李方舟 張海生 楊婷婷 王 軍 古曉紅
(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,山西 太原 030031)
大豆在人類和動(dòng)物脂肪酸及蛋白質(zhì)攝取來源中占有重要地位。大豆不僅是人類第二大食用油來源,同時(shí)也是最大的飼料蛋白來源[1],保證大豆安全生產(chǎn)具有重要意義。據(jù)最新統(tǒng)計(jì),2021—2022年度我國大豆新增供給量為11 240萬噸,而國產(chǎn)大豆產(chǎn)量僅為 1 640 萬噸[2],遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足國民需求,我國需求的大豆主要依賴于進(jìn)口,對(duì)我國大豆產(chǎn)業(yè)造成了巨大影響,因此提高我國大豆產(chǎn)量迫在眉睫[2]。光合作用對(duì)大豆產(chǎn)量具有重要影響,而葉綠素是光合作用必不可少的物質(zhì)[3],同時(shí)也是光合能力、營養(yǎng)脅迫和衰老進(jìn)程各階段的良好指示劑[4],可見測定葉綠素含量對(duì)大豆產(chǎn)量及健康狀況監(jiān)測具有重要意義[5]。
常見的葉綠素含量測定方法有三種:第一種為比色法[6-7],主要是將葉片粉碎后用乙醇或丙酮提取葉綠素,然后用分光光度計(jì)進(jìn)行比色測定,該方法能夠準(zhǔn)確測定葉綠素a/b和類胡蘿卜素含量,但測定時(shí)間長且測定過程繁瑣;第二種是用葉綠素計(jì)測定葉綠素的相對(duì)含量[8-9],該方法操作簡單,時(shí)效性強(qiáng),不需要破壞植株,應(yīng)用較為廣泛;第三種是通過建立光譜模型來估算葉綠素含量[10-12],該方法常用于遙感監(jiān)測領(lǐng)域,具有無損、及時(shí)、大面積監(jiān)測等優(yōu)點(diǎn)。前人已就上述方法做了大量研究,但通過葉綠素?zé)晒鈪?shù)來估算葉綠素含量鮮有報(bào)道,該方法可實(shí)現(xiàn)葉綠素含量和葉片光合性能同步研究。如楊程等[13]建立了小麥葉綠素含量的估算方法,指出可以利用t=tFm時(shí),單位葉截面的反應(yīng)中心(reaction center of unit cross section,RC/CSM),通過線性模型估算冬小麥葉片土壤與作物分析開發(fā)(soil and plant analyzer development, SPAD)值;楊艷陽等[14]研究發(fā)現(xiàn)茶鮮葉的葉綠素含量與685 nm處的熒光強(qiáng)度顯著相關(guān);王藝斐等[15]指出隨著銀杏葉片葉綠素含量的降低,PSⅡ最大光化學(xué)效率(maximal photochemical efficiency of PSⅡ,Fv/Fm)會(huì)顯著下降,其他熒光參數(shù)也發(fā)生明顯變化。在熒光參數(shù)方面,學(xué)者們主要研究逆境脅迫對(duì)植株熒光參數(shù)的影響,如原向陽等[16]研究指出缺磷脅迫下4.98 mL·L-1草甘膦處理的大豆葉片最大熒光(maximal fluorescence,Fm)、Fv/Fm呈下降趨勢(shì)。王征宏等[17]指出,NaCl脅迫下大豆葉片可變熒光與初始熒光比(ratio of rate constants for photochemical reaction and nonphotochemical deactivation of PSII excitations,Fv/Fo)、Fv/Fm均顯著降低。通過熒光參數(shù)估算大豆葉綠素含量還鮮見報(bào)道,因此本研究在大豆鼓粒期對(duì)葉片葉綠素含量與熒光參數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析,篩選出相關(guān)性極顯著的熒光參數(shù),建立并驗(yàn)證葉綠素含量監(jiān)測模型,并通過通徑分析對(duì)熒光參數(shù)排序,以期為大豆葉片葉綠素含量監(jiān)測提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。
本研究在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)東陽試驗(yàn)基地進(jìn)行。該地區(qū)平均海拔800 m,氣候類型為暖溫帶半濕潤大陸性季風(fēng)氣候,無霜期158 d,年平均氣溫9.8℃,夏季炎熱多雨,年平均降水量415~483 mm,年日照時(shí)數(shù)2 662 h[18]。
