劉瑞, 呼秀智, 楊昭穎, 陳冬東, 黎燁昕, 呼念念, 彭濤

（1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院, 北京 100176；2.河北工程大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 河北 邯鄲 056107）

0 引言

黃曲霉毒素是生活中接觸最廣泛且毒性、致癌性最強(qiáng)的真菌毒素[1-3], 是由黃曲霉、寄生曲霉真菌菌株在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中產(chǎn)生的易引起人和動(dòng)物生理病變的活性物質(zhì)[4]。目前已經(jīng)分離鑒定出超過(guò)20種黃曲霉毒素及其衍生物的存在, 最常見(jiàn)的為黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1, AFB1）、黃曲霉毒素B2（aflatoxin B2, AFB2）、黃曲霉毒素G1（aflatoxinG1, AFG1）、黃曲霉毒素G2（aflatoxin G2, AFG2）、黃曲霉毒素M1（aflatoxin M1, AFM1）、黃曲霉毒素M2（aflatoxin M2, AFM2）。一直對(duì)全球糧食業(yè)和畜牧業(yè)食品安全都造成著嚴(yán)重影響。Han等[5]在2017年對(duì)我國(guó)玉米小麥等主要谷物飼料中的黃曲霉毒素進(jìn)行檢測(cè), 結(jié)果均有黃曲霉毒素檢出, 陽(yáng)性檢測(cè)率高達(dá)100%。動(dòng)物若食用被污染的飼料則其乳汁中通常能檢測(cè)到B族及M族黃曲霉毒素[6], 人體長(zhǎng)期攝入被污染乳品可產(chǎn)生中毒、致癌、致突變和致畸等作用, 科學(xué)家們雖長(zhǎng)期致力于乳品中黃曲霉毒素預(yù)防及降解技術(shù)的研究, 但迄今為止仍缺乏經(jīng)濟(jì)適用、大規(guī)模有效的解決污染的辦法。故我國(guó)于2017年發(fā)布的食品中真菌毒素限量要求[7]中規(guī)定了乳品中AFM1的限量要求為0.5μg/kg, 歐盟規(guī)定嬰幼兒食品中AFM1的安全限量則為0.025μg/kg, 而在埃及、羅馬尼亞、尼日利亞等地區(qū)更是不得檢出。據(jù)《（2020）中國(guó)奶業(yè)質(zhì)量報(bào)告》顯示2019年我國(guó)奶類產(chǎn)量達(dá)到3297.6萬(wàn)t, 居世界第4位, 但還遠(yuǎn)不能實(shí)現(xiàn)國(guó)人每天一杯奶的消耗需求。面對(duì)日益增長(zhǎng)的乳品產(chǎn)量及消耗量, 研究建立可以準(zhǔn)確高效地測(cè)定乳品中黃曲霉毒素的現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)來(lái)保障乳品安全尤為重要。

近年來(lái), 檢測(cè)不同食品基質(zhì)中各種真菌毒素的方法隨著檢測(cè)儀器的發(fā)展而迅速發(fā)展起來(lái), 由于攝入過(guò)多被黃曲霉毒素污染的乳品會(huì)對(duì)身體造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害。因此, 建立高效快速、準(zhǔn)確性好的黃曲霉毒素檢測(cè)方法尤為必要。本文綜述了乳品中黃曲霉毒素提取方法、凈化方法及檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展, 以期為日后開(kāi)展黃曲霉毒素的檢測(cè)技術(shù)研究提供參考。

1 材料與方法

前處理技術(shù)是檢測(cè)乳品中黃曲霉毒素殘留的關(guān)鍵操作步驟, 乳品在檢測(cè)之前都需要技術(shù)人員通過(guò)正確的方式進(jìn)行前處理操作, 有效去除樣品中的雜質(zhì), 確保得到精確可靠地檢測(cè)結(jié)果。

1.1 提取技術(shù)

提取是樣品基質(zhì)前處理的第一步, 即采用物理或化學(xué)方法把待測(cè)物從樣品基質(zhì)中分離出來(lái)轉(zhuǎn)移到易于檢測(cè)的有機(jī)溶劑中。

