricot fruit

由圖1-B可知，從貯藏第35天開(kāi)始，EBR結(jié)合鈣處理組杏果實(shí)病斑直徑顯著低于對(duì)照組、氯化鈣處理組和EBR處理組；貯藏結(jié)束時(shí)，EBR結(jié)合鈣處理組杏果實(shí)病斑直徑較對(duì)照組、氯化鈣處理組、EBR處理組顯著降低23.75%、20.23%、11.75%(P<0.05)。說(shuō)明EBR結(jié)合鈣處理能夠有效抑制杏病斑直徑的擴(kuò)大。

上述試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，EBR處理組、氯化鈣處理組和EBR結(jié)合鈣處理組對(duì)杏果實(shí)采后接種發(fā)病率和病斑直徑都有一定的抑制作用，以EBR結(jié)合鈣處理對(duì)杏果實(shí)采后接種A.alternata的控制效果最顯著，故將EBR結(jié)合鈣處理作為最佳處理組用于后續(xù)的試驗(yàn)分析。

2.3 EBR 結(jié)合鈣處理對(duì)杏果實(shí)總酚、類黃酮及木質(zhì)素含量的影響

如圖2-A所示，在整個(gè)貯藏過(guò)程中，EBR結(jié)合鈣處理組杏果實(shí)總酚含量一直高于對(duì)照組。與對(duì)照組相比，貯藏第42天時(shí)EBR結(jié)合鈣處理組杏果實(shí)總酚含量顯著升高了7.49%。說(shuō)明EBR結(jié)合鈣處理可促進(jìn)杏果實(shí)貯藏期間總酚的積累。

由圖2-B可知，在貯藏7 d后，EBR結(jié)合鈣處理組杏果實(shí)類黃酮含量開(kāi)始快速積累，在貯藏第21天時(shí)達(dá)到1.37 OD325 nm·g-1，是同期對(duì)照組的1.12倍(P<0.05)。貯藏結(jié)束時(shí)，處理組杏果實(shí)仍保持著較高的類黃酮含量。說(shuō)明EBR結(jié)合鈣處理可有效促進(jìn)杏果實(shí)貯藏期間類黃酮的積累。

由圖2-C可知，杏果實(shí)木質(zhì)素含量隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，且EBR結(jié)合鈣處理組杏果實(shí)木質(zhì)素含量在整個(gè)貯藏期間內(nèi)始終高于對(duì)照組。貯藏第14～第28天，木質(zhì)素含量上升幅度增大。在貯藏第49 天時(shí)，EBR結(jié)合鈣處理組木質(zhì)素含量較對(duì)照組顯著提高了11.86%(P<0.05)。說(shuō)明EBR結(jié)合鈣處理可促進(jìn)杏果實(shí)貯藏期間木質(zhì)素的積累。

注：*表示處理組與對(duì)照組之間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: * indicate significant difference between treatment group and control group(P<0.05). The same as following.圖2 EBR 結(jié)合鈣處理對(duì)杏果實(shí)總酚(A)、類黃酮(B)及木質(zhì)素(C)含量的影響Fig.2 Effect of EBR combined with calcium treatment on total phenol (A), flavonoid (B) and lignin (C) content of apricot fruitc

2.4 EBR 結(jié)合鈣處理對(duì)杏果實(shí) PAL、C4H及4CL活性的影響

由圖3-A可知，在貯藏第35天時(shí)，EBR結(jié)合鈣處理組杏果實(shí)PAL活性達(dá)到峰值，為 31.50 U·g-1， 相比于同期對(duì)照組顯著提高了31.25%(P<0.05)。貯藏過(guò)程中對(duì)照組杏果實(shí) PAL 活性峰值為 25.00 U·g-1， 較處理組 PAL 活性峰值降低了20.63%。說(shuō)明 EBR結(jié)合鈣處理可提高貯藏期間杏果實(shí)的PAL活性。

由圖 3-B可知，在貯藏第28天時(shí)，兩組間杏果實(shí) 4CL活性差異最大，EBR結(jié)合鈣處理組和對(duì)照組杏果實(shí)的4CL活性分別為 36.96和 32.83 U·g-1，處理組較對(duì)照組顯著提高12.60%(P<0.05)。貯藏后期，兩組杏果實(shí)的4CL活性差異不顯著。說(shuō)明 EBR結(jié)合鈣處理可提高杏果實(shí)貯藏前期的4CL活性。

由圖 3-C可知，貯藏第14天，EBR結(jié)合鈣處理組杏果實(shí)C4H活性為 395.56 U·g-1，比對(duì)照組顯著提高了21.50%(P<0.05)。在貯藏第42天時(shí)，處理組與對(duì)照組杏果實(shí)C4H活性分別為 455.56和399.44 U·g-1， 處理組是對(duì)照組的1.14倍(P<0.05)。說(shuō)明 EBR結(jié)合鈣處理可增強(qiáng)貯藏期間杏果實(shí)的C4H活性。