本研究于2020—2021年開展試驗(yàn)。2020年設(shè)置50個(gè)小區(qū),2021年設(shè)置55個(gè)小區(qū),分別種植黃淮海不同大豆品種(表1),小區(qū)行長6 m,寬3 m,大豆行距50 cm,株距20 cm。根據(jù)當(dāng)?shù)貧夂蚣按蠖归L勢(shì),進(jìn)行間苗、中耕、灌溉、施肥。在大豆鼓粒期分別測量葉片葉綠素含量和熒光參數(shù),獲得105個(gè)樣本數(shù)據(jù),按照葉綠素含量從小到大順序依次進(jìn)行樣本排列,從第3個(gè)樣本起每隔2個(gè)樣本選取一個(gè)作為驗(yàn)證集,最后選取結(jié)果為70個(gè)樣本作為建模集,35個(gè)樣本作為驗(yàn)證集。建模集中剔除7個(gè)異常樣本,剩余63個(gè)樣本;驗(yàn)證集中剔除7個(gè)異常樣本,剩余28個(gè)樣本。
表1 本研究選用大豆品種Table 1 Soybean varieties selected in this study
每小區(qū)選取生長一致的5株大豆植株,取其上部1完全展開葉片,進(jìn)行暗處理30 min,用Handy PEA植物效率分析儀(英國Hansatech公司)測定其葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線,每片葉片重復(fù)測定3次,計(jì)算熒光參數(shù)(表2),取其5片葉片平均值作為該小區(qū)的葉綠素?zé)晒鈪?shù)。
表2 熒光參數(shù)及表征意義Table 2 Fluorescence parameters and characterization significance
表1(續(xù))
將采集的葉片放入密封袋低溫保存,帶回實(shí)驗(yàn)室,用UV-1800型紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)測量葉片在665、649、470 nm處的吸光度,利用以下公式計(jì)算葉綠素含量[19]。
LCT=LCa+LCb
式中,LCa(leaf chlorophyll a content)為葉片葉綠素a的含量;LCb(leaf chlorophyll b content)為葉片葉綠素b的含量;LCT(leaf total chlorophyll content)為葉片總?cè)~綠素的含量;A665和A649分別為光合色素溶液在665和649 nm處的吸光度;V為提取液的體積;FW(fresh weight)為葉片鮮重。取小區(qū)5片葉的葉綠素含量平均值作為該小區(qū)的葉綠素含量。
利用Origin 2021軟件對(duì)葉綠素含量與熒光參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析,用Excel 2010建立葉綠素監(jiān)測模型,用SPSS 19軟件構(gòu)建多元逐步回歸模型并進(jìn)行通徑分析,通過驗(yàn)證集對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證,依據(jù)決定系數(shù)(coefficient of determination,R2)、均方根誤差(root mean squared error, RMSE)、預(yù)測殘差(residual prediction difference, RPD)對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。其中R2越接近1,RMSE越小,表明模型預(yù)測精度越高;當(dāng)RPD>1.4時(shí),具有較好的預(yù)測能力,當(dāng)RPD<1.4時(shí),預(yù)測能力較差[20]。
式中,n為樣本總數(shù);p為模型的變量個(gè)數(shù);Yi為實(shí)測值;Yi′為預(yù)測值。
由表3可知,建模集63個(gè)樣本中葉綠素含量最大值為3.14,最小值為1.04,均值為2.07,標(biāo)準(zhǔn)差為0.51,變異系數(shù)為0.25;驗(yàn)證集28個(gè)樣本中葉綠素含量最大值為3.08,最小值為1.05,均值為1.90,標(biāo)準(zhǔn)差為0.53,變異系數(shù)為0.28。建模集葉綠素含量的范圍較驗(yàn)證集大,而均值和標(biāo)準(zhǔn)差相差不大,為模型的建立和驗(yàn)證提供了理論基礎(chǔ)。全部集的統(tǒng)計(jì)描述均與建模集、驗(yàn)證集相差較小,且變異系數(shù)均較小,表明模型具有可行性。
表3 大豆葉片葉綠素含量描述性統(tǒng)計(jì)分析Table 3 Descriptive statistical analysis for chlorophyll content of soybean leaves
對(duì)所選的29個(gè)熒光參數(shù)與葉綠素含量進(jìn)行相關(guān)分析,繪制相關(guān)系數(shù)圖,如圖1所示。16個(gè)熒光參數(shù)與葉綠素含量呈正相關(guān)關(guān)系,除VI、Sm與葉綠素含量不顯著相關(guān)外,其他14個(gè)熒光參數(shù)均與葉綠素含量達(dá)到極顯著正相關(guān),其中Fv/Fo、φPO、ψEO、φEO、ETO/CSM和PIABS的相關(guān)系數(shù)較大,分別為0.78、0.76、0.75、0.80、0.82和0.77。13個(gè)熒光參數(shù)與葉綠素含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,除tFM、N與葉綠素含量不顯著相關(guān)外,其他11個(gè)熒光參數(shù)均與葉綠素含量達(dá)到極顯著負(fù)相關(guān),其中VJ的相關(guān)系數(shù)較大,為-0.75。
