李方舟 張海生 楊婷婷 王 軍 古曉紅

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太原 030031)

大豆在人類(lèi)和動(dòng)物脂肪酸及蛋白質(zhì)攝取來(lái)源中占有重要地位。大豆不僅是人類(lèi)第二大食用油來(lái)源，同時(shí)也是最大的飼料蛋白來(lái)源[1]，保證大豆安全生產(chǎn)具有重要意義。據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，2021—2022年度我國(guó)大豆新增供給量為11 240萬(wàn)噸，而國(guó)產(chǎn)大豆產(chǎn)量?jī)H為 1 640 萬(wàn)噸[2]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足國(guó)民需求，我國(guó)需求的大豆主要依賴(lài)于進(jìn)口，對(duì)我國(guó)大豆產(chǎn)業(yè)造成了巨大影響，因此提高我國(guó)大豆產(chǎn)量迫在眉睫[2]。光合作用對(duì)大豆產(chǎn)量具有重要影響，而葉綠素是光合作用必不可少的物質(zhì)[3]，同時(shí)也是光合能力、營(yíng)養(yǎng)脅迫和衰老進(jìn)程各階段的良好指示劑[4]，可見(jiàn)測(cè)定葉綠素含量對(duì)大豆產(chǎn)量及健康狀況監(jiān)測(cè)具有重要意義[5]。

常見(jiàn)的葉綠素含量測(cè)定方法有三種：第一種為比色法[6-7]，主要是將葉片粉碎后用乙醇或丙酮提取葉綠素，然后用分光光度計(jì)進(jìn)行比色測(cè)定，該方法能夠準(zhǔn)確測(cè)定葉綠素a/b和類(lèi)胡蘿卜素含量，但測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)且測(cè)定過(guò)程繁瑣；第二種是用葉綠素計(jì)測(cè)定葉綠素的相對(duì)含量[8-9]，該方法操作簡(jiǎn)單，時(shí)效性強(qiáng)，不需要破壞植株，應(yīng)用較為廣泛；第三種是通過(guò)建立光譜模型來(lái)估算葉綠素含量[10-12]，該方法常用于遙感監(jiān)測(cè)領(lǐng)域，具有無(wú)損、及時(shí)、大面積監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。前人已就上述方法做了大量研究，但通過(guò)葉綠素?zé)晒鈪?shù)來(lái)估算葉綠素含量鮮有報(bào)道，該方法可實(shí)現(xiàn)葉綠素含量和葉片光合性能同步研究。如楊程等[13]建立了小麥葉綠素含量的估算方法，指出可以利用t=tFm時(shí)，單位葉截面的反應(yīng)中心(reaction center of unit cross section,RC/CSM)，通過(guò)線(xiàn)性模型估算冬小麥葉片土壤與作物分析開(kāi)發(fā)(soil and plant analyzer development, SPAD)值；楊艷陽(yáng)等[14]研究發(fā)現(xiàn)茶鮮葉的葉綠素含量與685 nm處的熒光強(qiáng)度顯著相關(guān)；王藝斐等[15]指出隨著銀杏葉片葉綠素含量的降低，PSⅡ最大光化學(xué)效率(maximal photochemical efficiency of PSⅡ,Fv/Fm)會(huì)顯著下降，其他熒光參數(shù)也發(fā)生明顯變化。在熒光參數(shù)方面，學(xué)者們主要研究逆境脅迫對(duì)植株熒光參數(shù)的影響，如原向陽(yáng)等[16]研究指出缺磷脅迫下4.98 mL·L-1草甘膦處理的大豆葉片最大熒光(maximal fluorescence,Fm)、Fv/Fm呈下降趨勢(shì)。王征宏等[17]指出，NaCl脅迫下大豆葉片可變熒光與初始熒光比(ratio of rate constants for photochemical reaction and nonphotochemical deactivation of PSII excitations,Fv/Fo)、Fv/Fm均顯著降低。通過(guò)熒光參數(shù)估算大豆葉綠素含量還鮮見(jiàn)報(bào)道，因此本研究在大豆鼓粒期對(duì)葉片葉綠素含量與熒光參數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析，篩選出相關(guān)性極顯著的熒光參數(shù)，建立并驗(yàn)證葉綠素含量監(jiān)測(cè)模型，并通過(guò)通徑分析對(duì)熒光參數(shù)排序，以期為大豆葉片葉綠素含量監(jiān)測(cè)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