應(yīng)根據(jù)樣品基質(zhì)與待測(cè)物的具體性質(zhì), 按照“相似相容”原理選擇合適的提取溶劑溶解待測(cè)物。通常選用甲醇或乙腈作為黃曲霉毒素的提取劑。張國(guó)梁等[8]采用乙腈提取干酪制品中黃曲霉毒素M1的殘留, 用高效液相色譜法最低檢出限為0.037μg/kg, 成功用于干酪中黃曲霉毒素M1含量的測(cè)定。為增加提取的選擇性, 也經(jīng)常采用混合溶劑進(jìn)行黃曲霉毒素的提取。在提取溶劑中加入一定比例的水來(lái)提高有機(jī)溶劑的滲透率, 從而提高待測(cè)物的回收率。畢瑞鋒等[9]用甲醇-水(體積比為8∶2)提取分析物同時(shí)沉淀蛋白, 過(guò)弗羅里硅土柱凈化, 用5 mL丙酮-水-甲酸混合溶液(體積比為96∶3.5∶0.5)洗脫, 完全適合液體奶中黃曲霉毒素M1的日常監(jiān)控。童圓等[10]建立液態(tài)奶制品中的黃曲霉毒素M1和B1的方法采用乙腈-正己烷提取樣品基質(zhì), 結(jié)合固相萃取一高效液相色譜熒光法測(cè)定, 黃曲霉毒素M1和B1在0.1～50μg/kg線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)的平方大于0.9996,該方法穩(wěn)定性好, 檢測(cè)成本低。提取環(huán)境的pH也可影響前處理提取效率, 黃曲霉毒素在中性和弱酸性溶液中較穩(wěn)定, 因此多在提取溶劑中加入酸[11]等促進(jìn)毒素的提取。提取方式的選擇不同也會(huì)在一定程度上影響待測(cè)物提取效率。常見(jiàn)的提取方式有振蕩提取、超臨界流體萃取、超聲輔助提取、微波輔助提取、加壓液體提取、脈沖電場(chǎng)輔助提取、酶輔助提取等。

1.2 凈化技術(shù)

凈化是指在樣品檢測(cè)前, 為了提高檢測(cè)結(jié)果的靈敏度, 除去待測(cè)基質(zhì)樣品中的蛋白質(zhì)、脂肪、色素等雜質(zhì)干擾物的過(guò)程, 是前處理中必不可少的一步。

1.2.1 液-液分配（Liquid-liquid partition,LLP）

液液分配是應(yīng)用相似相溶原理, 利用不同物質(zhì)在溶劑中溶解度的不同來(lái)達(dá)到從樣品基質(zhì)中分離雜質(zhì)和提取待測(cè)物的目的。該技術(shù)操作簡(jiǎn)單、設(shè)備簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉。常用的溶劑有甲醇、乙腈、甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷等有機(jī)溶劑。液液分配技術(shù)在真菌毒素樣品前處理中應(yīng)用較為成熟。傳統(tǒng)液液分配技術(shù)對(duì)有毒有害有機(jī)溶劑使用量較大。而儀器輔助分配法和溶劑輔助分配法這種新型液液分配技術(shù)能有效減少有毒溶劑的使用, 縮短萃取時(shí)間。劉佳盟等[12]采用溶質(zhì)輔助液液分配法在乙腈提取液中加入輔助鹽氯化鈉提取純牛奶及乳粉中的黃曲霉M1, 該方法的檢測(cè)限可達(dá)0.06μg/kg, 加標(biāo)回收率在91.2%～105.5%, 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.90%～2.84%之間, 該方法成本低廉、靈敏可靠, 可替代現(xiàn)有黃曲霉毒素M1免疫親和柱的液液分配方法。

1.2.2 固相萃取(Solid phase extraction,SPE)

