李春梅 岳 寧 李敏潔 王 琦 李曉慧 金 芬,*

(1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京 100081；2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193)

初級芳香胺類化合物是指苯胺分子中的氫原子被其他功能基團取代后形成的一類化合物，是一種重要的化工原料和中間體，廣泛應(yīng)用于食品接觸材料、染料以及紡織品、農(nóng)藥及殺蟲劑、日化產(chǎn)品、橡膠等生產(chǎn)中[1-2]。然而，初級芳香胺的大量使用導(dǎo)致其在食品接觸材料[2]、環(huán)境[3-4]，甚至人體中[5]廣泛分布，其中食品接觸材料中殘留的芳香胺化合物會進一步向食品遷移，對食品安全[6-7]和人體健康[8-10]造成一定威脅。已有研究表明，初級芳香胺類化合物進入人體后會損害中樞神經(jīng)和心血管系統(tǒng)，部分化合物還具有致癌作用[11-12]。國際癌癥研究機構(gòu)已將部分芳香胺歸類為“致癌物”或“可能的致癌物”[13]。因此，對初級芳香胺類化合物的快速鑒定和分析具有重要的現(xiàn)實意義。

目前，關(guān)于初級芳香胺檢測方法的研究較多，但主要集中于定量檢測方法的建立，包括毛細(xì)管電泳法[14-15]、氣相色譜法[16]、液相色譜法[17-18]、質(zhì)譜聯(lián)用法[1,10,19-24]等，而對初級芳香胺質(zhì)譜裂解規(guī)律的研究甚少。張小平等[25]采用電噴霧萃取電離-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)研究了3種N, N-二乙基苯胺類化合物的碎裂行為，然而線性離子阱質(zhì)譜分辨率相對較低，不能直觀地給出各離子的高精度質(zhì)量數(shù)和碎裂片段元素組成信息，對裂解途徑的判斷證據(jù)不足，進一步采用同位素標(biāo)記試驗對其碎裂行為進行了驗證。超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法(ultra-performance liquid chromatography coupled to quadrupole orbitrap high-resolution mass spectrometry, UPLC-Q-Orbitrap HRMS)是近幾年發(fā)展起來的一種新型液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，具有質(zhì)量精度好、定性和定量能力強等特點，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品及環(huán)境中有毒有害物質(zhì)[26-28]和天然產(chǎn)物[29-31]的質(zhì)譜裂解規(guī)律研究。因此，本研究擬采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)對14種初級芳香胺類化合物的主要特征碎片離子進行分析，發(fā)現(xiàn)并歸納其基本裂解途徑，以期為實現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中芳香胺類化合物的快速準(zhǔn)確鑒定提供質(zhì)譜依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鄰甲苯胺、2, 4-二甲基苯胺、2, 6-二甲基苯胺、2, 4, 5-三甲基苯胺、對氯苯胺、4-氯鄰甲苯胺、2-甲氧基苯胺、3-甲基-6-甲氧基苯胺、聯(lián)苯胺、4-氨基聯(lián)苯、3, 3′-二甲基聯(lián)苯胺、3, 3′-二甲氧基聯(lián)苯胺、4-氨基偶氮苯、鄰氨基偶氮甲苯標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%)，德國Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇、甲酸(色譜純)，美國Thermo Fisher公司；超純水由Milli-R04純水儀(德國Millipore公司)制得。

初級芳香胺類標(biāo)準(zhǔn)溶液采用甲醇溶解，使用時用甲醇配制成200 μg·L-1的工作溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

Dionex Ultimate 3000超高效液相色譜儀，美國Dionex公司；Thermo Q-Exactive Orbitrap超高分辨質(zhì)譜儀，美國Thermo Fisher公司，配加熱電噴霧電離源。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Thermo Hypersil GOLD aQ柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；流動相：A為甲醇，B為0.1%甲酸水溶液；洗脫程序：0～10 min(5%～40% A)，10～18 min(40%～100% A)，18～22 min(100% A)，22～22.1 min(100%～5% A)，22.1～25 min(5% A)；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：40℃；進樣體積：5 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件 正離子掃描模式，采集模式為全掃描/數(shù)據(jù)依賴性二級掃描(Full MS/dd-MS2)，質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1 500，一級分辨率70 000，二級分辨率17 500，自動增益控制進入軌道阱中的離子數(shù)(AGC target)為1.0×e6，最大注入時間為100 ms。歸一化碰撞能量(normalized collision energies，NCE)設(shè)定為20%、30%和40%，噴霧電壓設(shè)定為3.6 kV，毛細(xì)管溫度為350℃，輔助氣體加熱器溫度為300℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 正離子模式下初級芳香胺的UPLC-Q-Orbitrap HRMS分析