本研究在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)東陽(yáng)試驗(yàn)基地進(jìn)行。該地區(qū)平均海拔800 m，氣候類(lèi)型為暖溫帶半濕潤(rùn)大陸性季風(fēng)氣候，無(wú)霜期158 d，年平均氣溫9.8℃，夏季炎熱多雨，年平均降水量415～483 mm，年日照時(shí)數(shù)2 662 h[18]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究于2020—2021年開(kāi)展試驗(yàn)。2020年設(shè)置50個(gè)小區(qū)，2021年設(shè)置55個(gè)小區(qū)，分別種植黃淮海不同大豆品種(表1)，小區(qū)行長(zhǎng)6 m，寬3 m，大豆行距50 cm，株距20 cm。根據(jù)當(dāng)?shù)貧夂蚣按蠖归L(zhǎng)勢(shì)，進(jìn)行間苗、中耕、灌溉、施肥。在大豆鼓粒期分別測(cè)量葉片葉綠素含量和熒光參數(shù)，獲得105個(gè)樣本數(shù)據(jù)，按照葉綠素含量從小到大順序依次進(jìn)行樣本排列，從第3個(gè)樣本起每隔2個(gè)樣本選取一個(gè)作為驗(yàn)證集，最后選取結(jié)果為70個(gè)樣本作為建模集，35個(gè)樣本作為驗(yàn)證集。建模集中剔除7個(gè)異常樣本，剩余63個(gè)樣本；驗(yàn)證集中剔除7個(gè)異常樣本，剩余28個(gè)樣本。

表1 本研究選用大豆品種Table 1 Soybean varieties selected in this study

1.3 大豆葉綠素和熒光參數(shù)的測(cè)定

每小區(qū)選取生長(zhǎng)一致的5株大豆植株，取其上部1完全展開(kāi)葉片，進(jìn)行暗處理30 min，用Handy PEA植物效率分析儀(英國(guó)Hansatech公司)測(cè)定其葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)，每片葉片重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算熒光參數(shù)(表2)，取其5片葉片平均值作為該小區(qū)的葉綠素?zé)晒鈪?shù)。

表2 熒光參數(shù)及表征意義Table 2 Fluorescence parameters and characterization significance

表1(續(xù))

將采集的葉片放入密封袋低溫保存，帶回實(shí)驗(yàn)室，用UV-1800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)測(cè)量葉片在665、649、470 nm處的吸光度，利用以下公式計(jì)算葉綠素含量[19]。

LCT=LCa+LCb

式中，LCa(leaf chlorophyll a content)為葉片葉綠素a的含量；LCb(leaf chlorophyll b content)為葉片葉綠素b的含量；LCT(leaf total chlorophyll content)為葉片總?cè)~綠素的含量；A665和A649分別為光合色素溶液在665和649 nm處的吸光度；V為提取液的體積；FW(fresh weight)為葉片鮮重。取小區(qū)5片葉的葉綠素含量平均值作為該小區(qū)的葉綠素含量。

1.4 模型的構(gòu)建與檢驗(yàn)

利用Origin 2021軟件對(duì)葉綠素含量與熒光參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，用Excel 2010建立葉綠素監(jiān)測(cè)模型，用SPSS 19軟件構(gòu)建多元逐步回歸模型并進(jìn)行通徑分析，通過(guò)驗(yàn)證集對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，依據(jù)決定系數(shù)(coefficient of determination,R2)、均方根誤差(root mean squared error, RMSE)、預(yù)測(cè)殘差(residual prediction difference, RPD)對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。其中R2越接近1，RMSE越小，表明模型預(yù)測(cè)精度越高；當(dāng)RPD>1.4時(shí)，具有較好的預(yù)測(cè)能力，當(dāng)RPD<1.4時(shí)，預(yù)測(cè)能力較差[20]。

