劉旸, 劉九陽, 李原野, 王淼, 房玉國, 張麗宏, 黃曉林, 夏行昊, 齊會(huì)娟

（1.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院, 哈爾濱 150028；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院, 哈爾濱 150036；3.黑龍江惠豐乳品有限公司大慶分公司, 黑龍江 大慶 163000）

0 引言

生物素B7是一種無色或白色結(jié)晶粉末物質(zhì)[1-6], 是水溶性B族維生素[7-10]。生物素在人體中主要以羧化酶輔酶[11-13]的形式參與細(xì)胞中脂肪、蛋白質(zhì)以及糖類代謝等一切生命活動(dòng)[14-15]。生物素不能人體合成, 必須通過含有或添加生物素的食品中獲得。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn), 一般用1.0 mol/L硫酸提取植物源性食品中生物素[16]；而對動(dòng)物源性食品中生物素則采用3.0 mol/L硫酸進(jìn)行提取[17]。GB 5009.259-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中生物素測定》對嬰幼兒配方食品中生物素則是采用3 %（約0.5 mol/L）硫酸進(jìn)行提取[18]。為驗(yàn)證3種不同濃度的硫酸對嬰幼兒配方奶品中生物素的提取效果, 用微生物法測定進(jìn)行比較。最后基于該提取生物素方法, 通過實(shí)驗(yàn)室間比對的方式, 對微生物法測定嬰幼兒配方食品中生物素的精密度進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯化鈉（AR）、無水乙醇（AR）、硫酸（98%）（AR）、氫氧化鈉（AR）, 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；生物素標(biāo)準(zhǔn)品（C10H16N2O3S, CAS：58-85-5, 純度≥98 %）, 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基, 美國BD Difco；乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基, 美國BD Difco；生物素測定用培養(yǎng)基, 美國BD Difco。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱, 德國MMM；722分光光度計(jì), 上海光譜儀器；電子分析天平, 北京賽多利斯；pH計(jì), 北京賽多利斯；蓋勃離心機(jī)；破壁料理機(jī), 美國Westinghouse。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備[18-22]

將實(shí)驗(yàn)用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum,ATCC 8014）菌株活化后, 接種到乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基上, 36±1℃培養(yǎng)16～24 h, 再轉(zhuǎn)種2代～3代來增強(qiáng)活力。將24 h內(nèi)活化后的菌株接種到乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基中, 36±1℃培養(yǎng)16～24 h, 以大于3 000轉(zhuǎn)/min離心5 min, 棄去上清液, 加入10 mL生理鹽水, 用渦旋混合器振蕩該懸液。再離心5 min, 棄去上清液。如前操作清洗2～3次后, 再加10 mL生理鹽水, 混勻。吸取0.5～1.0 mL該菌懸液于10 mL生理鹽水中, 混勻制成測試菌懸液。以生理鹽水做空白, 用分光光度計(jì)于550 nm波長下測定測試菌懸液透光率T（%）, 調(diào)整上述菌液加入量, 使測試菌懸液透光率在60%～80%。

1.3.2 測定用樣品及制備和保存

1.3.2.1 測定用樣品信息

1#嬰幼兒配方粉（中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測試評(píng)價(jià)中心的質(zhì)控樣品, 證書編號(hào)為803IP04051, Lot 2017.09.19）；特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方奶粉：2#氨基酸配方, 適用于食物蛋白過敏嬰兒, 0～12個(gè)月適用, 未添加乳糖（Lot 2017.09.19）；3#無乳糖配方粉, 0～12個(gè)月乳糖不耐受嬰兒（Lot 20180114）；4#早產(chǎn)兒/低體重出院后配方粉, 0～12個(gè)月出院后的早產(chǎn)兒（Lot 20180205）；5#乳蛋白深度水解配方（Lot 05/26/11）；6#乳蛋白部分水解嬰兒配方乳粉, 0～1個(gè)月（Lot 2017.09.12）。6個(gè)樣品用1#～6#表示。

1.3.2.2 測定用樣品制備和保存

1#嬰幼兒配方粉, 每個(gè)包裝冷凍到-20℃存放, 使用前恢復(fù)室溫使用。

特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品2#～6#, 均質(zhì)后分裝成小包裝, 室溫避光封口保存。

1.3.2.3 參與實(shí)驗(yàn)室間比對的實(shí)驗(yàn)

