李方舟 張海生 楊婷婷 王 軍 古曉紅

(山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山西 太原 030031)

大豆在人類和動物脂肪酸及蛋白質(zhì)攝取來源中占有重要地位。大豆不僅是人類第二大食用油來源，同時也是最大的飼料蛋白來源[1]，保證大豆安全生產(chǎn)具有重要意義。據(jù)最新統(tǒng)計，2021—2022年度我國大豆新增供給量為11 240萬噸，而國產(chǎn)大豆產(chǎn)量僅為 1 640 萬噸[2]，遠遠不能滿足國民需求，我國需求的大豆主要依賴于進口，對我國大豆產(chǎn)業(yè)造成了巨大影響，因此提高我國大豆產(chǎn)量迫在眉睫[2]。光合作用對大豆產(chǎn)量具有重要影響，而葉綠素是光合作用必不可少的物質(zhì)[3]，同時也是光合能力、營養(yǎng)脅迫和衰老進程各階段的良好指示劑[4]，可見測定葉綠素含量對大豆產(chǎn)量及健康狀況監(jiān)測具有重要意義[5]。

常見的葉綠素含量測定方法有三種：第一種為比色法[6-7]，主要是將葉片粉碎后用乙醇或丙酮提取葉綠素，然后用分光光度計進行比色測定，該方法能夠準確測定葉綠素a/b和類胡蘿卜素含量，但測定時間長且測定過程繁瑣；第二種是用葉綠素計測定葉綠素的相對含量[8-9]，該方法操作簡單，時效性強，不需要破壞植株，應用較為廣泛；第三種是通過建立光譜模型來估算葉綠素含量[10-12]，該方法常用于遙感監(jiān)測領(lǐng)域，具有無損、及時、大面積監(jiān)測等優(yōu)點。前人已就上述方法做了大量研究，但通過葉綠素熒光參數(shù)來估算葉綠素含量鮮有報道，該方法可實現(xiàn)葉綠素含量和葉片光合性能同步研究。如楊程等[13]建立了小麥葉綠素含量的估算方法，指出可以利用t=tFm時，單位葉截面的反應中心(reaction center of unit cross section,RC/CSM)，通過線性模型估算冬小麥葉片土壤與作物分析開發(fā)(soil and plant analyzer development, SPAD)值；楊艷陽等[14]研究發(fā)現(xiàn)茶鮮葉的葉綠素含量與685 nm處的熒光強度顯著相關(guān)；王藝斐等[15]指出隨著銀杏葉片葉綠素含量的降低，PSⅡ最大光化學效率(maximal photochemical efficiency of PSⅡ,Fv/Fm)會顯著下降，其他熒光參數(shù)也發(fā)生明顯變化。在熒光參數(shù)方面，學者們主要研究逆境脅迫對植株熒光參數(shù)的影響，如原向陽等[16]研究指出缺磷脅迫下4.98 mL·L-1草甘膦處理的大豆葉片最大熒光(maximal fluorescence,Fm)、Fv/Fm呈下降趨勢。王征宏等[17]指出，NaCl脅迫下大豆葉片可變熒光與初始熒光比(ratio of rate constants for photochemical reaction and nonphotochemical deactivation of PSII excitations,Fv/Fo)、Fv/Fm均顯著降低。通過熒光參數(shù)估算大豆葉綠素含量還鮮見報道，因此本研究在大豆鼓粒期對葉片葉綠素含量與熒光參數(shù)進行相關(guān)分析，篩選出相關(guān)性極顯著的熒光參數(shù)，建立并驗證葉綠素含量監(jiān)測模型，并通過通徑分析對熒光參數(shù)排序，以期為大豆葉片葉綠素含量監(jiān)測提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

本研究在山西農(nóng)業(yè)大學東陽試驗基地進行。該地區(qū)平均海拔800 m，氣候類型為暖溫帶半濕潤大陸性季風氣候，無霜期158 d，年平均氣溫9.8℃，夏季炎熱多雨，年平均降水量415～483 mm，年日照時數(shù)2 662 h[18]。

1.2 試驗設(shè)計

本研究于2020—2021年開展試驗。2020年設(shè)置50個小區(qū)，2021年設(shè)置55個小區(qū)，分別種植黃淮海不同大豆品種(表1)，小區(qū)行長6 m，寬3 m，大豆行距50 cm，株距20 cm。根據(jù)當?shù)貧夂蚣按蠖归L勢，進行間苗、中耕、灌溉、施肥。在大豆鼓粒期分別測量葉片葉綠素含量和熒光參數(shù)，獲得105個樣本數(shù)據(jù)，按照葉綠素含量從小到大順序依次進行樣本排列，從第3個樣本起每隔2個樣本選取一個作為驗證集，最后選取結(jié)果為70個樣本作為建模集，35個樣本作為驗證集。建模集中剔除7個異常樣本，剩余63個樣本；驗證集中剔除7個異常樣本，剩余28個樣本。

