張亦, 王亮, 呂自力, 鄧凱文, 吳濤, 顧雅純, 田會敏, 劉威

（1.江蘇大學食品與生物工程學院, 江蘇鎮(zhèn)江 212013；2.成都中醫(yī)藥大學醫(yī)學與生命科學學院/附屬生殖婦幼醫(yī)院, 成都 610000）

0 引言

乳中富含豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)以及各種生物活性物質(zhì), 被譽為“白色血液”和“接近完善的食品”, 是人類獲取營養(yǎng)的主要途徑之一[1]。牛乳占乳制品市場的95 %, 是人類利用最多的動物乳, 其為人類提供必需營養(yǎng)物質(zhì)[2]。近年來, 隨著人們對乳制品的需求量的增加, 牛乳在生產(chǎn)規(guī)模及營養(yǎng)價值等方面已逐漸不能滿足市場需求。山羊乳口感細膩, 味微甜, 香中帶咸, 被譽為乳中佳品[3]。山羊乳的各項營養(yǎng)元素配比與人乳更為相似, 其消化吸收速度也明顯高于牛乳和母乳[4-5]。并且山羊乳的平均脂肪粒徑小于牛乳的脂肪平均粒徑, 因此山羊乳中的脂肪更容易消化。駱駝乳作為蛋白質(zhì)、必需脂肪酸、維生素B1、鉀、磷和鈣的良好來源之一, 乳中有一種富含半胱氨酸的蛋白, 其一級結構與胰島素蛋白質(zhì)家族極為相似, 能快速通過胃進入腸道循環(huán)。因此, 駱駝乳在抵御糖尿病方面, 可減少對胰島素的依賴, 提高葡萄糖耐力[6]。

奶粉可以保留生乳中大部分的營養(yǎng)物質(zhì), 大幅度降低體積與重量, 延長貨架期, 并減少運輸及儲存的成本。當前, 同時開展以牛奶粉、山羊奶粉及駱駝奶粉為原料的發(fā)酵酸奶的研究較少。牛乳為乳制品行業(yè)中研究應用最多, 且為大眾普遍接受。山羊乳因具有獨特的羊膻味使其發(fā)展受到限制, 但風味與乳中成分密切相關。駱駝乳主要源于沙漠地區(qū), 供應量不足及降血糖等特殊生理功能, 使其價格顯著高于其他兩種乳品。本研究將從營養(yǎng)學與物理化學的角度, 明確3種酸奶的營養(yǎng)價值, 篩選出3種酸奶間具有顯著性的揮發(fā)性差異代謝物, 通過全質(zhì)構以及流變學特性分析, 對3種酸奶的品質(zhì)穩(wěn)定性進行鑒定。3種酸奶制品之間的比較研究, 可以幫助我們更加深入的認識不同原料乳來源的發(fā)酵酸奶之間的區(qū)別, 增加對特種乳的認知, 了解不同特種乳品的品質(zhì)特征。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

DANISCO 300型商業(yè)發(fā)酵劑, 由中國丹尼斯克有限公司提供。

1.1.2 試劑

牛奶粉購自光明乳業(yè)股份有限公司；山羊奶粉購自新西蘭卡瑞特茲有限公司；駱駝奶粉購自新疆源西域生物科技有限公司；De Man Rogosa Sharpe(MRS)培養(yǎng)基購自青島海博生物技術有限公司；1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)自由基、95%乙醇、鹽酸, 苯酚, 檸檬酸鈉緩沖溶液, 茚三酮溶液, 混合氨基酸標準溶液等購自上海生工生物有限責任公司。

1.1.3 儀器與設備

FE20K酸度計, 中國；S-433D氨基酸自動分析儀, 德國；TQ8040氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀, 日本；TA-XT2i質(zhì)構測試儀, 英國；DHR-1旋轉流變儀, 美國。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

牛、山羊、駱駝奶粉分別做5組酸奶, 每組酸奶樣品包括3個平行。按照15%的比例, 分別用50～60℃的水溶解3種奶粉, 攪拌均勻, 即獲得牛、山羊、駱駝復原乳。95℃震蕩水浴5 min, 待復原乳溫度降至室溫后, 按比例0.0024%（質(zhì)量分數(shù)）接種DNASCO 300型商業(yè)發(fā)酵劑, 于42℃靜置發(fā)酵至凝乳后, 置于4℃冷藏1 d后進行各項指標測定。