A為本實(shí)驗(yàn)室（北方）, B為本地社會(huì)第三方實(shí)驗(yàn)室（北方）, C為本地質(zhì)監(jiān)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室（北方）, D為質(zhì)檢系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室（南方）；E為藥監(jiān)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室（南方）。

5家實(shí)驗(yàn)室用A-E表示。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.3.1 樣品的測定

1#嬰幼兒配方粉和2#～6#特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品：分別加入50 mL 3、1 mol/L和0.5 mol/L硫酸在121℃下水解30 min。

以上樣品經(jīng)硫酸高壓水解后, 取出迅速水浴冷卻至室溫。用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至4.5±0.2, 移入250 mL容量瓶中用水定容至刻度。用定量濾紙過濾, 最初約10 mL濾液應(yīng)棄去, 吸取5 mL濾液于100 mL燒杯中, 加水約20 mL, 用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.8±0.2, 移入100 mL容量瓶中加水定容至刻度。標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品測定參照GB 5009.259-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中生物素測定》[18、23-26]。

1.3.3.2 實(shí)驗(yàn)室間重復(fù)性和再現(xiàn)性證實(shí)實(shí)驗(yàn)[27-29]

實(shí)驗(yàn)室間方法驗(yàn)證方法參照GB/T 6379.2-2004《測量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度(正確度與精密度)第2部分：確定標(biāo)準(zhǔn)測量方法重復(fù)性與再現(xiàn)性的基本方法》[30]。算上本中心共5家實(shí)驗(yàn)室參與本次實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證, 其中6個(gè)樣品為6個(gè)水平, 每個(gè)樣品測定7次。

2 結(jié)果與分析

2.1 食品中生物素提取條件的確定

用1#嬰幼兒配方粉分別進(jìn)行提取預(yù)試驗(yàn), 3個(gè)樣品分別同時(shí)用0.5 mol/L硫酸溶液、1 mol/L硫酸溶液和3 mol/L硫酸溶液進(jìn)行121℃下水解30 min前處理, 水解后, 快速冷卻到室溫后觀察, 見表1。

表1 1#樣品在不同濃度硫酸水解的結(jié)果比對試驗(yàn)

2.2 精密度值（重復(fù)性和再現(xiàn)性）證實(shí)實(shí)驗(yàn)[30]

2.2.1 原始數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)均值

為方法驗(yàn)證各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的原始數(shù)據(jù), 并求出了實(shí)驗(yàn)室內(nèi)算術(shù)均值。驗(yàn)證數(shù)據(jù)為各個(gè)實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立測定并出具, 加蓋各個(gè)實(shí)驗(yàn)室公章, 見表2。

表2 原始數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)均值

（續(xù)表2）

2.2.2 一致性和離群值的檢驗(yàn)

根據(jù)表2進(jìn)行一致性和離群值的檢查, 采用了檢驗(yàn)一致性的方法（曼德爾h統(tǒng)計(jì)量和曼德爾k統(tǒng)計(jì)量）, 和檢驗(yàn)離群值的數(shù)值方法（科克倫檢驗(yàn)Cochran和格拉布斯檢驗(yàn)Grubbs）。具體計(jì)算公式參照GB/T 6379.2-2004《測量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度(正確度與精密度)第2部分：確定標(biāo)準(zhǔn)測量方法重復(fù)性與再現(xiàn)性的基本方法》[30]計(jì)算出曼德爾統(tǒng)計(jì)量k和h, 并繪制出圖1和圖2。并根據(jù)2.2.3.4（1）顯著水平為5 %、1 %時(shí)曼德爾統(tǒng)計(jì)量h的臨界值和2.2.3.5（1）顯著水平為5 %、1 %時(shí)曼德爾統(tǒng)計(jì)量k的臨界值進(jìn)行判定。

2.2.2.1 曼德爾h統(tǒng)計(jì)量和曼德爾k統(tǒng)計(jì)量

由表2可知, 對每個(gè)實(shí)驗(yàn)室的每個(gè)水平, 計(jì)算實(shí)驗(yàn)室間的一致性統(tǒng)計(jì)量h（曼德爾h統(tǒng)計(jì)量）, 如圖1所示。