表1 本研究選用大豆品種Table 1 Soybean varieties selected in this study

1.3 大豆葉綠素和熒光參數(shù)的測定

每小區(qū)選取生長一致的5株大豆植株，取其上部1完全展開葉片，進行暗處理30 min，用Handy PEA植物效率分析儀(英國Hansatech公司)測定其葉綠素熒光誘導動力學曲線，每片葉片重復測定3次，計算熒光參數(shù)(表2)，取其5片葉片平均值作為該小區(qū)的葉綠素熒光參數(shù)。

表2 熒光參數(shù)及表征意義Table 2 Fluorescence parameters and characterization significance

表1(續(xù))

將采集的葉片放入密封袋低溫保存，帶回實驗室，用UV-1800型紫外可見分光光度計(日本島津公司)測量葉片在665、649、470 nm處的吸光度，利用以下公式計算葉綠素含量[19]。

LCT=LCa+LCb

式中，LCa(leaf chlorophyll a content)為葉片葉綠素a的含量；LCb(leaf chlorophyll b content)為葉片葉綠素b的含量；LCT(leaf total chlorophyll content)為葉片總?cè)~綠素的含量；A665和A649分別為光合色素溶液在665和649 nm處的吸光度；V為提取液的體積；FW(fresh weight)為葉片鮮重。取小區(qū)5片葉的葉綠素含量平均值作為該小區(qū)的葉綠素含量。

1.4 模型的構(gòu)建與檢驗

利用Origin 2021軟件對葉綠素含量與熒光參數(shù)進行相關(guān)性分析，用Excel 2010建立葉綠素監(jiān)測模型，用SPSS 19軟件構(gòu)建多元逐步回歸模型并進行通徑分析，通過驗證集對模型進行驗證，依據(jù)決定系數(shù)(coefficient of determination,R2)、均方根誤差(root mean squared error, RMSE)、預測殘差(residual prediction difference, RPD)對模型進行評價。其中R2越接近1，RMSE越小，表明模型預測精度越高；當RPD>1.4時，具有較好的預測能力，當RPD<1.4時，預測能力較差[20]。

式中，n為樣本總數(shù)；p為模型的變量個數(shù)；Yi為實測值；Yi′為預測值。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素描述性統(tǒng)計分析

由表3可知，建模集63個樣本中葉綠素含量最大值為3.14，最小值為1.04，均值為2.07，標準差為0.51，變異系數(shù)為0.25；驗證集28個樣本中葉綠素含量最大值為3.08，最小值為1.05，均值為1.90，標準差為0.53，變異系數(shù)為0.28。建模集葉綠素含量的范圍較驗證集大，而均值和標準差相差不大，為模型的建立和驗證提供了理論基礎(chǔ)。全部集的統(tǒng)計描述均與建模集、驗證集相差較小，且變異系數(shù)均較小，表明模型具有可行性。

表3 大豆葉片葉綠素含量描述性統(tǒng)計分析Table 3 Descriptive statistical analysis for chlorophyll content of soybean leaves

2.2 相關(guān)性分析

對所選的29個熒光參數(shù)與葉綠素含量進行相關(guān)分析，繪制相關(guān)系數(shù)圖，如圖1所示。16個熒光參數(shù)與葉綠素含量呈正相關(guān)關(guān)系，除VI、Sm與葉綠素含量不顯著相關(guān)外，其他14個熒光參數(shù)均與葉綠素含量達到極顯著正相關(guān)，其中Fv/Fo、φPO、ψEO、φEO、ETO/CSM和PIABS的相關(guān)系數(shù)較大，分別為0.78、0.76、0.75、0.80、0.82和0.77。13個熒光參數(shù)與葉綠素含量呈負相關(guān)關(guān)系，除tFM、N與葉綠素含量不顯著相關(guān)外，其他11個熒光參數(shù)均與葉綠素含量達到極顯著負相關(guān)，其中VJ的相關(guān)系數(shù)較大，為-0.75。