注:*和**分別表示相關(guān)性在0.05和0.01水平達(dá)到顯著和極顯著。Note:* and ** indicate the correlation was significant and extremely significant at 0.05 and 0.01 level, respectively.圖1 熒光參數(shù)與葉綠素含量相關(guān)矩陣圖Fig.1 Correlation matrix between fluorescence parameters and chlorophyll content
通過相關(guān)性分析,篩選出7個(gè)與葉綠素相關(guān)關(guān)系較大的熒光參數(shù)作為自變量,葉綠素含量作為因變量,通過建立指數(shù)方程、線性方程、對(duì)數(shù)方程、多項(xiàng)式方程和冪函數(shù)方程,篩選出各熒光參數(shù)決定系數(shù)最大的回歸方程,結(jié)果如表4所示。建立的所有回歸方程R2在0.562 5~0.713 9之間,其中以VJ和ψEO為自變量建立的模型R2最小,R2均為0.562 5,且回歸模型均為多項(xiàng)式回歸;以ETo/CSM為自變量建立的冪函數(shù)模型R2最大,為0.713 9,表明該模型具有較好的預(yù)測效果。
表4 不同熒光參數(shù)的葉綠素含量監(jiān)測模型Table 4 Chlorophyll content monitoring models with different fluorescence parameters
由于葉綠素受多種基因控制,其含量可能受多種熒光影響,因此,建立葉綠素含量多元回歸模型具有重要意義。以篩選出的7個(gè)與葉綠素相關(guān)關(guān)系較大的熒光參數(shù)與葉綠素含量建立多元逐步回歸模型如下:
y=-0.138x1+2.154x2+0.002x3+
0.077x4+0.076(R2=0.694)
式中,x1為Fv/Fo;x2為φPO;x3為ETO/CSM;x4為PIABS?;貧w方程決定系數(shù)R2為0.694,具有較好的預(yù)測性。
為了驗(yàn)證模型的精確性和準(zhǔn)確性,利用驗(yàn)證集的熒光參數(shù)分別代入各模型,計(jì)算葉綠素含量預(yù)測值,然后利用預(yù)測值與實(shí)測值建立1∶1圖(圖2),根據(jù)R2、RMSE、RPD對(duì)模型進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。
由圖2可知,多元逐步回歸模型預(yù)測值和實(shí)測值離 1∶1 線較近,該模型的決定系數(shù)R2為 0.805 8, 預(yù)測殘差RPD最大,為1.773 8,均方根誤差RMSE最小,為0.293 4,表明多元回歸模型預(yù)測效果最佳。
圖2 葉綠素含量預(yù)測值與實(shí)測值1∶1線性圖Fig.2 1∶1 linear diagram of predicted and measured chlorophyll content
通過葉綠素含量多元逐步回歸模型,獲得通徑系數(shù)(表5)。結(jié)果表明,4個(gè)自變量對(duì)葉綠素含量的直接作用中,ETO/CSM對(duì)葉綠素含量直接作用最大,φPO次之,F(xiàn)v/Fo對(duì)葉綠素含量起直接負(fù)作用,PIABS直接作用最小。通過分析間接通徑系數(shù)可知,ETO/CSM通過φPO對(duì)葉綠素含量的間接作用較大,二者的間接通徑系數(shù)為0.325;φPO與ETO/CSM間接通徑系數(shù)最大,為0.601,表明φPO通過ETO/CSM對(duì)葉綠素含量具有較大的作用;ETO/CSM、φPO、PIABS三個(gè)熒光參數(shù)通過Fv/Fo均對(duì)葉綠素含量起負(fù)作用。
表5 熒光參數(shù)與葉綠素含量的通徑分析Table 5 Path analysis of fluorescence parameters and chlorophyll content
本試驗(yàn)將黃淮海不同大豆品種作為研究對(duì)象在2020-2021年分兩年進(jìn)行研究。因品種間地理跨度大,遺傳基礎(chǔ)不同,導(dǎo)致品種間生長發(fā)育的進(jìn)程不同,機(jī)體內(nèi)葉綠素含量等生理指標(biāo)差異明顯;同時(shí)用兩年數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,表明兩年數(shù)據(jù)時(shí)間上也有差異性。鼓粒期是大豆產(chǎn)量和品質(zhì)形成的重要生育時(shí)期[21],大豆在鼓粒期進(jìn)行蛋白質(zhì)和脂肪的貯藏。胡鐵歡等[22]研究指出大豆在鼓粒期受干旱脅迫后,百粒重降低20%,產(chǎn)量平均下降4%,脂肪含量增長1%,蛋白質(zhì)含量顯著降低。本研究選用鼓粒期的大豆葉綠素進(jìn)行研究具有可行性。