圖3 EBR 結(jié)合鈣處理對(duì)杏果實(shí) PAL(A)、4CL(B)及C4H(C)活性的影響Fig.3 Effect of EBR combined with calcium treatment on PAL(A)、4CL(B) and C4H(C) activity of apricot fruit

3 討論

在離體試驗(yàn)中，各處理組A.alternata鏈格孢的菌落直徑和孢子萌發(fā)率與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，說(shuō)明EBR與CaCl2對(duì)A.alternata沒(méi)有直接抑制作用。此結(jié)果與黃雪梅等[28]和石玲等[29]的研究結(jié)果相似，EBR與鈣均可通過(guò)激活果實(shí)抗病相關(guān)酶活性，誘導(dǎo)增強(qiáng)果實(shí)對(duì)病原菌的抗性。

苯丙烷代謝作為植物抵御病原菌侵害的關(guān)鍵次生代謝之一，在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌具有抵御作用[30-31]。PAL作為苯丙烷代謝的關(guān)鍵酶，可將苯丙烷代謝的前體物質(zhì)L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為反式肉桂酸[32]，隨后反式肉桂酸被C4H水解，生成阿魏酸、香豆酸等酚酸。這些酚酸既可直接殺滅病原物，也可被4CL繼續(xù)催化，生成酚類、類黃酮等的前體物質(zhì)，繼而進(jìn)一步得到酚類、類黃酮等[31,33]?？偡?、類黃酮作為苯丙烷代謝的次級(jí)代謝產(chǎn)物，一方面可有效抑制病原菌的生長(zhǎng)，防止病原菌向周圍組織擴(kuò)散[34]；另一方面酚類物質(zhì)是木質(zhì)素合成的前體物質(zhì)，當(dāng)酚類物質(zhì)大量積累時(shí)會(huì)促使木質(zhì)素含量增加[32,35]。木質(zhì)素作為一種重要的抗菌物質(zhì)，既可切斷果實(shí)體內(nèi)養(yǎng)分向病原菌運(yùn)送，又可增強(qiáng)被病原菌侵染周圍細(xì)胞壁的堅(jiān)固性，降低病原物在寄主組織中的擴(kuò)散速度，從而使果實(shí)有足夠的時(shí)間產(chǎn)生和積累更多的植保素，達(dá)到抑制病原菌生長(zhǎng)繁殖的目的[36-37]。李麗花等[23]研究表明，外源EBR處理可通過(guò)誘導(dǎo)杏果實(shí)苯丙烷代謝相關(guān)酶活性上升來(lái)促進(jìn)貯藏期間總酚、類黃酮和木質(zhì)素的積累，以此達(dá)到增強(qiáng)杏果實(shí)抗病性的目的。本試驗(yàn)中，EBR結(jié)合鈣處理組與氯化鈣處理組和EBR單獨(dú)處理組相比，整體顯著提高了杏果實(shí)貯藏期間的PAL、C4H、4CL活性，促進(jìn)了貯藏期間總酚、木質(zhì)素與類黃酮的積累，并抑制杏果實(shí)接種發(fā)病率的上升與病斑直徑的擴(kuò)大。這可能是由于EBR與鈣可作為信號(hào)分子激活苯丙烷代謝，并誘導(dǎo)增強(qiáng)PAL、C4H和4CL酶的活性，從而加快其代謝產(chǎn)物的合成與積累。此外，復(fù)配中鈣的施用可維持并穩(wěn)定細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與功能，這對(duì)抑制病原菌進(jìn)一步的侵染也有重要意義[15,37]。與單一處理相比，復(fù)合處理起到協(xié)同增效作用，因此對(duì)黑斑病的抑制效果更顯著。張志剛等[38]研究也表明，油菜素內(nèi)酯與氯化鈣復(fù)配可有效提高黃瓜幼苗對(duì)灰霉病的抗性，且效果優(yōu)于單獨(dú)處理。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，EBR結(jié)合鈣處理整體顯著誘導(dǎo)了杏果實(shí)貯藏期間苯丙烷代謝關(guān)鍵限速酶PAL、C4H和4CL活性的增強(qiáng)，促進(jìn)果實(shí)體內(nèi)總酚、木質(zhì)素和類黃酮的積累，從而增強(qiáng)了杏果實(shí)對(duì)黑斑病的抗性，說(shuō)明EBR結(jié)合鈣處理可通過(guò)調(diào)控杏果實(shí)苯丙烷代謝，增強(qiáng)采后杏果實(shí)的抗病性。