固相萃取技術(shù)一般包括萃取柱預(yù)處理、上樣、淋洗及洗脫4個(gè)步驟, 固相萃取技術(shù)簡(jiǎn)單方便、回收率高、應(yīng)用范圍廣、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng), 已成為國(guó)內(nèi)農(nóng)獸藥及真菌毒素殘留檢測(cè)樣品最常用的前處理技術(shù)之一, 很多現(xiàn)行檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)都會(huì)采用SPE柱凈化技術(shù)。但是其濃縮過(guò)程消耗的時(shí)間較長(zhǎng), 在進(jìn)行大規(guī)模檢測(cè)時(shí)會(huì)增加前處理時(shí)間[13]。傳統(tǒng)SPE使用的吸附劑主要是C8、C18和苯基等有機(jī)基團(tuán)鍵合二氧化硅等材料。董彬等[14]采用乙腈-水溶液(86∶14,體積比)提取樣品,Romer 226多功能柱凈化樣品,建立了簡(jiǎn)單、快速測(cè)定牛奶中黃曲霉毒素M1的液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜法, 外標(biāo)法定量, 結(jié)果顯示兩種濃度樣品加標(biāo)回收率為71.5%和83.5%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%和8.4%, 適用于牛奶中的黃曲霉毒素M1準(zhǔn)確定量。張國(guó)梁[15]采用乙腈作提取劑, 用親水親脂OASISHLB柱（以二乙烯苯和N-乙烯基吡咯烷酮按比例聚合成的大孔共聚物為填料）代替免疫親和柱凈化樣品, 建立了用HPLC法檢測(cè)干酪中黃曲霉毒素M1的方法, 對(duì)干酪中AFM1的平均回收率在87.1%～92.2%, 最低檢出限為0.037μg/kg。對(duì)比國(guó)標(biāo)中第二法, 該方法節(jié)約成本, 檢測(cè)時(shí)間縮短, 可以為干酪樣品的檢測(cè)提供參考。孫曉冬等[16]建立使用固相萃取柱凈化液態(tài)乳中5種黃曲霉毒素多殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。樣品經(jīng)含0.1%甲酸-乙腈沉淀蛋白和提取,Oasis PRi ME HLB柱凈化后,以0.1%甲酸溶液與乙腈為流動(dòng)相,梯度洗脫。測(cè)得定量限(RSN≥10)為0.55μg/kg, 加標(biāo)平均回收率為67.7%～112.7%, 結(jié)果表明該方法凈化效果較好, 基質(zhì)干擾較少, 可用于液態(tài)乳中真菌毒素的檢測(cè)分析。Mohammad等[17]建立了一種基于磁性納米顆粒和適配體的高特異性吸附劑來(lái)提取牛奶中的AFM1, 是一種成本低廉的能代替免疫親和凈化的方法, 見(jiàn)表1。

表1 固相萃取凈化黃曲霉毒素

1.2.3基質(zhì)分散固相萃?。∕atrix solid-phase dispersion,MSPD）

該技術(shù)使樣品前處理過(guò)程變得簡(jiǎn)單快速, 減少了樣品待測(cè)物的損失和溶劑的使用, 具有回收率高重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn), 常被用于果蔬基質(zhì)中的農(nóng)藥殘留檢測(cè)。在乳品中黃曲霉毒素檢測(cè)方面常與QuEChERS技術(shù)結(jié)合萃取, QuEChERS技術(shù)最早于2003年由化學(xué)家Lehotay和Anastassiadas提出[18]。經(jīng)過(guò)不斷的技術(shù)優(yōu)化,已廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留的分析檢測(cè)中,QuEChERS技術(shù)分為提取、鹽析和凈化3個(gè)重要步驟。于建玉等[19]選擇50 mg NH2和50 mg PSA作為分散固相萃取材料對(duì)牛奶提取液進(jìn)行凈化處理, 基于改進(jìn)的QuECh-ERS技術(shù)建立了檢測(cè)牛奶中黃曲霉毒素M1方法, 方法回收率為93.4%～102.2%,檢出限為0.02μg/kg, 比國(guó)標(biāo)中免疫親和柱法更為簡(jiǎn)便, 縮短了分析時(shí)間, 更適用于大批量樣品的檢測(cè)分析。曲斌等[20]建立了一種以QuEChERS作為前處理方法的生鮮牛乳中黃曲霉毒素M1的快速測(cè)定方法。生鮮牛乳以Sampli Q萃取劑(內(nèi)含4 g硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸三鈉二水結(jié)晶鹽、0.5 g檸檬酸氫二鈉半水結(jié)晶鹽)提取,在Sampli Q凈化管(內(nèi)含900 mg硫酸鎂、150 mg C18)中凈化并濃縮后,以超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定。黃曲霉毒素M1在0.1～20.0μg/kg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,回收率大于80%,檢測(cè)限為0.05μg/kg。特別適用于在復(fù)雜基質(zhì)中對(duì)目標(biāo)化合物的快速、批量篩選,同時(shí)提供準(zhǔn)確的定性定量分析結(jié)果, 見(jiàn)表2。