由圖1可知, 5個(gè)實(shí)驗(yàn)室都處于正確值范圍內(nèi), 可以進(jìn)一步驗(yàn)證, 對每個(gè)實(shí)驗(yàn)室, 計(jì)算實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的一致性統(tǒng)計(jì)量k（曼德爾k統(tǒng)計(jì)量）, 如圖2所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分組的實(shí)驗(yàn)室間一致性曼德爾統(tǒng)計(jì)量

圖2 實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分組的實(shí)驗(yàn)室間一致性曼德爾統(tǒng)計(jì)量

由圖2可知, 根據(jù)B實(shí)驗(yàn)室、第6水平和E實(shí)驗(yàn)室第2水平為歧離值；D實(shí)驗(yàn)室的第2、4水平為統(tǒng)計(jì)離群值；E實(shí)驗(yàn)室第5水平為統(tǒng)計(jì)離群值。

2.2.2.2 科克倫檢驗(yàn)（Cochran離群值檢驗(yàn)）

科克倫檢驗(yàn)為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異的檢驗(yàn), 根據(jù)表2具體計(jì)算公式參照GB/T 6379.2-2004《測量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度(正確度與精密度)第2部分：確定標(biāo)準(zhǔn)測量方法重復(fù)性與再現(xiàn)性的基本方法》[30], 并根據(jù)表3柯克倫檢驗(yàn)的臨界值進(jìn)行判定。

由表3可知, D實(shí)驗(yàn)室第2、4水平是歧離值；E實(shí)驗(yàn)室第5水平是統(tǒng)計(jì)離群值, 與曼德爾的k統(tǒng)計(jì)量一致。

表3 科克倫統(tǒng)計(jì)量（C）

2.2.3 格拉布斯檢驗(yàn)（Grubbs檢驗(yàn)）

根據(jù)表2, 當(dāng)實(shí)驗(yàn)室數(shù)量為5個(gè)時(shí), 具體計(jì)算公式參照GB/T 6379.2-2004《測量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度(正確度與精密度)第2部分：確定標(biāo)準(zhǔn)測量方法重復(fù)性與再現(xiàn)性的基本方法》[30]中格拉布斯檢驗(yàn)的臨界值如（1）、（2）進(jìn)行判定：

（1）一個(gè)最大（小）值GP（G1）：上5 %點(diǎn)的臨界值=1.715, 上1 %點(diǎn)的臨界值=1.764；

（2）兩個(gè)最大（小）GP-1,P（G1,2）值：下1 %點(diǎn)的臨界值=0.0018, 下5 %點(diǎn)的臨界值=0.0090。

2.2.3.1 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部格拉布斯檢驗(yàn)

（1）根據(jù)表2和表3中的歧離值, D實(shí)驗(yàn)室第2水平和D實(shí)驗(yàn)室第4水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部格拉布斯檢驗(yàn)。

（2）根據(jù)表2和曼德爾k統(tǒng)計(jì)量中的歧離值, 對B實(shí)驗(yàn)室第6水平, E實(shí)驗(yàn)室第2水平這兩個(gè)歧離值進(jìn)行法格拉布斯檢驗(yàn), 經(jīng)判定B實(shí)驗(yàn)室第6水平7個(gè)數(shù)據(jù)中最大值14.2μg/100 g的離散度和標(biāo)準(zhǔn)偏差大于其他數(shù)據(jù), 按標(biāo)準(zhǔn)要求, 予以剔除。E實(shí)驗(yàn)室第2水平7個(gè)數(shù)據(jù)都是正確值, 均保留。

2.2.3.2 實(shí)驗(yàn)室間的格拉布斯檢驗(yàn)

按照GB/T 6379.2-2004《測量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度(正確度與精密度)第2部分：確定標(biāo)準(zhǔn)測量方法重復(fù)性與再現(xiàn)性的基本方法》[30]中的規(guī)定, 科克倫統(tǒng)計(jì)量（C）、曼德爾h統(tǒng)計(jì)量、曼德爾k統(tǒng)計(jì)量中出現(xiàn)的統(tǒng)計(jì)離群值, 考慮剔除部分?jǐn)?shù)據(jù)或者該實(shí)驗(yàn)室全部數(shù)據(jù)。對歧離值在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上考慮保留或者剔除。