1.2.2 活菌數(shù)、酸度、pH及持水力測定

活菌數(shù)的測定采用平板計數(shù)法[7]。酸度采用酸堿滴定法[8]。采用pH酸度計測定3種酸奶的pH。持水力的測定參照文獻[8],并做部分修改。取10 g樣品于4℃轉速為10 000 r/min, 離心30 min。持水力如下：

注：W1為酸乳樣品質(zhì)量(g)；W2為上清液質(zhì)量(g)。

1.2.3 抗氧化活性測定

參照文獻[9]的方法, 用DPPH自由基清除率來評價不同酸奶樣品的抗氧化活性。上清液收集的離心條件參照持水力實驗。以95%乙醇為溶劑制備0.0003%DPPH溶液（質(zhì)量分數(shù)）。以95%乙醇為空白, 2 mL DPPH溶液中加入1 mL 95%乙醇為對照。取不同酸奶樣品的上清液500μL, 加入500μL 95%乙醇和2 mL的DPPH溶液, 混勻后室溫暗處反應30 min, 于517 nm測定吸光度?？寡趸钚杂嬎闳缦拢?/p>

注：A0為空白的吸光度；A1為不同樣品的吸光度。

1.2.4 主要成分與氨基酸組成

參照文獻[10]分別測定3種酸奶中粗蛋白、脂肪、總固體、脫脂固體及灰分的含量。氨基酸組成測定方法參照文獻[11]。

1.2.5 揮發(fā)性香氣成分測定

采用全自動氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用, 對酸牛奶、山羊酸奶、駱駝酸奶中的揮發(fā)性化合物進行測定。每組酸奶取5個平行樣本, 每樣本稱取8 g于15 mL頂空瓶中, 于50℃、300 rpm下平衡2 min, 萃取20 min, 于250℃解吸附3 min。實驗采取程序升溫方式, 初始溫度40℃、持續(xù)3 min, 以5℃/min的速率升溫至140℃, 保持2 min, 再以10℃/min的速率升溫至240℃, 保持5 min。載氣為氦氣, 進樣口溫度為250℃。MS條件：電離電壓70 eV,離子源溫度250℃, 掃描范圍33～500 u, 發(fā)射電流100μA, 檢測電壓1.4 kV。定性檢測基于GC-MS工作站的標準數(shù)據(jù)庫檢索各個組分的質(zhì)譜數(shù)據(jù), 定量檢測根據(jù)峰面積歸一法計算各物質(zhì)峰面積的相對含量百分比。

1.2.6 全質(zhì)構分析

采用TA-XT2i物性儀分別測定3組酸奶的全質(zhì)構特性。每組樣品設置3個平行。用勺子移取等量的樣品于容器中, 4℃放置2 h后進行測定。測定條件如下：采用SMS P/25柱狀探頭, 測前速率1 mm/s、測定速率1 mm/s、測定距離5 mm, 測定后速率1 mm/s、觸發(fā)力5 g、時間5s。測定結束后得到樣品的硬度、黏附性、凝聚性和膠黏性。

1.2.7 流變學特性分析

3組酸奶樣品流變學特性的測定方法參照楊希娟論文[12]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用EXCEL 2020進行數(shù)據(jù)處理, 每個樣品測定3次, 結果表示為平均值±標準差；用Origin 2018軟件繪圖并對不同樣品的GC-MS數(shù)據(jù)做主成分分析；采用SIMCA 14.1軟件進行正交偏最小二乘判別分析；采用SPSS 23.0軟件中Kruskal-Wallis檢驗對VIP＞1對應的物質(zhì)進行P值驗證,利用R Studio軟件繪制熱圖并分析每組樣品的差異性代謝物。