表2 牛奶基質(zhì)分散固相萃取凈化黃曲霉毒素

1.2.4 免疫親和色譜（Immunoaffinity chromatography,IAC）

免疫親和色譜法是一種以抗體與惰性基質(zhì)固相載體偶聯(lián)為基礎(chǔ)的新型固相萃取技術(shù), 該方法特異性強(qiáng)、選擇性好、高效靈敏。隨著技術(shù)的發(fā)展, 部分真菌毒素的免疫親和柱已實(shí)現(xiàn)商品化, 但是價(jià)格昂貴。徐燕等[21]建立了牛乳、酸牛乳及乳粉中AFM1殘留的高效液相色譜分析方法。以亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉淀蛋白質(zhì)和脂肪, 將樣品過(guò)免疫親和柱固相萃取凈化, 方法回收率為71.0%～80.5%, 檢出限0.003μg/kg。該法提取樣品簡(jiǎn)單方便, 檢測(cè)速度快, 所用試劑少, 適合大批量樣品處理。黃雋灝等[22]使用免疫親和柱凈化高效液相色譜法測(cè)定生鮮乳樣品, 陽(yáng)性樣品加標(biāo)回收率在95.00%～105.00%之間, RSD＜5.00%, 加標(biāo)回收試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性均達(dá)到測(cè)定生鮮乳中AFM1含量的要求。劉云花等[23]建立了同時(shí)檢測(cè)生鮮牦牛乳中的AFM1及AFM2的分析方法。樣品經(jīng)低溫離心, 過(guò)免疫親和柱凈化, 甲醇洗脫, 結(jié)果顯示線性關(guān)系良好, 回收率為82.1%～95.5%, 檢出限為0.0015～0.1μg/kg。結(jié)果表明生鮮牦牛乳中黃曲霉毒素M1和M2安全可控。為其它基質(zhì)中黃曲霉毒素的同時(shí)檢測(cè)提供技術(shù)支持, 見(jiàn)表3。

表3 免疫親和柱凈化黃曲霉毒素

1.2.5 凝膠滲透色譜（Gel Permeation Chromatography,GPC）

凝膠滲透色譜技術(shù)是利用溶質(zhì)分子體積大小的不同使其在凝膠色譜柱上的保留時(shí)間有所差異進(jìn)行基質(zhì)待測(cè)物分離的, 其優(yōu)點(diǎn)在于分析速度快, 能重復(fù)利用柱子, 重現(xiàn)性好, 能夠快速分離出樣品基質(zhì)中的大分子油脂和色素等雜質(zhì)。段兵等[24]針對(duì)乳品中的安全問(wèn)題, 結(jié)合GPC技術(shù)樣品過(guò)Bio-Beads S-X3凈化柱, 用乙酸乙酯-環(huán)己烷(1∶1,體積比)作為流動(dòng)相, 建立了檢測(cè)奶及奶粉樣品中AFM1的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的分析方法, 加標(biāo)回收率為72.4%～92.2%。結(jié)果表明GPC技術(shù)能夠有效地去除奶及奶粉中蛋白質(zhì)和脂肪等大分子干擾物質(zhì)。該方法穩(wěn)定性高, 操作簡(jiǎn)單安全, 成本低, 快速準(zhǔn)確, 適用于乳品中AFM1的快速測(cè)定。