（1）根據(jù)表2、曼德爾k統(tǒng)計(jì)量中以及表3的統(tǒng)計(jì)離群值, 進(jìn)行第2水平5個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行格拉布斯檢驗(yàn)。由2.2.3.1（1）可知, D實(shí)驗(yàn)室第2水平7個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部格拉布斯檢驗(yàn)也均為正確值。對D實(shí)驗(yàn)室剔除后, 按照其余4個(gè)實(shí)驗(yàn)室的總平均值升序重新排序B 9.93μg/100 g＜A 10.40μg/100 g＜C 10.95μg/100 g＜E 13.43μg/100 g, 再進(jìn)行格拉布斯檢驗(yàn)。經(jīng)判定第2水平D實(shí)驗(yàn)室所有數(shù)據(jù)是否剔除, 不影響第2水平的格拉布斯的檢驗(yàn)結(jié)果, 可以剔除。

（2）根據(jù)表2和曼德爾k統(tǒng)計(jì)量中的統(tǒng)計(jì)離群值, 進(jìn)行第2水平5個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行格拉布斯檢驗(yàn)。由2.2.3.1（2）可知, E實(shí)驗(yàn)室第2水平7個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部格拉布斯檢驗(yàn)也均為正確值。對E實(shí)驗(yàn)室剔除后, 按照其余4個(gè)實(shí)驗(yàn)室的總平均值升序重新排序B 9.93μg/100 g＜A 10.40μg/100 g＜C 10.95μg/100 g＜D 14.34μg/100 g, 再進(jìn)行格拉布斯檢驗(yàn)。經(jīng)判定第2水平E實(shí)驗(yàn)室所有數(shù)據(jù)是否剔除, 不影響第2水平的格拉布斯的檢驗(yàn)結(jié)果, 可以剔除。

（3）根據(jù)表2和曼德爾k統(tǒng)計(jì)量中的統(tǒng)計(jì)離群值, 進(jìn)行第2水平5個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行格拉布斯檢驗(yàn)。由2.2.3.1可知, 對D、E兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室剔除后, 按照其余3個(gè)實(shí)驗(yàn)室的總平均值升序重新排序B 9.93μg/100 g＜A 10.40μg/100 g＜C 10.95μg/100 g, 再進(jìn)行格拉布斯檢驗(yàn)。經(jīng)判定第2水平D、E兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室所有數(shù)據(jù)是否剔除, 不影響第2水平的格拉布斯的檢驗(yàn)結(jié)果, 可以剔除。但是（1）～（3）是否合理, 還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

（4）根據(jù)表2、曼德爾k統(tǒng)計(jì)量中以及表3的統(tǒng)計(jì)離群值, 進(jìn)行第4水平5個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行格拉布斯檢驗(yàn)。由2.2.3.1（1）可知, D實(shí)驗(yàn)室第4水平7個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部格拉布斯檢驗(yàn)也均為正確值。對D實(shí)驗(yàn)室剔除后, 按照其余4個(gè)實(shí)驗(yàn)室的總平均值升序重新排序E 11.13μg/100 g＜B 11.74μg/100 g＜A 16.29μg/100 g＜C 16.41μg/100 g, 再進(jìn)行格拉布斯檢驗(yàn)。第4水平D實(shí)驗(yàn)室所有數(shù)據(jù)是否剔除, 不影響第4水平的格拉布斯的檢驗(yàn)結(jié)果, 可以剔除。

（5）根據(jù)表2、曼德爾k統(tǒng)計(jì)量中以及表3的統(tǒng)計(jì)離群值, 對E實(shí)驗(yàn)室第5水平, 進(jìn)行格拉布斯檢驗(yàn), 經(jīng)判定E實(shí)驗(yàn)室第5水平7個(gè)數(shù)據(jù)中最大值26.6μg/100 g的離散度和標(biāo)準(zhǔn)偏差大于其他數(shù)據(jù), 按標(biāo)準(zhǔn)要求, 歧離值考慮剔除。

（6）根據(jù)表2、曼德爾k統(tǒng)計(jì)量中以及表3的統(tǒng)計(jì)離群值, 第5水平的E實(shí)驗(yàn)室的整組數(shù)據(jù)需要剔除。但是為了謹(jǐn)慎起見, 先對第5水平的5個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別進(jìn)行格拉布斯檢驗(yàn), 按照5個(gè)實(shí)驗(yàn)室的總平均值升序重新排序B 19.23μg/100 g＜E 21.68μg/100 g＜A 26.43μg/100 g＜C 27.93μg/100 g＜D 29.94μg/100 g, 經(jīng)判定5個(gè)實(shí)驗(yàn)室格拉布斯檢驗(yàn)都合格。