注：*和**分別表示相關(guān)性在0.05和0.01水平達到顯著和極顯著。Note：* and ** indicate the correlation was significant and extremely significant at 0.05 and 0.01 level, respectively.圖1 熒光參數(shù)與葉綠素含量相關(guān)矩陣圖Fig.1 Correlation matrix between fluorescence parameters and chlorophyll content

2.3 基于熒光參數(shù)的葉綠素含量模型構(gòu)建

通過相關(guān)性分析，篩選出7個與葉綠素相關(guān)關(guān)系較大的熒光參數(shù)作為自變量，葉綠素含量作為因變量，通過建立指數(shù)方程、線性方程、對數(shù)方程、多項式方程和冪函數(shù)方程，篩選出各熒光參數(shù)決定系數(shù)最大的回歸方程，結(jié)果如表4所示。建立的所有回歸方程R2在0.562 5～0.713 9之間，其中以VJ和ψEO為自變量建立的模型R2最小，R2均為0.562 5，且回歸模型均為多項式回歸；以ETo/CSM為自變量建立的冪函數(shù)模型R2最大，為0.713 9，表明該模型具有較好的預測效果。

表4 不同熒光參數(shù)的葉綠素含量監(jiān)測模型Table 4 Chlorophyll content monitoring models with different fluorescence parameters

2.4 基于熒光參數(shù)的葉綠素含量多元回歸模型構(gòu)建

由于葉綠素受多種基因控制，其含量可能受多種熒光影響，因此，建立葉綠素含量多元回歸模型具有重要意義。以篩選出的7個與葉綠素相關(guān)關(guān)系較大的熒光參數(shù)與葉綠素含量建立多元逐步回歸模型如下：

y=-0.138x1+2.154x2+0.002x3+

0.077x4+0.076(R2=0.694)

式中，x1為Fv/Fo；x2為φPO；x3為ETO/CSM；x4為PIABS。回歸方程決定系數(shù)R2為0.694，具有較好的預測性。

2.5 模型的檢驗

為了驗證模型的精確性和準確性，利用驗證集的熒光參數(shù)分別代入各模型，計算葉綠素含量預測值，然后利用預測值與實測值建立1∶1圖(圖2)，根據(jù)R2、RMSE、RPD對模型進行綜合評價。

由圖2可知，多元逐步回歸模型預測值和實測值離 1∶1 線較近，該模型的決定系數(shù)R2為 0.805 8， 預測殘差RPD最大，為1.773 8，均方根誤差RMSE最小，為0.293 4，表明多元回歸模型預測效果最佳。

圖2 葉綠素含量預測值與實測值1∶1線性圖Fig.2 1∶1 linear diagram of predicted and measured chlorophyll content

2.6 熒光參數(shù)的通徑分析

通過葉綠素含量多元逐步回歸模型，獲得通徑系數(shù)(表5)。結(jié)果表明，4個自變量對葉綠素含量的直接作用中，ETO/CSM對葉綠素含量直接作用最大，φPO次之，F(xiàn)v/Fo對葉綠素含量起直接負作用，PIABS直接作用最小。通過分析間接通徑系數(shù)可知，ETO/CSM通過φPO對葉綠素含量的間接作用較大，二者的間接通徑系數(shù)為0.325；φPO與ETO/CSM間接通徑系數(shù)最大，為0.601，表明φPO通過ETO/CSM對葉綠素含量具有較大的作用；ETO/CSM、φPO、PIABS三個熒光參數(shù)通過Fv/Fo均對葉綠素含量起負作用。

表5 熒光參數(shù)與葉綠素含量的通徑分析Table 5 Path analysis of fluorescence parameters and chlorophyll content

3 討論

本試驗將黃淮海不同大豆品種作為研究對象在2020-2021年分兩年進行研究。因品種間地理跨度大，遺傳基礎(chǔ)不同，導致品種間生長發(fā)育的進程不同，機體內(nèi)葉綠素含量等生理指標差異明顯；同時用兩年數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，表明兩年數(shù)據(jù)時間上也有差異性。鼓粒期是大豆產(chǎn)量和品質(zhì)形成的重要生育時期[21]，大豆在鼓粒期進行蛋白質(zhì)和脂肪的貯藏。胡鐵歡等[22]研究指出大豆在鼓粒期受干旱脅迫后，百粒重降低20%，產(chǎn)量平均下降4%，脂肪含量增長1%，蛋白質(zhì)含量顯著降低。本研究選用鼓粒期的大豆葉綠素進行研究具有可行性。