2 測(cè)定方法

樣品經(jīng)過(guò)前處理之后就需要選擇合適的測(cè)定方法進(jìn)行檢測(cè)。目前乳品中黃曲霉毒素的檢測(cè)方法主要有以下幾種：薄層色譜分析法（TLC）[25]、高效液相色譜法（HPLC）[26]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLCMS）[27-28]、酶聯(lián)免疫測(cè)定法（ELISA）[29-30]以及膠體金法（GICA）[31]。近年來(lái), 色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成了污染殘留檢測(cè)的主流技術(shù)。

2.1 色譜分析技術(shù)

2.1.1 薄層色譜分析法(TLC)

該方法適合對(duì)真菌毒素進(jìn)行定性研究。主要是將某種特定物質(zhì)作為固定相涂布于玻璃或塑料板上, 再用某種溶劑作為流動(dòng)相在紫外光照射下對(duì)經(jīng)過(guò)前處理的樣品基質(zhì)進(jìn)行定性定量。20世紀(jì)60年代被廣泛應(yīng)用于乳品中AFM1的大規(guī)模篩選中。但其步驟多, 耗費(fèi)大量試劑, 干擾因素多, 測(cè)定一個(gè)樣品需要2～3 d時(shí)間, 且該方法的主要缺點(diǎn)是靈敏度不高且定量不準(zhǔn), 缺乏特異性和安全性, 無(wú)法達(dá)到高通量分析的檢測(cè)要求, 已逐步被其他更高效便捷的檢測(cè)方法所取代, 近些年很少有文獻(xiàn)報(bào)道。

2.1.2 高效液相色譜法(HPLC)

高效液相色譜技術(shù)是20世紀(jì)60年代后期發(fā)展起來(lái)的一種新一代色譜測(cè)定技術(shù)。GB5009.24-2016[32]中給出的高效液相色譜法雖然對(duì)技術(shù)和操作要求比較高, 使用化學(xué)藥劑和處理方式較為繁瑣, 但是在基層實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用最廣泛。朱丹倩等[33]參考國(guó)標(biāo)用甲醇-水溶液作為試樣提取劑, 用甲醇∶水=54∶46（體積比）作為流動(dòng)相, 加吡啶鎓三溴化物為衍生劑, 來(lái)提高檢測(cè)靈敏度, 并且使試樣可同時(shí)檢測(cè)黃曲霉毒素B族。選擇用甲醇洗脫待測(cè)物, 氮吹至1 mL以下直接加水稀釋至1 mL來(lái)減少溶劑效應(yīng)的產(chǎn)生。加標(biāo)試驗(yàn)回收率在83.6%～94.2%, 方法檢出限為0.02μg/kg, 該方法簡(jiǎn)便快捷, 準(zhǔn)確性好, 靈敏度高。張勝利[34]在現(xiàn)行國(guó)標(biāo)基礎(chǔ)上建立了UPLC-FLD法測(cè)定奶制品中黃曲霉毒素M1的檢測(cè)方法。以甲醇∶水∶乙腈=15∶75∶15（體積比）作為流動(dòng)相, 采用等度洗脫方式, 在進(jìn)樣量為3μL的參數(shù)設(shè)置下, 測(cè)得該方法的檢出限為0.003μg/kg, 定量限為0.01μg/kg, 加標(biāo)試樣回收率為93.1%～106.0%, 精密度為0.99%～1.98%。該方法操作簡(jiǎn)便、回收率高、檢測(cè)時(shí)間短, 為乳制品中AFM1檢測(cè)提供了參考價(jià)值。丁儉等[35]利用在線固相萃取富集結(jié)合高效液相色譜建立了能夠快速檢測(cè)牛奶中AFM1的方法。牛奶樣品直接進(jìn)樣, 以乙腈-水（15∶85, 體積比）作為流動(dòng)相, 6次加標(biāo)回收率為98%～105.7%, 檢出限為0.04μg/kg, 具有操作簡(jiǎn)便, 耗時(shí)短的優(yōu)點(diǎn)。ShifaShuib等[36]建立了一種柱后光化學(xué)衍生法與HPLC相結(jié)合的檢測(cè)方法, 無(wú)需使用危險(xiǎn)的化學(xué)溶劑, 衍生程序自動(dòng)化, 增加了AFM1的熒光性以提高靈敏度, 可檢測(cè)出低于歐盟限量標(biāo)準(zhǔn)的AFM1含量, 并提出該方法可擴(kuò)展到同時(shí)測(cè)定其他黃曲霉毒素, 見(jiàn)表4。