（7）根據(jù)表2、曼德爾k統(tǒng)計(jì)量中以及表3的統(tǒng)計(jì)離群值, 對第5水平5個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行格拉布斯檢驗(yàn)。由（6）可知, 最大值26.6μg/100 g先考慮剔除, 再參與5個(gè)實(shí)驗(yàn)室的格拉布斯檢驗(yàn)。剔除后的6組數(shù)據(jù)平均值依然為21.68μg/100 g。將剔除后的數(shù)據(jù), 按照5個(gè)實(shí)驗(yàn)室的總平均值升序重新排序, 發(fā)現(xiàn)排序與（2）一致, 再進(jìn)行格拉布斯檢驗(yàn)。E實(shí)驗(yàn)室第5水平7個(gè)數(shù)據(jù)的最大值26.6μg/100 g是否剔除, 都不影響格拉布斯檢驗(yàn), 可以剔除。

（8）根據(jù)表2和曼德爾k統(tǒng)計(jì)量中的統(tǒng)計(jì)離群值, 進(jìn)行第6水平5個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行格拉布斯檢驗(yàn)。由2.2.3.2可知, 將剔除后的數(shù)據(jù)按照5個(gè)實(shí)驗(yàn)室的總平均值升序重新排序E 10.2μg/100 g＜B 11.00μg/100 g＜A 13.90μg/100 g＜C 15.60μg/100 g＜D 20.37μg/100 g, 進(jìn)行格拉布斯檢驗(yàn), 經(jīng)判定5個(gè)實(shí)驗(yàn)室格拉布斯檢驗(yàn)都符合條件。

2.2.3.3 5個(gè)實(shí)驗(yàn)室及6個(gè)樣品水平的格拉布斯檢驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)《表3科克倫統(tǒng)計(jì)量（C）》和曼德爾k統(tǒng)計(jì)量, 分別對歧離值、統(tǒng)計(jì)離群值進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部、實(shí)驗(yàn)室間的格拉布斯檢驗(yàn)得出結(jié)論, 見表4。

表4 5個(gè)實(shí)驗(yàn)室及6個(gè)樣品水平的格拉布斯檢驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表4我們將重新進(jìn)行曼德爾h統(tǒng)計(jì)量、曼德爾k統(tǒng)計(jì)量、柯克倫（C）檢驗(yàn), 再次對剔除值、剔除實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行判定。

2.2.3.4 曼德爾h統(tǒng)計(jì)量再次判定

由于曼德爾h統(tǒng)計(jì)量只考查實(shí)驗(yàn)室間的一致性, 所以顯著水平不用考慮剔除值對其的影響。

（1）當(dāng)P=5顯著水平5 %臨界線±1.57, 顯著水平1 %臨界線±1.72；

（2）當(dāng)P=4顯著水平5 %臨界線±1.42, 顯著水平1 %臨界線±1.49；

（3）當(dāng)P=3顯著水平5 %臨界線±1.15, 顯著水平1 %臨界線±1.15。見表5。

表5 曼德爾的h統(tǒng)計(jì)量（實(shí)驗(yàn)室間一致性）

由表5可知, 第2水平、第4水平, 按照（2）判定, 均為正確值；其余水平按照（1）判定, 均為正確值。

2.2.3.5 曼德爾k統(tǒng)計(jì)量再次判定

由于曼德爾k統(tǒng)計(jì)量考查實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的一致性, 所以顯著水平不僅要考慮剔除實(shí)驗(yàn)室對其的影響, 還要考慮實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)個(gè)數(shù)對其的影響。

（1）當(dāng)P=5, n=7顯著水平5 %臨界線1.39, 顯著水平1 %臨界線1.55；

（2）當(dāng)P=5, n=6顯著水平5 %臨界線1.42, 顯著水平1 %臨界線1.59；

（3）當(dāng)P=4, n=7顯著水平5 %臨界線1.37, 顯著水平1 %臨界線1.51；

（4）當(dāng)P=3, n=7顯著水平5 %臨界線1.34, 顯著水平1 %臨界線1.46, 見表6。

表6 曼德爾的k統(tǒng)計(jì)量（實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部一致性）