式中，n為樣本總數(shù)；p為模型的變量個(gè)數(shù)；Yi為實(shí)測(cè)值；Yi′為預(yù)測(cè)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素描述性統(tǒng)計(jì)分析

由表3可知，建模集63個(gè)樣本中葉綠素含量最大值為3.14，最小值為1.04，均值為2.07，標(biāo)準(zhǔn)差為0.51，變異系數(shù)為0.25；驗(yàn)證集28個(gè)樣本中葉綠素含量最大值為3.08，最小值為1.05，均值為1.90，標(biāo)準(zhǔn)差為0.53，變異系數(shù)為0.28。建模集葉綠素含量的范圍較驗(yàn)證集大，而均值和標(biāo)準(zhǔn)差相差不大，為模型的建立和驗(yàn)證提供了理論基礎(chǔ)。全部集的統(tǒng)計(jì)描述均與建模集、驗(yàn)證集相差較小，且變異系數(shù)均較小，表明模型具有可行性。

表3 大豆葉片葉綠素含量描述性統(tǒng)計(jì)分析Table 3 Descriptive statistical analysis for chlorophyll content of soybean leaves

2.2 相關(guān)性分析

對(duì)所選的29個(gè)熒光參數(shù)與葉綠素含量進(jìn)行相關(guān)分析，繪制相關(guān)系數(shù)圖，如圖1所示。16個(gè)熒光參數(shù)與葉綠素含量呈正相關(guān)關(guān)系，除VI、Sm與葉綠素含量不顯著相關(guān)外，其他14個(gè)熒光參數(shù)均與葉綠素含量達(dá)到極顯著正相關(guān)，其中Fv/Fo、φPO、ψEO、φEO、ETO/CSM和PIABS的相關(guān)系數(shù)較大，分別為0.78、0.76、0.75、0.80、0.82和0.77。13個(gè)熒光參數(shù)與葉綠素含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，除tFM、N與葉綠素含量不顯著相關(guān)外，其他11個(gè)熒光參數(shù)均與葉綠素含量達(dá)到極顯著負(fù)相關(guān)，其中VJ的相關(guān)系數(shù)較大，為-0.75。

注：*和**分別表示相關(guān)性在0.05和0.01水平達(dá)到顯著和極顯著。Note：* and ** indicate the correlation was significant and extremely significant at 0.05 and 0.01 level, respectively.圖1 熒光參數(shù)與葉綠素含量相關(guān)矩陣圖Fig.1 Correlation matrix between fluorescence parameters and chlorophyll content

2.3 基于熒光參數(shù)的葉綠素含量模型構(gòu)建

通過(guò)相關(guān)性分析，篩選出7個(gè)與葉綠素相關(guān)關(guān)系較大的熒光參數(shù)作為自變量，葉綠素含量作為因變量，通過(guò)建立指數(shù)方程、線(xiàn)性方程、對(duì)數(shù)方程、多項(xiàng)式方程和冪函數(shù)方程，篩選出各熒光參數(shù)決定系數(shù)最大的回歸方程，結(jié)果如表4所示。建立的所有回歸方程R2在0.562 5～0.713 9之間，其中以VJ和ψEO為自變量建立的模型R2最小，R2均為0.562 5，且回歸模型均為多項(xiàng)式回歸；以ETo/CSM為自變量建立的冪函數(shù)模型R2最大，為0.713 9，表明該模型具有較好的預(yù)測(cè)效果。

表4 不同熒光參數(shù)的葉綠素含量監(jiān)測(cè)模型Table 4 Chlorophyll content monitoring models with different fluorescence parameters

2.4 基于熒光參數(shù)的葉綠素含量多元回歸模型構(gòu)建

由于葉綠素受多種基因控制，其含量可能受多種熒光影響，因此，建立葉綠素含量多元回歸模型具有重要意義。以篩選出的7個(gè)與葉綠素相關(guān)關(guān)系較大的熒光參數(shù)與葉綠素含量建立多元逐步回歸模型如下：

y=-0.138x1+2.154x2+0.002x3+

0.077x4+0.076(R2=0.694)