表4 HPLC檢測(cè)黃曲霉毒素

2.1.3 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（HPLC-MS/MS）

近些年被廣泛應(yīng)用的色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)既保留了液相色譜的高分離性能, 又增加了質(zhì)譜的高靈敏度及其對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量的強(qiáng)篩選能力, 能做到同時(shí)對(duì)多種真菌毒素進(jìn)行定性和定量分析, 已成為目前主流的檢測(cè)技術(shù)。因?yàn)樵摲椒軌蚩朔z測(cè)過(guò)程中雜質(zhì)峰的干擾, 有助于化合物的準(zhǔn)確定性定量。華宇等[37]建立了乳粉中AFM1的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)方法。該方法省去了國(guó)標(biāo)中用10 mL水淋洗凈化柱以及用乙腈或甲醇洗脫親和柱的過(guò)程, 回收率在85.64%～120.14%, 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.08%～5.14%, 定量限為0.06μg/kg, 檢出限為0.02μg/kg。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法在較高檢測(cè)準(zhǔn)確度的前提下, 不僅節(jié)省溶劑, 還縮短了前處理時(shí)間。陳慧玲等[38]在測(cè)定液體奶及奶粉中AFM1的驗(yàn)證方法中應(yīng)用了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的檢測(cè)方法, 該方法檢出限為0.003μg/kg,定量限為0.01μg/kg, 并實(shí)際檢測(cè)了55份市售樣品,檢出率為20%,表明該方法實(shí)用可靠,見(jiàn)表5。但這一檢測(cè)技術(shù)目前還存在所需儀器昂貴, 樣品前處理繁瑣耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn), 仍有待提高改進(jìn)之處。

表5 HPLC-MS/MS檢測(cè)黃曲霉毒素

2.2 免疫分析技術(shù)

2.2.1 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)

該方法的優(yōu)勢(shì)在于操作簡(jiǎn)單安全, 但由于酶是高活性物質(zhì), 穩(wěn)定性不強(qiáng), 容易造成假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。孫清等[39]通過(guò)以辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的AFB1作為競(jìng)爭(zhēng)抗原, 成功制備了能與進(jìn)口試劑盒檢測(cè)結(jié)果相比的能同時(shí)檢測(cè)液態(tài)奶、酸奶和奶粉中AFB1和AFM1的ELISA試劑盒, 該試劑盒的最低檢測(cè)限（IC10）為37 pg/mL, （IC50）為211 pg/mL, 在加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中回收率在87.9%～109.1%之間, 批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.9%～10.8%之間。李江等[40]用酶聯(lián)免疫法測(cè)定樣品中AFB1和AFM1, 用60%甲醇-水提取樣品, 1∶4純水稀釋, 選取加標(biāo)濃度為0.2、0.4和0.8μg/kg做3個(gè)平行。測(cè)得此方法對(duì)AFB1和AFM1的回收率結(jié)果均在90%～110%之間, 方法快速穩(wěn)定, 適用于乳制品中AFB1和AFM1的檢測(cè)。裴世春等[41]自主開(kāi)發(fā)的抗AFM1單克隆抗體偶聯(lián)HRP后建立了直接競(jìng)爭(zhēng)-酶聯(lián)免疫吸附（dc-ELISA）檢測(cè)AFM1體系, 采用MD6無(wú)血清培養(yǎng)基經(jīng)高密度培養(yǎng)分泌抗AFM1單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞后獲得高純度抗AFM1單克隆抗體, 并利用AFM1污染標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)檢測(cè)體系靈敏度和精確性進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示dc-ELISA可滿足鮮乳中AFM1國(guó)家殘留限量標(biāo)準(zhǔn)0.5μg/kg的檢測(cè)要求。該該體系可應(yīng)用于鮮奶制品中AFM1大于0.5μg/kg污染樣品的快速初篩。Bolong等[42]開(kāi)發(fā)了一種間接競(jìng)爭(zhēng)性等離子體酶聯(lián)免疫分析法, 用葡萄糖氧化酶（GOX）誘導(dǎo)金納米棒（AuNRs）的氧化還原反應(yīng), 氧化石墨烯誘導(dǎo)金納米棒的顯色反應(yīng)達(dá)到對(duì)牛奶中AFM1進(jìn)行定性和定量檢測(cè)的目的。該方法特異性高, 回收率高, 靈敏度高, 見(jiàn)表6。