本研究采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)對14種初級芳香胺類化合物進行分析，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。從結(jié)構(gòu)上看，該類化合物是苯胺分子中的氫原子被甲基、氯原子、甲氧基、苯基或苯偶氮基等不同基團取代后形成的一類化合物。由于初級芳香胺類化合物中的氮原子含有孤對電子，容易締合質(zhì)子，形成穩(wěn)定的質(zhì)子化離子[M+H]+，因此，選擇電噴霧正離子模式進行質(zhì)譜分析。14種初級芳香胺的最佳電離方式、分子離子峰存在形式、基峰m/z值如表1所示。

2.2 初級芳香胺的質(zhì)譜裂解規(guī)律分析

正離子模式下，14種初級芳香胺類化合物在一級質(zhì)譜中均可產(chǎn)生較強的準(zhǔn)分子離子[M+H]+，由苯胺分子上的氮原子質(zhì)子化后形成。14種初級芳香胺類化合物的母離子及主要碎片離子數(shù)據(jù)見表1。

表1 14種初級芳香胺的最佳電離方式、分子離子峰存在形式、基峰值和主要碎片離子Table 1 The best ionization mode, molecular ion peak, base peak value and the major fragment ions of the 14 primary aromatic amines

2.2.1 甲基取代苯胺類化合物 鄰甲苯胺、2, 4-二甲基苯胺、2, 6-二甲基苯胺和2, 4, 5-三甲基苯胺4種初級芳香胺類化合物均由不同數(shù)量的甲基取代苯胺中的氫原子產(chǎn)生，二級質(zhì)譜中可以產(chǎn)生豐度較大的脫NH3碎片(圖2)。因此，這4種初級芳香胺類物質(zhì)的特征碎片離子主要為中性丟失NH3的離子，其中1個甲基取代的苯胺類化合物鄰甲苯胺在正離子模式下的分子離子峰[M+H]+為m/z108.080 90，中性丟失NH3形成特征碎片離子[C7H7]+m/z91.054 57。2個甲基取代的苯胺類化合物2, 4-二甲基苯胺、2, 6-二甲基苯胺為同分異構(gòu)體，中性丟失NH3形成的碎片離子均為[C8H9]+m/z105.070 11。3個甲基取代的苯胺類化合物2, 4, 5-三甲基苯胺分子離子峰[M+H]+為m/z136.111 89，中性丟失NH3形成特征碎片離子[C9H11]+m/z119.085 33。

圖2 鄰甲苯胺、2, 4-二甲基苯胺、2, 6-二甲基苯胺和2, 4, 5-三甲基苯胺的二級質(zhì)譜圖Fig.2 MS/MS spectrum of o-toluidine, 2, 4-xylidine, 2, 6-xylidine and 2, 4, 5-trimethylaniline

2.2.2 氯代苯胺類化合物 氯代苯胺類化合物對氯苯胺和4-氯鄰甲苯胺均為苯胺分子中的氫原子被氯取代，與上述4種甲基取代的苯胺類化合物類似，二級質(zhì)譜中亦產(chǎn)生豐度較大的脫NH3碎片，并在此基礎(chǔ)上進一步丟失氯原子(圖3)。因此，這2種初級芳香胺類物質(zhì)的特征碎片離子主要為中性丟失NH3的離子，以及丟失NH3和氯原子的碎片離子。以4-氯鄰甲苯胺為例，在正離子模式下的分子離子峰[M+H]+為m/z142.040 04，中性丟失NH3形成特征碎片離子[C7H6Cl]+m/z125.015 26，在此基礎(chǔ)上發(fā)生碳正離子重排后，丟失氯原子形成碎片離子[·C7H6]+m/z90.048 10，其可能的裂解途徑如圖4所示。

圖3 對氯苯胺和4-氯鄰甲苯胺的二級質(zhì)譜圖Fig.3 MS/MS spectrum of p-chloroaniline and 4-chloro-o-toluidine