式中，x1為Fv/Fo；x2為φPO；x3為ETO/CSM；x4為PIABS?；貧w方程決定系數(shù)R2為0.694，具有較好的預(yù)測(cè)性。

2.5 模型的檢驗(yàn)

為了驗(yàn)證模型的精確性和準(zhǔn)確性，利用驗(yàn)證集的熒光參數(shù)分別代入各模型，計(jì)算葉綠素含量預(yù)測(cè)值，然后利用預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值建立1∶1圖(圖2)，根據(jù)R2、RMSE、RPD對(duì)模型進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

由圖2可知，多元逐步回歸模型預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值離 1∶1 線(xiàn)較近，該模型的決定系數(shù)R2為 0.805 8， 預(yù)測(cè)殘差RPD最大，為1.773 8，均方根誤差RMSE最小，為0.293 4，表明多元回歸模型預(yù)測(cè)效果最佳。

圖2 葉綠素含量預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值1∶1線(xiàn)性圖Fig.2 1∶1 linear diagram of predicted and measured chlorophyll content

2.6 熒光參數(shù)的通徑分析

通過(guò)葉綠素含量多元逐步回歸模型，獲得通徑系數(shù)(表5)。結(jié)果表明，4個(gè)自變量對(duì)葉綠素含量的直接作用中，ETO/CSM對(duì)葉綠素含量直接作用最大，φPO次之，F(xiàn)v/Fo對(duì)葉綠素含量起直接負(fù)作用，PIABS直接作用最小。通過(guò)分析間接通徑系數(shù)可知，ETO/CSM通過(guò)φPO對(duì)葉綠素含量的間接作用較大，二者的間接通徑系數(shù)為0.325；φPO與ETO/CSM間接通徑系數(shù)最大，為0.601，表明φPO通過(guò)ETO/CSM對(duì)葉綠素含量具有較大的作用；ETO/CSM、φPO、PIABS三個(gè)熒光參數(shù)通過(guò)Fv/Fo均對(duì)葉綠素含量起負(fù)作用。

表5 熒光參數(shù)與葉綠素含量的通徑分析Table 5 Path analysis of fluorescence parameters and chlorophyll content

3 討論

本試驗(yàn)將黃淮海不同大豆品種作為研究對(duì)象在2020-2021年分兩年進(jìn)行研究。因品種間地理跨度大，遺傳基礎(chǔ)不同，導(dǎo)致品種間生長(zhǎng)發(fā)育的進(jìn)程不同，機(jī)體內(nèi)葉綠素含量等生理指標(biāo)差異明顯；同時(shí)用兩年數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，表明兩年數(shù)據(jù)時(shí)間上也有差異性。鼓粒期是大豆產(chǎn)量和品質(zhì)形成的重要生育時(shí)期[21]，大豆在鼓粒期進(jìn)行蛋白質(zhì)和脂肪的貯藏。胡鐵歡等[22]研究指出大豆在鼓粒期受干旱脅迫后，百粒重降低20%，產(chǎn)量平均下降4%，脂肪含量增長(zhǎng)1%，蛋白質(zhì)含量顯著降低。本研究選用鼓粒期的大豆葉綠素進(jìn)行研究具有可行性。