表6 ELISA檢測(cè)黃曲霉毒素

2.2.2 膠體金免疫層析法（GIGA）

膠體金免疫層析法是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一種快速免疫分析技術(shù), 利用納米金作為標(biāo)記物與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合被相應(yīng)配體捕獲的原理進(jìn)行定性或定量測(cè)定[43]。其最大缺點(diǎn)為試紙條和試劑盒保存時(shí)間有限, 在常溫下不能長(zhǎng)久保存。武玉香等[44]建立了定性測(cè)定羊奶中AFM1膠體金免疫層析試紙條, 檢測(cè)限達(dá)到0.5μg/L, 檢測(cè)結(jié)果顯示與其他結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率低于5%, 與不同族的其他物質(zhì)的交叉反應(yīng)率小于1%, 假陽(yáng)性率小于5%, 假陰性率為0, 滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。吳成輝等[45]建立了新型的“雙檢測(cè)限”膠體金免疫層析試紙條, 一步就能快速檢測(cè)篩查牛奶中AFM1的含量是符合中國(guó)還是歐盟的限量標(biāo)準(zhǔn), 檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.05 ng/mL。在與ELISA比對(duì)試驗(yàn)中, 本方法與其顯示出了較高的一致性, 可用于基層AFM1的現(xiàn)場(chǎng)快速篩查。羅曉琴等[46]采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒,將單克隆抗體膠體金標(biāo)記物凍干成微孔試劑。所研制的黃曲霉毒素M1快速檢測(cè)試紙條的檢測(cè)限為0.3μg/L,檢測(cè)時(shí)間為10 min,假陽(yáng)性率和假陰性率為0。試紙條使用簡(jiǎn)單方便,適合進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)牛奶中殘留的黃曲霉毒素M1。黃艷梅等[47]采用EDC/NHS法制備了偶聯(lián)抗AFM1單克隆抗體的免疫磁珠與待檢樣品混合,能夠很好地分離目標(biāo)物,并用免疫層析試紙條檢測(cè),檢出限為0.1μg/L,適用于乳品中AFM1的快速檢測(cè), 見(jiàn)表7。

表7 GICA檢測(cè)黃曲霉毒素

3 結(jié)論

為確保市場(chǎng)上乳制品的安全, 提高黃曲霉毒素的檢測(cè)能力已成為保障食品安全和人類健康的迫切需求。目前各種檢測(cè)技術(shù)基本成熟。對(duì)于某類樣品基質(zhì)中單個(gè)或一類真菌毒素的分析檢測(cè)方法有很多, 未來(lái)可以從簡(jiǎn)化乳品前處理方法、研制便攜式、能快速對(duì)大量樣品做定量檢測(cè)的檢測(cè)設(shè)備以及建立一種一次性同時(shí)檢測(cè)某種樣品基質(zhì)中多種真菌毒素的方法這些方面進(jìn)行探索, 開(kāi)發(fā)高通量、低成本的檢測(cè)方法。