樊雨梅, 趙海晴, 帖航, 蘇寧, 廖峰

（1.國家膠類中藥工程技術(shù)研究中心, 東阿阿膠股份有限公司, 山東 東阿, 252201；2.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院, 北京 100176）

0 引言

皮膚作為人體最大的屏障, 能夠保護(hù)人體免受環(huán)境傷害和維持人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。皮膚屏障功能受損, 皮膚會出現(xiàn)潮紅、丘疹、鱗屑、瘙癢和刺痛。許多皮膚疾病都與皮膚屏障功能受損密切相關(guān), 比如濕疹[1]、特應(yīng)性皮炎[2]、銀屑病[3]、痤瘡[4]、黃褐斑[5]等。因此, 皮膚屏障功能的修復(fù)對緩解皮膚干燥、炎癥、預(yù)防和治療皮膚疾病有著重要的意義。

乳及乳制品有修復(fù)皮膚屏障的作用。研究表明, 乳及乳制品能夠改善濕疹[6]、尿布皮炎[7]、銀屑病斑塊[8]、皮膚屏障損傷[9]、紅斑和脂溢性痤瘡[10]等。由于牛乳蛋白易引起過敏反應(yīng), 限制了牛乳在皮膚修復(fù)中的應(yīng)用。驢乳因營養(yǎng)成分與母乳類似、致敏性低[11], 驢乳的皮膚生理活性研究成為了研究熱點。Kocic[12]等研究發(fā)現(xiàn), 驢乳在傷口愈合、皮膚再生方面有著重要的作用。包裹脫脂驢乳的納米面霜也具有顯著的瞬時和長效保濕的效果[13]。然而到目前為止, 關(guān)于驢乳皮膚用安全性的相關(guān)研究還少有報道。因此, 本研究在系統(tǒng)評價驢乳外用安全性的基礎(chǔ)上, 通過3D皮膚模型對驢乳修復(fù)皮膚屏障的功能進(jìn)行評價, 以期為驢乳在修復(fù)皮膚屏障的應(yīng)用和安全性提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

驢乳粉（批號：20190102）由東阿阿膠股份有限公司提供；永生化人角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）, 協(xié)和細(xì)胞庫3111C0001CCC000373；人 皮 膚 成 纖 維 細(xì) 胞（NHDFs）, ATCC PCS-201-010；Balb/c小鼠成纖維細(xì)胞系（3T3）, ATCC CRL-6587；人3D表皮皮膚模型（EpiKutis, 批號：ES181003）、人角質(zhì)形成細(xì)胞（KC細(xì)胞, 批號：PC2011）, 廣州博溪生物科技有限公司；SPF雞胚, 勃林格殷格翰維通, 生產(chǎn)許可證SCXK（京）2014-0002。

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶/EDTA、青霉素/鏈霉素, Gibco公司；FM培養(yǎng)基, Sciencell公司；EpiRecovery培養(yǎng)基、EpiGrowth培養(yǎng)基, 廣州博溪生物科技有限公司；中性紅, 索萊寶生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（SLS, ω≥98.5%）、地塞米松（ω≥97%）, Sigma-Aldrich公司；CCK-8試劑盒, 碧云天生物科技有限公司；人IL-6 ELISA試劑盒、人IL-8 ELISA試劑盒, NOVUS公司；IL-1α試劑盒, Abcam公司。

1.2 儀器

371二氧化碳培養(yǎng)箱, Agilent公司；MULTISKAN GO酶標(biāo)儀, Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

精密稱取驢乳粉樣品5.0000 g, 加入40 mL熱超純水, 渦旋振蕩至完全溶解, 漩渦振蕩至完全溶解后, 加超純水補(bǔ)足至50 g, 4 000 r/min離心30 min, 取上清溶液, 即為10%（w/w）驢乳溶液。

1.3.2 安全性分析

細(xì)胞毒性評估[14]。采用人表皮層細(xì)胞HaCaT和人真皮層細(xì)胞NHDFs評價驢乳粉對人皮膚細(xì)胞的毒性作用。將正常培養(yǎng)穩(wěn)定的HaCaT細(xì)胞和NHDFs細(xì)胞分別以1×105/mL和6×104/mL的密度鋪板于96孔板, 培養(yǎng)24 h形成單層細(xì)胞后, 分別加入10%、5%、2.5%、1.25%、0.63%、0.31%、0.16%和0.08%濃度梯度的驢乳溶液繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h。按照CCK-8試劑盒的檢測方法測定細(xì)胞相對活性, 以不含驢乳粉的培養(yǎng)基處理的細(xì)胞作為陰性對照。細(xì)胞相對活性采用下面進(jìn)行計算。當(dāng)相對細(xì)胞活性≥80%, 認(rèn)為受試物在該濃度下無細(xì)胞毒性。