圖4 正離子模式下4-氯鄰甲苯胺可能的裂解途徑Fig.4 The proposed fragmentation pathways of 4-chloro-o-toluidine in positive ion mode

2.2.3 甲氧基取代苯胺類化合物 甲氧基取代苯胺類化合物2-甲氧基苯胺和3-甲基-6-甲氧基苯胺均為苯胺分子中的氫原子被甲氧基取代，與上述甲基、氯取代的苯胺類化合物類似，二級質(zhì)譜中亦產(chǎn)生豐度較大的脫NH3碎片，同時還可丟失CH3O基團(圖5)。因此，這2種初級芳香胺類物質(zhì)的特征碎片離子主要為中性丟失NH3和CH3O的碎片離子。以3-甲基-6-甲氧基苯胺為例，在正離子模式下的分子離子峰[M+H]+為m/z138.091 13，中性丟失NH3形成特征碎片離子[C8H9O]+m/z121.088 82，在此基礎(chǔ)上丟失CH3O基團形成碎片離子[C7H7]+m/z91.054 70。此外，3-甲基-6-甲氧基苯胺在苯胺分子上還有甲基取代，因此，在中性丟失NH3后碳正離子轉(zhuǎn)移重排到苯甲基上，丟失CH3形成碎片離子[C7H7O]+m/z107.049 20，進一步脫去CH3O基團形成[C6H5]+m/z77.039 17碎片離子。另外，正離子模式下，3-甲基-6-甲氧基苯胺上的甲氧基亦可質(zhì)子化，然后直接中性丟失CH3O形成特征碎片離子[C7H8N]+m/z106.065 38， 其可能的裂解途徑如圖6所示。

圖5 2-甲氧基苯胺和3-甲基-6-甲氧基苯胺的二級質(zhì)譜圖Fig.5 MS/MS spectrum of 2-methoxyaniline and 3-methyl-6-methoxyaniline

圖6 正離子模式下3-甲基-6-甲氧基苯胺可能的裂解途徑Fig.6 The proposed fragmentation pathways of 3-methyl-6-methoxyaniline in positive ion mode

2.2.4 聯(lián)苯胺類化合物 聯(lián)苯胺、4-氨基聯(lián)苯、3, 3′-二甲基聯(lián)苯胺、3, 3′-二甲氧基聯(lián)苯胺均屬于聯(lián)苯胺類化合物，與其他芳香胺類物質(zhì)類似，聯(lián)苯胺類物質(zhì)二級質(zhì)譜中亦可產(chǎn)生脫NH3碎片(圖7)。此外，3, 3′-二甲基聯(lián)苯胺、3, 3′-二甲氧基聯(lián)苯胺還會先發(fā)生CN鍵斷裂，分別產(chǎn)生碎片[C14H16N]+m/z198.127 65、[C14H16NO2]+m/z230.104 60，繼而中性丟失NH3形成[C14H13]+m/z181.088 30、[C14H13O2]+m/z213.102 05特征碎片離子，其中3, 3′-二甲基聯(lián)苯胺可能的裂解途徑如圖8所示。

圖7 聯(lián)苯胺、4-氨基聯(lián)苯、3, 3′-二甲基聯(lián)苯胺、3, 3′-二甲氧基聯(lián)苯胺的二級質(zhì)譜圖Fig.7 MS/MS spectrum of benzidine, 4-aminobiphenyl, 3, 3′-dimethylbenzidine and 3, 3′-dimethoxybenzidine

圖8 正離子模式下3, 3′-二甲基聯(lián)苯胺可能的裂解途徑Fig.8 The proposed fragmentation pathways of 3, 3′-dimethylbenzidine in positive ion mode

2.2.5 偶氮苯類化合物 4-氨基偶氮苯、鄰氨基偶氮甲苯均屬于偶氮苯類化合物，在正離子模式下的二級全掃描質(zhì)譜圖如圖9所示。兩種化合物二級質(zhì)譜亦可發(fā)生NH3中性碎片的丟失，分別形成特征碎片離子[C12H9N2]+m/z181.077 70、[C14H13N2]+m/z209.164 58。除此之外，以鄰氨基偶氮甲苯為例，由于高鍵能的偶氮鍵(—N=N—)不易發(fā)生斷裂，裂解過程在近苯環(huán)端的CN鍵還發(fā)生斷裂，形成[·C7H7N3]+m/z133.075 91、[C7H7]+m/z91.054 65碎片離子，以及在近苯胺端的CN鍵斷裂，形成[C7H8N]+m/z106.065 12碎片離子，其裂解途徑如圖10所示。