2 結果與討論

2.1 總活菌數(shù)、滴定酸度、pH及持水力

總活菌數(shù)反映微生物的生長狀況。營養(yǎng)物質(zhì)的種類和含量越豐富, 活菌數(shù)越高。牛、山羊、駱駝酸奶中總活菌數(shù)分別為0.92×109CFU/mL、1.74×109CFU/mL和3.65×109CFU/mL。駱駝酸奶中活菌數(shù)顯著高于其余兩者（P＜0.05）,說明駱駝酸奶更適于乳酸菌的生長。酸度與pH主要受乳酸菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)生乳酸所影響。3種酸奶的滴定酸度分別為91.23±0.15、89.32±0.71、86.21±0.13, pH分別為4.18±0.23、4.26±0.15、4.70±0.56, 且三者間的酸度與pH均具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。因此, 乳糖含量和活菌數(shù)越高, 產(chǎn)生乳酸含量也越高, pH值越低。

持水力是評價蛋白結合水分子的能力, 蛋白膠束間的交聯(lián)狀況影響持水力的大小。三者持水力由高到低為：山羊酸乳（72.24±0.63）、酸牛乳（60.12±0.23）及駱駝酸奶（44.59±0.52）。駱駝酸奶的低持水力與脆弱質(zhì)地密切相關, 其內(nèi)部蛋白膠束間孔隙大, 造成結合水分少[13]。因此, 為改善酸乳質(zhì)地, 減小蛋白膠束間空隙, 可使用高產(chǎn)胞外多糖的菌種, 使發(fā)酵過程中產(chǎn)生的胞外多糖可與蛋白膠束相互作用, 進而提高持水力。

2.2 抗氧化活性

DPPH自由基具有單一電子且結構穩(wěn)定, 溶液呈紫色, 于517 nm處有穩(wěn)定吸收。因此, 采用光譜法定量分析清除劑的抗氧化活性[14]?？寡趸钚栽綇? 吸光度越低。經(jīng)檢測, 酸牛奶、山羊酸奶及駱駝酸奶的抗氧化活性依次為56.63%±1.34、59.47%±1.25和62.31%±2.25。駱駝酸奶的抗氧化活性顯著高于山羊酸奶和酸牛奶（P＜0.05）, 說明不同樣品抗氧化活性與其組分及性質(zhì)密切相關[15]。

2.3 主要成分與氨基酸組成

經(jīng)檢測, 酸牛奶的粗蛋白含量(3.34±0.12)和脂肪含量(3.83±0.06)顯著低于其余兩種酸奶（P＜0.05）。其中, 駱駝酸奶中粗蛋白含量最高(3.69±0.56), 山羊酸乳的脂肪含量最高(4.9±0.43), 且三者間具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)?？偣腆w(14.25±0.54)、脫脂固體(12.22±0.26)及灰分的含量(0.98±0.15)在酸牛乳中最高, 而在駱駝酸奶(13.72±0.35,10.29±0.39,0.72±0.09)和山羊酸奶(12.23±0.13,9.92±0.64,0.65±0.13)中, 分別顯著降低（P＜0.05）。

3種發(fā)酵酸奶的氨基酸組成結果如表1所示, 共檢測到17種氨基酸。在3種酸奶中, 氨基酸含量最高的前3位皆為谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸。必需氨基酸和非必需氨基酸中含量最高的分別為亮氨酸和谷氨酸。亮氨酸是構建肌肉的3種必需氨基酸之一, 具有調(diào)節(jié)血糖、支持能量供應等功能[16]。谷氨酸為細胞內(nèi)重要遞質(zhì)與組分, 也是谷胱甘肽的前體物質(zhì), 可幫助機體清除有毒化合物[17]。通過比較發(fā)現(xiàn), 駱駝酸奶中半胱氨酸明顯高于其余兩種酸奶, 菌種的發(fā)酵作用促進了蛋白分解。這與文獻[6]等認為駱駝奶中的蛋白質(zhì)富含半胱氨酸的研究結果一致。山羊酸奶的總氨基酸TAA、必需氨基酸EAA和非必須氨基酸NEAA是3種酸奶中最高的, 酸牛奶、駱駝酸奶依次次之, 表明山羊酸奶的營養(yǎng)價值更豐富。而且, 3種酸奶的EAA/TAA均高于40%, EAA/NEAA均高于70%, 達到FAO/WHO要求的EAA/TAA和EAA/NEAA的理想蛋白質(zhì)標準。因此, 3種酸奶的蛋白質(zhì)均為完全蛋白質(zhì)和優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì), 屬于理想蛋白質(zhì)范疇, 具有較高的營養(yǎng)價值。