細(xì)胞相對活性（%）=（實驗組OD值-空白組OD值）/（陰性對照組OD值-空白對照組OD值）×100%

促表皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)檢測。將正常培養(yǎng)穩(wěn)定的HaCaT細(xì)胞/KC細(xì)胞以1×105/mL的密度鋪板于12孔板, 培養(yǎng)24 h形成單層細(xì)胞后, 加入1%驢乳溶液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。利用試劑盒檢測HaCaT細(xì)胞IL-6、IL-8和PEG2的分泌情況, 以不含驢乳粉的培養(yǎng)基處理的細(xì)胞作為陰性對照。

光毒性評估參考《化妝品安全技術(shù)規(guī)范（2015年版）》的《化妝品用化學(xué)原料體外3T3中性紅攝取光毒性試驗方法》進(jìn)行檢測[15]。眼刺激/腐蝕性評估參照SN/T2329-2009《化妝品眼刺激性/腐蝕性的雞胚絨毛尿囊膜試驗》規(guī)定的方法進(jìn)行測定[16]。皮膚刺激性/腐蝕性利用SN/T 4577-2016《化妝品皮膚刺激性檢測重建人表皮模型體外測試方法》進(jìn)行檢測[17]。

1.3.3 皮膚屏障修復(fù)效果評價[18]

將復(fù)蘇好的人3D表皮模型轉(zhuǎn)移至含有0.9 mL EpiGrowth培養(yǎng)液的6孔板中, 吸取2倍檢測濃度的驢乳粉溶液與4 mg/mL的SLS溶液等體積混合, 將SLS-驢乳粉溶液混合液25μL緩慢滴加于模型表面。以未處理的模型作為陰性對照, 以2 mg/mL的SLS作為模型對照, 以SLS-地塞米松混合液作為陽性對照, 每組9個平行。給藥結(jié)束后在培養(yǎng)箱（37℃, 5% CO2）中培養(yǎng)24 h。使用裝有無菌PBS的洗瓶清洗每個模型15次, 然后使用1%的TritonX-100溶液分別刺激0、1、3 h, 每個時間點3個模型。刺激結(jié)束后清洗模型15次, 使用MTT法, 以陰性對照組刺激0 h的存活率為100%, 以異丙醇作為空白對照, 以吸光值作為檢測指標(biāo)按照下面公式計算驢乳粉處理后模型的組織存活率。同一實驗分組內(nèi), 取組織活力為50%左右的兩個時間點數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖, 計算直線回歸方程, 根據(jù)回歸方程計算組織活力為50%的時間, 即為屏障指數(shù)（ET50）。ET50大于模型對照組ET50的樣品, 具有屏障修復(fù)效果。

1.3.4 抗刺激效果評價[19]

將復(fù)蘇好的模型轉(zhuǎn)移至含有0.9 mL EpiGrowth培養(yǎng)基的6孔板中, 吸取2倍檢測濃度的驢乳粉溶液與4 mg/mL的SLS溶液等體積混合, 將SLS-驢乳粉溶液混合液25μL緩慢滴加于模型表面, 以未處理的模型作為陰性對照, 以2 mg/mL的SLS作為模型對照, 以SLS-地塞米松混合液作為陽性對照, 每組9個平行。給藥結(jié)束后在培養(yǎng)箱（37℃, 5% CO2）中培養(yǎng)24 h。收集模型培養(yǎng)液, 使用ELISA法檢測并計算模型IL-1α含量。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有的數(shù)據(jù)均用均值±SD表示。采用統(tǒng)計軟件SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理, 組間比較采用單因素方差分析, 設(shè)定檢驗的顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 驢乳粉安全性分析

2.1.1 細(xì)胞毒性檢測結(jié)果

不同濃度的驢乳粉對HaCaT及NHDFs細(xì)胞毒性檢測結(jié)果如圖1所示。與對照組相比, 10%以下的驢乳粉對HaCaT細(xì)胞和NHDFs細(xì)胞均無細(xì)胞毒性（P＞0.05）。濃度范圍為0.08%～10%的驢乳粉有促進(jìn)HaCaT細(xì)胞和NHDFs細(xì)胞增殖的作用。

圖1 驢乳粉對HaCaT、NHDFs細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用

2.1.2 促表皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)檢測結(jié)果

使用角質(zhì)形成細(xì)胞對驢乳粉進(jìn)行皮膚早期炎癥因子IL-6和IL-8, 以及中期炎癥因子PEG2的誘導(dǎo)表達(dá)情況檢測, 結(jié)果見表1。與空白對照組相比, 1%驢乳粉溶液誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞的IL-6、IL-8和PEG2的表達(dá)量下降, 差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。可見, 驢乳粉不會引起表皮細(xì)胞炎性因子上升。Kocic[12]等也報道驢乳能夠顯著下調(diào)核因子-κB/p65（nuclear factor of kappa B, NF-κB）蛋白的表達(dá), 發(fā)揮抗炎作用。