圖9 4-氨基偶氮苯、鄰氨基偶氮甲苯的二級質(zhì)譜圖Fig.9 MS/MS spectrum of 4-phenyldiazenylaniline and o-aminoazotoluene

圖10 正離子模式下鄰氨基偶氮甲苯可能的裂解途徑Fig.10 The proposed fragmentation pathways of o-aminoazotoluene in positive ion mode

3 討論

有毒有害物質(zhì)在食品和環(huán)境中的殘留直接危害人體健康，而有毒有害物質(zhì)涉及面廣，涵蓋的種類復(fù)雜。因此，通過研究不同結(jié)構(gòu)類型化合物在質(zhì)譜中的電離和裂解，總結(jié)該類化合物在質(zhì)譜中的裂解規(guī)律，如中性丟失或電離產(chǎn)生特征性離子碎片等，對同類結(jié)構(gòu)污染物的快速鑒定分析具有重要的參考和指導(dǎo)作用。UPLC-Q-Orbitrap HRMS是近年研究熱點，該技術(shù)具有高分辨率、高質(zhì)量精度優(yōu)勢，已用于農(nóng)產(chǎn)品及環(huán)境中有毒有害物質(zhì)譜碎裂途徑的研究[26-28,32]，但是該技術(shù)用于初級芳香胺類化合物裂解途徑的研究鮮有報道，主要集中于部分初級芳香胺的靶向定量檢測方法建立[22,33-34]，如Sanchis等[22]建立了食品接觸材料中8種初級芳香胺的UPLC-Q-Orbitrap HRMS分析方法，并采用靶向和后靶向分析法對實際食品接觸材料樣品中的初級芳香胺進行分析。本研究采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)對14種初級芳香胺化合物進行分析，可以獲得各碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)，質(zhì)荷比精確至小數(shù)點后5位，極大提高了定性的準(zhǔn)確度。通過對初級芳香胺化合物分子離子峰的存在形式及可能的裂解規(guī)律進行分析，發(fā)現(xiàn)此類化合物更易形成[M+H]+，繼而丟失中性碎片NH3，在此基礎(chǔ)上，氯代苯胺類化合物發(fā)生碳正離子重排后丟失氯原子，甲氧基取代苯胺類化合物丟失CH3O基團或者CH3，所得碎片離子與Perez等[20]的結(jié)果相似。此外，甲基或甲氧基取代的聯(lián)苯胺類化合物還會發(fā)生CN鍵斷裂，繼而中性丟失NH3碎片，偶氮苯類化合物由于高鍵能的偶氮鍵不易發(fā)生斷裂，碎片離子主要通過兩側(cè)的CN鍵斷裂形成，該結(jié)果與具有2個偶氮基團的蘇丹紅IV裂解規(guī)律相似[27]。對于初級芳香胺類化合物，HPLC-Q-Orbitrap HRMS可根據(jù)現(xiàn)有的初級芳香胺裂解規(guī)律來推斷其結(jié)構(gòu)，充分發(fā)揮其高分辨、快速分析的優(yōu)勢，為初級芳香胺類化合物的快速鑒定提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本試驗采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)研究了14種初級芳香胺類化合物在電噴霧正離子模式下的質(zhì)譜裂解行為，發(fā)現(xiàn)此類化合物均丟失中性碎片NH3，在此基礎(chǔ)上，氯代和甲氧基取代苯胺類化合物分別丟失取代基團氯原子和CH3O或CH3基團，甲基或甲氧基取代的聯(lián)苯胺類和偶氮苯類化合物還會發(fā)生CN鍵斷裂，形成碎片離子，這些質(zhì)譜裂解規(guī)律可為具有相似結(jié)構(gòu)特征的初級芳香胺類化合物結(jié)構(gòu)解析提供重要依據(jù)，同時為使用質(zhì)譜技術(shù)對樣品中未知初級芳香胺類的非靶向快速篩查提供理論基礎(chǔ)。