光合作用是作物產(chǎn)量和品質(zhì)形成的基礎(chǔ)，作物中有機物的95%來源于光合作用[23]。葉綠素熒光參數(shù)和光合作用中各種反應過程密切相關(guān)[24]。光合作用的能量變化可以通過葉綠素熒光誘導動力學曲線來反映。葉綠素熒光動力曲線獲取及導出的熒光參數(shù)可以表征葉綠素含量的變化。葉綠素熒光能夠靈敏地反映葉片光合作用的變化，是研究光合作用的探針[25-27]。本研究發(fā)現(xiàn)，對葉綠素含量影響最大的熒光參數(shù)為ETO/CSM，φPO(Fv/Fm)次之，F(xiàn)v/Fo對葉綠素含量起直接負作用，PIABS直接作用最小。前人對冬小麥熒光參數(shù)與葉綠素含量做了相關(guān)的研究，如楊程等[13]研究發(fā)現(xiàn)冬小麥SPAD值與RC/CSM、ETO/CSM和φPO呈極顯著正相關(guān)，所篩選的熒光參數(shù)與本試驗篩選的熒光參數(shù)都包括ETO/CSM和φPO，這主要是由于ETO/CSM表征tFM單位葉截面電子傳遞的能量通量；φPO反映了光系統(tǒng)Ⅱ(photosystem Ⅱ, PSⅡ)反應中心吸收光子后捕獲能量的能力，所以ETO/CSM、φPO都與植物的光合效率有關(guān)，而葉綠素含量的高低反映了植物光合效率的強弱，光合效率的變化會影響光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化，最主要表現(xiàn)是引起熒光參數(shù)的變化[28]，因此，ETO/CSM和φPO為本研究篩選的熒光參數(shù)。不同的是，楊程等[13]研究表明以RC/CSM為自變量建立的SPAD模型效果最佳，而本研究則是以ETO/CSM、φPO、Fv/Fo和PIABS建立的多元回歸模型效果最佳，原因可能是本研究與其研究作物及葉綠素測定方法不同，加之大豆葉綠素受多基因控制，并受多種熒光參數(shù)共同影響。另外，王正航等[29]研究發(fā)現(xiàn)小麥開花期的葉綠素含量與熒光參數(shù)Fo、Fm、Fv、Fv/Fo、φPO呈極顯著相關(guān)，本研究通過通徑分析同樣發(fā)現(xiàn)Fv/Fo對葉綠素含量起直接負作用，φPO對葉綠素含量起較大的直接作用，可見這兩個熒光參數(shù)能夠反映一定的光合能力。楊峰等[30]在根腐病脅迫下，研究了大豆葉片熒光參數(shù)與葉綠素含量的關(guān)系，結(jié)果表明φPO與葉綠素含量的相關(guān)系數(shù)達到了0.952，而本研究中φPO與葉綠素含量直接通徑系數(shù)為0.382，排第二，差異可能是由本研究所用大豆未受根腐病脅迫所致。

通過對比8個模型的R2及驗證模型的R2、RMSE、RPD，表明多元逐步回歸模型y=-0.138x1+2.154x2+0.002x3+0.077x4+0.076(R2=0.694)(x1為Fv/Fo；x2為φPO；x3為ETO/CSM；x4為PIABS；y為葉綠素含量)的預測效果最佳。但植物在受到逆境脅迫，如干旱脅迫[31]、鹽脅迫[32-34]、冷凍脅迫[35]時，其熒光參數(shù)和葉綠素含量均會發(fā)生一定的變化，同時，本研究的兩年試驗均是在充足的水肥條件下進行，所建模型可能僅限于在非生物逆境脅迫下進行葉綠素含量的監(jiān)測，因此，該模型具有一定的局限性。后續(xù)研究中可設(shè)置脅迫環(huán)境，進一步延伸本研究內(nèi)容。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，F(xiàn)v/Fo、φPO、ψEO、φEO、ETO/CSM、PIABS、VJ7個熒光參數(shù)與葉綠素含量相關(guān)性較好。多元逐步回歸模型y=-0.138x1+2.154x2+0.002x3+0.077x4+0.076(R2=0.694)(x1為Fv/Fo；x2為φPO；x3為ETO/CSM；x4為PIABS；y為葉綠素含量)優(yōu)于其他模型。該模型彌補了非生物逆境脅迫下，大豆葉綠素熒光監(jiān)測的空白，可以作為葉綠素含量估算的一種有效方法。ETO/CSM對葉綠素含量直接作用最大，φPO次之，F(xiàn)v/Fo對葉綠素含量起直接負作用，PIABS直接作用最小。