表1 驢乳粉促表皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)情況

2.1.3 體外3T3細(xì)胞中性紅攝取光毒性試驗結(jié)果

采用體外3T3細(xì)胞評價驢乳粉對中性紅攝取光毒性的影響, 見表2。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn), 化妝品原料的光毒性可通過光刺激因子（PIF）和平均光效應(yīng)（MPE）預(yù)測模型進(jìn)行預(yù)測。由PIF預(yù)測模型可知, 驢乳粉在濃度10%及以下, 可得到PIF=*1, 推測驢乳粉無潛在光毒性。而由MPE預(yù)測模型可知, 驢乳粉MPE在0.1～0.15之間, 可能具有光毒性。兩種預(yù)測模型得出的結(jié)果不同, 可能與驢奶粉加工過程中引入的干擾物有關(guān), 需進(jìn)一步研究, 比如驢乳粉皮膚吸收性和累積的可能性。

表2 驢乳粉光毒性數(shù)據(jù)

2.1.4 雞胚絨毛尿囊膜眼刺激/腐蝕性評價結(jié)果

采用HET-CAM（雞胚絨毛尿囊膜實驗）終點法對驢乳粉進(jìn)行眼刺激性/腐蝕性毒性預(yù)測, 受試物ES（Effective Score, 刺激分?jǐn)?shù)）≤12, 為無/輕刺激性；12＜受試物ES＜16, 為重度刺激性；受試物ES≥16, 為強(qiáng)刺激性/腐蝕性。結(jié)果顯示, 驢乳粉ES評分為0, 表明驢乳粉對眼部為“無/輕刺激性”。圖2為相應(yīng)的眼刺激雞胚尿囊膜圖片。

圖2 驢乳粉對雞胚尿囊膜的影響

2.1.5體外皮膚刺激性3D皮膚模型試驗

采用3D皮膚模型法預(yù)測驢乳粉對人皮膚刺激性的效應(yīng), 見表3。驢乳粉處理后的皮膚模型相對組織活性為128.79%, SD值為1.47, 可見驢乳粉不具有皮膚刺激性。

表3 3D皮膚模型刺激性結(jié)果

2.2 驢乳修復(fù)皮膚屏障效果評價

2.2.1 屏障修復(fù)效果評價結(jié)果

為探究驢乳粉對受損皮膚屏障的修復(fù)作用, 利用MTT法測定驢乳粉保護(hù)SLS-EpiKutis損傷模型在1%TritonX-100不同作用時間下的相對組織活力, 并計算屏障指數(shù)（ET50）, 見表4。實驗結(jié)果表明, 2%驢乳粉和地塞米松作用后, SLS-EpiKutis損傷模型的ET50分別從12.21 min延長至29.92 min和26.44 min?？梢? 驢乳粉能夠有效促進(jìn)皮膚屏障修復(fù), 效果優(yōu)于陽性對照地塞米松。

表4 SLS-EpiKutis損傷模型ET50結(jié)果

2.2.2 抗刺激效果評價結(jié)果

IL-1α主要由巨噬細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、單核細(xì)胞等分泌, 能夠參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生, 也可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖[20]。低濃度的SLS作用于角質(zhì)層, 可導(dǎo)致皮膚屏障功能受損, 并釋放IL-1α等炎性因子介導(dǎo)皮膚炎癥反應(yīng)[21-22]。實驗結(jié)果表明, 使用SLS損傷EpiKutis后, IL-1α含量顯著升高, 明顯高于未損傷組, 這與喻歡[19]和Falcone[23]報道一致。與模型組相比, 地塞米松和2%驢乳粉作用后, SLS-EpiKutis損傷模型的IL-1α均下降, 從323.95±20.92ρg/mL分別下降到229.73±18.76ρg/mL和210.12±19.62ρg/mL, 差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。地塞米松與2%驢乳粉的作用效果, 差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。可見, 驢乳粉對SLS-EpiKutis損傷模型的IL-1α合成具有抑制作用, 與地塞米松效果類似。

表5 SLS-EpiKutis損傷模型IL-1α含量檢測結(jié)果

3 結(jié)論

本研究對驢乳粉的安全性和修復(fù)皮膚屏障效果進(jìn)行了初步研究。通過對驢乳粉進(jìn)行系統(tǒng)性的體外化妝品毒理學(xué)評估發(fā)現(xiàn), 驢乳粉無表皮細(xì)胞致炎性、眼刺激性/腐蝕性、皮膚刺激性和細(xì)胞毒性, 但兩種光毒性預(yù)判模型對驢乳粉的光毒性判定不一致, 需做進(jìn)一步的研究。濃度范圍在0.08%～10%的驢乳粉對HaCaT細(xì)胞和NHDFs細(xì)胞有促增值作用。此外, 利用3D皮膚模型評價驢乳粉修復(fù)皮膚屏障的效果, 研究結(jié)果顯示, 2%驢乳粉能夠修復(fù)皮膚屏障, 使刺激物屏障弱化模型的ET50從12.21 min延長至29.92 min, 效果優(yōu)于地塞米松；2%驢乳粉對SLS-EpiKutis損傷模型的IL-1α合成具有抑制作用, IL-1α水平從323.95±20.92 ρg/mL下降到210.12±19.62ρg/mL, 與地塞米松的效果類似。本研究對驢乳粉進(jìn)行了較為系統(tǒng)的化妝品安全性和皮膚屏障修復(fù)效果評價, 為驢乳粉開發(fā)提供了基礎(chǔ)的毒理學(xué)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。