表1 3種酸奶的氨基酸組成比較 mg/g

2.4 GC-MS分析

酸牛奶、山羊酸奶及駱駝酸奶中揮發(fā)性風味代謝物的分析結果見表2。

表2 牛、羊、駝酸奶的揮發(fā)性化合物組成

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

經(jīng)過GC-MS分析, 3種乳源酸奶的揮發(fā)性化合物主要有酸類、烷烴類、脂類、酮類、醛類、醇類及其它類構成。對每組樣品中各個色譜峰進行質(zhì)譜分析, 酸牛乳、山羊酸奶、駱駝酸奶分別檢測出55種、67種、63種揮發(fā)性代謝物。其中酸牛乳中主要的風味物質(zhì)為酮類物質(zhì)30.67%、醇類物質(zhì)21.6%及脂類物質(zhì)20.68%, 物質(zhì)與含量分布合理、分散, 風味柔和, 具有典型的發(fā)酵乳風味。駱駝酸奶中揮發(fā)性物質(zhì)大部分為酸類物質(zhì)31.04%, 脂類物質(zhì)17.95%, 酮類物質(zhì)17.22%, 醇類物質(zhì)20.86%, 其中乙酸含量為11.63%, 代謝物比例較為不均衡。山羊酸奶中酸類物質(zhì)高達65.92%, 酮類物質(zhì)11.43%, 醇類物質(zhì)10.83%。酸類物質(zhì)含量尤為豐富。其中, 辛酸、月桂酸和癸酸含量分別為8.56%, 11.79%和22.17%, 說明酸類物質(zhì)可能與山羊酸奶中突出的羊膻味有關。上述結果與報道結果相近[18-19], 即認為辛酸、壬酸和癸酸是羊乳中主要致膻成分, 降低辛酸和癸酸的含量可以在一定程度上減少乳品的羊膻味。

酸類物質(zhì)作為酸奶中主要的風味物質(zhì), 主要體現(xiàn)在滋味。酸類物質(zhì)的含量由高到低排序依次為山羊酸奶、駱駝酸奶、酸牛奶。烷烴類物質(zhì)在酸牛奶、山羊酸奶及駱駝酸奶中的種類數(shù)分別為5種、3種和6種, 但酸牛奶中的含量最高。脂類物質(zhì)閾值低, 風味明顯, 主要來自于脂肪酸水解和細菌作用產(chǎn)生[20]。脂類物質(zhì)在酸牛奶、山羊酸奶和駱駝酸奶中分別為8種、8種和11種。醇類物質(zhì)在山羊酸奶中種類數(shù)多于酸牛乳和駱駝酸乳, 但山羊酸奶中醇類物質(zhì)的含量明顯低于其余兩者。由于醇類物質(zhì)的風味閾值高, 對酸奶的風味貢獻度不明顯, 主要起輔助作用。酮類物質(zhì)作為多種物質(zhì)的中間體, 主要由脂肪酸和肽類物質(zhì)降解及細菌代謝產(chǎn)生[20]。3種酸奶中共檢測到9種酮類物質(zhì), 含量豐富, 對酸奶風味作用明顯。醛類物質(zhì)在山羊酸奶中構成及含量明顯高于其余兩種酸奶, 閾值較低, 是各種氧化風味的重要來源。其它類別化合物主要由含硫物質(zhì)和含氮物質(zhì)組成, 風味閾值低, 對整體風味形成較為重要。