光合作用是作物產(chǎn)量和品質(zhì)形成的基礎(chǔ)，作物中有機(jī)物的95%來(lái)源于光合作用[23]。葉綠素?zé)晒鈪?shù)和光合作用中各種反應(yīng)過(guò)程密切相關(guān)[24]。光合作用的能量變化可以通過(guò)葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)來(lái)反映。葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力曲線(xiàn)獲取及導(dǎo)出的熒光參數(shù)可以表征葉綠素含量的變化。葉綠素?zé)晒饽軌蜢`敏地反映葉片光合作用的變化，是研究光合作用的探針[25-27]。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)葉綠素含量影響最大的熒光參數(shù)為ETO/CSM，φPO(Fv/Fm)次之，F(xiàn)v/Fo對(duì)葉綠素含量起直接負(fù)作用，PIABS直接作用最小。前人對(duì)冬小麥熒光參數(shù)與葉綠素含量做了相關(guān)的研究，如楊程等[13]研究發(fā)現(xiàn)冬小麥SPAD值與RC/CSM、ETO/CSM和φPO呈極顯著正相關(guān)，所篩選的熒光參數(shù)與本試驗(yàn)篩選的熒光參數(shù)都包括ETO/CSM和φPO，這主要是由于ETO/CSM表征tFM單位葉截面電子傳遞的能量通量；φPO反映了光系統(tǒng)Ⅱ(photosystem Ⅱ, PSⅡ)反應(yīng)中心吸收光子后捕獲能量的能力，所以ETO/CSM、φPO都與植物的光合效率有關(guān)，而葉綠素含量的高低反映了植物光合效率的強(qiáng)弱，光合效率的變化會(huì)影響光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化，最主要表現(xiàn)是引起熒光參數(shù)的變化[28]，因此，ETO/CSM和φPO為本研究篩選的熒光參數(shù)。不同的是，楊程等[13]研究表明以RC/CSM為自變量建立的SPAD模型效果最佳，而本研究則是以ETO/CSM、φPO、Fv/Fo和PIABS建立的多元回歸模型效果最佳，原因可能是本研究與其研究作物及葉綠素測(cè)定方法不同，加之大豆葉綠素受多基因控制，并受多種熒光參數(shù)共同影響。另外，王正航等[29]研究發(fā)現(xiàn)小麥開(kāi)花期的葉綠素含量與熒光參數(shù)Fo、Fm、Fv、Fv/Fo、φPO呈極顯著相關(guān)，本研究通過(guò)通徑分析同樣發(fā)現(xiàn)Fv/Fo對(duì)葉綠素含量起直接負(fù)作用，φPO對(duì)葉綠素含量起較大的直接作用，可見(jiàn)這兩個(gè)熒光參數(shù)能夠反映一定的光合能力。楊峰等[30]在根腐病脅迫下，研究了大豆葉片熒光參數(shù)與葉綠素含量的關(guān)系，結(jié)果表明φPO與葉綠素含量的相關(guān)系數(shù)達(dá)到了0.952，而本研究中φPO與葉綠素含量直接通徑系數(shù)為0.382，排第二，差異可能是由本研究所用大豆未受根腐病脅迫所致。

通過(guò)對(duì)比8個(gè)模型的R2及驗(yàn)證模型的R2、RMSE、RPD，表明多元逐步回歸模型y=-0.138x1+2.154x2+0.002x3+0.077x4+0.076(R2=0.694)(x1為Fv/Fo；x2為φPO；x3為ETO/CSM；x4為PIABS；y為葉綠素含量)的預(yù)測(cè)效果最佳。但植物在受到逆境脅迫，如干旱脅迫[31]、鹽脅迫[32-34]、冷凍脅迫[35]時(shí)，其熒光參數(shù)和葉綠素含量均會(huì)發(fā)生一定的變化，同時(shí)，本研究的兩年試驗(yàn)均是在充足的水肥條件下進(jìn)行，所建模型可能僅限于在非生物逆境脅迫下進(jìn)行葉綠素含量的監(jiān)測(cè)，因此，該模型具有一定的局限性。后續(xù)研究中可設(shè)置脅迫環(huán)境，進(jìn)一步延伸本研究?jī)?nèi)容。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，F(xiàn)v/Fo、φPO、ψEO、φEO、ETO/CSM、PIABS、VJ7個(gè)熒光參數(shù)與葉綠素含量相關(guān)性較好。多元逐步回歸模型y=-0.138x1+2.154x2+0.002x3+0.077x4+0.076(R2=0.694)(x1為Fv/Fo；x2為φPO；x3為ETO/CSM；x4為PIABS；y為葉綠素含量)優(yōu)于其他模型。該模型彌補(bǔ)了非生物逆境脅迫下，大豆葉綠素?zé)晒獗O(jiān)測(cè)的空白，可以作為葉綠素含量估算的一種有效方法。ETO/CSM對(duì)葉綠素含量直接作用最大，φPO次之，F(xiàn)v/Fo對(duì)葉綠素含量起直接負(fù)作用，PIABS直接作用最小。