光合作用是作物產(chǎn)量和品質(zhì)形成的基礎(chǔ),作物中有機(jī)物的95%來源于光合作用[23]。葉綠素?zé)晒鈪?shù)和光合作用中各種反應(yīng)過程密切相關(guān)[24]。光合作用的能量變化可以通過葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線來反映。葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力曲線獲取及導(dǎo)出的熒光參數(shù)可以表征葉綠素含量的變化。葉綠素?zé)晒饽軌蜢`敏地反映葉片光合作用的變化,是研究光合作用的探針[25-27]。本研究發(fā)現(xiàn),對(duì)葉綠素含量影響最大的熒光參數(shù)為ETO/CSM,φPO(Fv/Fm)次之,F(xiàn)v/Fo對(duì)葉綠素含量起直接負(fù)作用,PIABS直接作用最小。前人對(duì)冬小麥熒光參數(shù)與葉綠素含量做了相關(guān)的研究,如楊程等[13]研究發(fā)現(xiàn)冬小麥SPAD值與RC/CSM、ETO/CSM和φPO呈極顯著正相關(guān),所篩選的熒光參數(shù)與本試驗(yàn)篩選的熒光參數(shù)都包括ETO/CSM和φPO,這主要是由于ETO/CSM表征tFM單位葉截面電子傳遞的能量通量;φPO反映了光系統(tǒng)Ⅱ(photosystem Ⅱ, PSⅡ)反應(yīng)中心吸收光子后捕獲能量的能力,所以ETO/CSM、φPO都與植物的光合效率有關(guān),而葉綠素含量的高低反映了植物光合效率的強(qiáng)弱,光合效率的變化會(huì)影響光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化,最主要表現(xiàn)是引起熒光參數(shù)的變化[28],因此,ETO/CSM和φPO為本研究篩選的熒光參數(shù)。不同的是,楊程等[13]研究表明以RC/CSM為自變量建立的SPAD模型效果最佳,而本研究則是以ETO/CSM、φPO、Fv/Fo和PIABS建立的多元回歸模型效果最佳,原因可能是本研究與其研究作物及葉綠素測定方法不同,加之大豆葉綠素受多基因控制,并受多種熒光參數(shù)共同影響。另外,王正航等[29]研究發(fā)現(xiàn)小麥開花期的葉綠素含量與熒光參數(shù)Fo、Fm、Fv、Fv/Fo、φPO呈極顯著相關(guān),本研究通過通徑分析同樣發(fā)現(xiàn)Fv/Fo對(duì)葉綠素含量起直接負(fù)作用,φPO對(duì)葉綠素含量起較大的直接作用,可見這兩個(gè)熒光參數(shù)能夠反映一定的光合能力。楊峰等[30]在根腐病脅迫下,研究了大豆葉片熒光參數(shù)與葉綠素含量的關(guān)系,結(jié)果表明φPO與葉綠素含量的相關(guān)系數(shù)達(dá)到了0.952,而本研究中φPO與葉綠素含量直接通徑系數(shù)為0.382,排第二,差異可能是由本研究所用大豆未受根腐病脅迫所致。
通過對(duì)比8個(gè)模型的R2及驗(yàn)證模型的R2、RMSE、RPD,表明多元逐步回歸模型y=-0.138x1+2.154x2+0.002x3+0.077x4+0.076(R2=0.694)(x1為Fv/Fo;x2為φPO;x3為ETO/CSM;x4為PIABS;y為葉綠素含量)的預(yù)測效果最佳。但植物在受到逆境脅迫,如干旱脅迫[31]、鹽脅迫[32-34]、冷凍脅迫[35]時(shí),其熒光參數(shù)和葉綠素含量均會(huì)發(fā)生一定的變化,同時(shí),本研究的兩年試驗(yàn)均是在充足的水肥條件下進(jìn)行,所建模型可能僅限于在非生物逆境脅迫下進(jìn)行葉綠素含量的監(jiān)測,因此,該模型具有一定的局限性。后續(xù)研究中可設(shè)置脅迫環(huán)境,進(jìn)一步延伸本研究內(nèi)容。
本研究結(jié)果表明,F(xiàn)v/Fo、φPO、ψEO、φEO、ETO/CSM、PIABS、VJ7個(gè)熒光參數(shù)與葉綠素含量相關(guān)性較好。多元逐步回歸模型y=-0.138x1+2.154x2+0.002x3+0.077x4+0.076(R2=0.694)(x1為Fv/Fo;x2為φPO;x3為ETO/CSM;x4為PIABS;y為葉綠素含量)優(yōu)于其他模型。該模型彌補(bǔ)了非生物逆境脅迫下,大豆葉綠素?zé)晒獗O(jiān)測的空白,可以作為葉綠素含量估算的一種有效方法。ETO/CSM對(duì)葉綠素含量直接作用最大,φPO次之,F(xiàn)v/Fo對(duì)葉綠素含量起直接負(fù)作用,PIABS直接作用最小。