2.5 OPLS-DA建模與模型評價

根據(jù)GC-MS數(shù)據(jù), 首先, 對三種酸奶進行無監(jiān)督的主成分分析。如圖1所示, 不同樣本沿著第一主成分強烈分布（PC1、PC2分別為52.0%和35.0%）, 聚類顯著, 即組間代謝物的成分與含量都存在明顯差異。隨后, 進行有監(jiān)督的OPLS-DA建模分析。理論上R2與Q2越接近1.0, 擬合度越高。如圖2所示, 所建立的模型中見圖2（a）, R2X為0.87, R2Y為0.996, Q2為0.994, 說明所建立模型的解釋度和擬合度良好。然后, 為避免OPLS-DA模型無法對新樣本進行有效預測而表現(xiàn)出過度擬合, 進一步采取SIMCA 14.1中置換檢驗和交叉驗證分析對模型可靠性進行驗證。置換結果如圖2（b）中所示, 經(jīng)200次置換交叉驗證后, Q2點的回歸線與縱坐標的截距小于0, 說明模型沒有過擬合。同時交叉驗證分析結果證明, 3種酸奶的顯著概率值P=1.16×10-20＜0.05,說明該研究下所建立的模型穩(wěn)定可靠, 具有統(tǒng)計學意義。最后, 篩選3種酸奶的潛在差異性代謝物。VIP是OPLS-DA模型的變量權重值, 可用來衡量各組分累計差異對組間樣本分類判別的影響強度和解釋能力。通常認為VIP值越大, 該化合物對樣品間聚類的貢獻率越大。根據(jù)VIP＞1的標準[21], 共篩選出52種代謝物, 并采用Kruskal-Wallis檢驗對篩選出VIP＞1的化合物進行單變量分析[22]。分析結果如表3所示, 篩選出的52種物質(zhì)在3種酸奶中含量均具有顯著性。

表3 基于OPLS-DA模型分析VIP＞1代謝物的P值

圖1 主成分分析

圖2 3種酸奶的多元統(tǒng)計分析

（續(xù)表3）

2.6 層次聚類分析

為進一步分析酸牛乳、山羊酸奶、駱駝酸奶的揮發(fā)性香氣化合物構成及含量的差異, 將所篩選的52種具有顯著性的物質(zhì)先經(jīng)過標準化處理, 后進行譜系與heatmap分析, 以更直觀的體現(xiàn)52種化合物在3種酸奶中的聯(lián)系。

由圖3可知, 通過層次聚類分析, 可將3種乳品的特征代謝物分為五大類。顏色越紅代表濃度也高。A、C、D中物質(zhì)分別為山羊、牛、駝乳區(qū)別于其他兩種乳品的主要風味物質(zhì)。B類物質(zhì)中含有正戊醇、己酸、正己醇、乙酸、壬酸, 為山羊酸乳和駱駝酸乳所共有, 而在酸牛乳中含量極低, 說明其在山羊酸奶和駱駝酸奶中膻味表現(xiàn)有一定作用。正戊醇有水果和脂肪氣味；己酸具有辛辣、花香和較淡腐臭味；正己醇表現(xiàn)為土壤和汽油味；乙酸的氣味表現(xiàn)為醋, 辛辣和醋酸的氣味；壬酸呈淡的脂肪和椰子香氣[23]。丙位十二內(nèi)酯、棕櫚酸異丙酯、1-十四醇、十九醇的含量在山羊酸奶、酸牛奶和駱駝酸奶中依次升高, 表示這4種物質(zhì)是兼具酸牛乳和駱駝酸奶風味的關鍵物質(zhì)。

圖3 52種代謝物的熱圖和HCA聚類結果在3種乳品中有顯著差異(VIP值＞1)

2.7 全質(zhì)構分析

全質(zhì)構分析是評價酸奶質(zhì)量的一個重要指標, 以酪蛋白間形成的蛋白膠束為基礎, 與酸奶的內(nèi)部結構密切相關。由表4可知, 酸牛乳、山羊酸奶及駱駝酸奶的硬度依次降低, 硬度主要受到胞外多糖與酪蛋白的影響。黏附性是樣品二次壓縮間的負面積, 反映探頭克服樣品黏著所做的功, 樣品的黏性越大, 則黏附性的絕對值越大。3種樣品的黏附性絕對值表現(xiàn)為FM＞FG＞FC。內(nèi)聚性指樣品第一次壓縮后呈現(xiàn)出對第二次壓縮的相對抵抗力, 結果從大到小依次為FC＞FM＞FG。膠黏性模擬半固體樣品破裂成吞咽時的穩(wěn)定狀態(tài)所需的能量, 結果與硬度一致。綜合硬度、黏附性、內(nèi)聚性和膠黏性4個指標認為, 酸牛奶的內(nèi)部結構最為穩(wěn)定, 山羊酸奶次之, 駱駝酸奶最差。

表4 酸牛乳、山羊酸奶、駱駝酸乳的全質(zhì)構分析

2.8 流變學特性分析

流變學特性研究時間和力等外界條件對酸奶變形情況的影響[24], 常從表觀黏度、觸變特性與應變掃描進行測定與評價。根據(jù)研究[25],β-乳清蛋白與酪蛋白的交聯(lián)作用是酸奶流變特性的基礎, 并對后續(xù)發(fā)酵過程中膠束的建立和水合過程產(chǎn)生重要影響。

如圖4所示, 為牛、山羊、駱駝酸奶的流變學特性分析圖。3種酸奶的表觀黏度隨著剪切速率的增加, 先劇烈降低后趨于平緩見圖4（a）, 即呈現(xiàn)出剪切稀釋的流動特征, 因為剪切力破壞了酸奶的內(nèi)部結構進而使黏度下降。3種酸奶的表觀黏度的變化趨勢雖然相同, 但初始表觀黏度值在酸牛乳、山羊酸奶、駱駝酸奶中依次降低。酸奶樣品的升速與降速剪切曲線可大致形成觸變環(huán)見圖4（b）, 即在剪切力作用下樣品的組織結構會發(fā)生改變, 撤去作用力后恢復狀態(tài)需要滯后一段時間。3種酸奶的觸變環(huán)形態(tài)明顯不同, 表明其觸變特性迥異。3種酸奶的觸變環(huán)面積的大小表現(xiàn)為FG＞FM＞FC。觸變環(huán)面積越大說明在剪切力作用下, 內(nèi)部組織結構發(fā)生的變化越大, 且恢復速度較慢。應變掃描是模擬酸奶從生產(chǎn)到銷售全過程中受到的作用力, 結果以儲能模量G＇與損耗模量G＂表示見圖4（c）。3組酸奶樣品中G＇＞G＂, 說明儲能模量優(yōu)于損耗模量, 結構上呈現(xiàn)一定程度的固體特性。其中, 山羊酸奶的儲能模量最高, 酸牛乳次之, 駱駝酸奶最低。

圖4 3種酸奶的流變特性分析圖

分析牛、山羊、駱駝酸奶的流變學特性時發(fā)現(xiàn), 牛、山羊酸奶在外力剪切作用下, 內(nèi)部結構均發(fā)生較大改變, 而駱駝酸奶的組織狀態(tài)變化幅度較小, 這與3種酸奶所呈現(xiàn)的狀態(tài)直接相關。凝乳后牛、山羊酸奶的質(zhì)地均勻、流暢及黏稠, 而駱駝酸奶的組織結構脆弱, 持水性較差。有文獻也發(fā)現(xiàn)駱駝酸奶的凝乳狀態(tài)不理想, 具有水狀的稠度[26]。駱駝酸奶中較大的酪蛋白膠束、β-乳球蛋白的缺乏及乳中脂肪球過小等導致了駱駝酸奶的質(zhì)地不佳[13]。因此, 酸牛乳的流變學特性整體要優(yōu)于山羊酸奶和駱駝酸奶。

3 結論

通過理化指標、主要物質(zhì)與氨基酸含量、揮發(fā)性香氣成分、全質(zhì)構與流變學特性, 總結得出3種酸奶的品質(zhì)的差異如下：酸牛乳中各類揮發(fā)性風味物質(zhì)間組成合理, 具有典型的發(fā)酵酸奶的風味, 且內(nèi)部結構穩(wěn)定, 表現(xiàn)類固體特性；山羊酸奶的持水力和脂肪含量高, 揮發(fā)性代謝物以酸類物質(zhì)為主, 羊膻味突出, 結構穩(wěn)定性次于酸牛乳；駱駝酸奶具有高活菌數(shù)、抗氧化活性, 粗蛋白和半胱氨酸含量高, 具有典型發(fā)酵駝奶的風味, 整體質(zhì)地較為脆弱。3種酸乳間品質(zhì)的比較研究, 有助于滿足不同人群的需求, 豐富乳制品的種類, 進而合理發(fā)展我國特種乳資源。