由表6可知, 其中第5水平、第6水平, 按照（1）、（2）判定, 其中第2水平、第4水平按照（3）判定, 其中第2水平E實(shí)驗(yàn)室為歧離值, 其余均為正確值；其余按照（1）判定, 均為正確值。

2.2.3.6 柯克倫（C）檢驗(yàn)再次判定

由于柯克倫（C）檢驗(yàn)考查實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的變異, 所以顯著水平不僅要考慮剔除實(shí)驗(yàn)室對其的影響, 還要考慮實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)個(gè)數(shù)對其的影響。

（1）當(dāng)P=5, n=7顯著水平5 %臨界線0.4783, 顯著水平1 %臨界線0.5531；

（2）當(dāng)P=5, n=6顯著水平5 %臨界線0.5060, 顯著水平1 %臨界線0.5880；

（3）當(dāng)P=4, n=7顯著水平5 %臨界線0.5598, 顯著水平1 %臨界線0.6410；

（4）當(dāng)P=3, n=7顯著水平5 %臨界線0.6771, 顯著水平1 %臨界線0.7606, 見表7。

表7 科克倫統(tǒng)計(jì)量（C）

由表7可知, 第5水平、第6水平, 按照（1）、（2）判定, 均為正確值；第2水平、第4水平按照（3）判定, 均為正確值；其余按照（1）判定, 均為正確值。

由2.2.3.4～2.2.3.6可知, 曼德爾h統(tǒng)計(jì)量、曼德爾k統(tǒng)計(jì)量、柯克倫（C）檢驗(yàn)完全驗(yàn)證了之前的格拉布斯檢驗(yàn)對5個(gè)實(shí)驗(yàn)室、6個(gè)樣品水平的數(shù)據(jù)剔除、實(shí)驗(yàn)室剔除的正確性。我們只需再對曼德爾k統(tǒng)計(jì)量中其中第2水平E實(shí)驗(yàn)室這個(gè)歧離值, 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部、實(shí)驗(yàn)室間的格拉布斯檢驗(yàn), 就可以知道這兩個(gè)值是否進(jìn)行取舍。

2.2.3.7 對曼德爾k統(tǒng)計(jì)量再次判定的歧離值進(jìn)行格拉布斯檢驗(yàn)

對第2水平E實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部和實(shí)驗(yàn)室間的格拉布斯檢驗(yàn)。根據(jù)2.2.3.2（1）～（3）可知, 第2水平剔除E實(shí)驗(yàn)室后, 不影響其格拉布斯檢驗(yàn)結(jié)果, 但是是否剔除E實(shí)驗(yàn)室, 還要根據(jù)最后的重復(fù)性方差和再現(xiàn)性方差決定。

2.3 總平均值和方差Srj、SRj的計(jì)算[30]

具體計(jì)算公式參照GB/T 6379.2-2004《測量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度(正確度與精密度)第2部分：確定標(biāo)準(zhǔn)測量方法重復(fù)性與再現(xiàn)性的基本方法》[30]計(jì)算出總平均值和方差Srj、SRj。由2.2.3.3～2.2.3.6可知, 進(jìn)行未剔除第2水平D實(shí)驗(yàn)室和第4水平E實(shí)驗(yàn)室和剔除第2水平D實(shí)驗(yàn)室和第4水平E實(shí)驗(yàn)室的總平均值和標(biāo)準(zhǔn)差Srj、SRj的比較。見表8和表9。

由表8可知, 當(dāng)?shù)?水平未剔除E實(shí)驗(yàn)室時(shí), 重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差Srj=5.4956, 再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差SRj=5.4965。

表8 未剔除第2水平E實(shí)驗(yàn)室的總平均值和標(biāo)準(zhǔn)差Srj、SRj

表8 未剔除第2水平E實(shí)驗(yàn)室的總平均值和標(biāo)準(zhǔn)差Srj、SRj

項(xiàng)目（μg/100 g） 1# 2# 3# 4# 5# 6#總平均值images/BZ_54_1552_442_1584_472.png 25.32 11.18 15.32 13.89 25.04 14.21重復(fù)性方差S2rj 130.0011 30.2013 41.9920 52.1229 1.3197 0.6316再現(xiàn)性方S2Rj=S2rj+S2Lj 130.0303 30.2113 41.9341 52.0963 2.5585 1.6698 Srj 11.4018 5.4956 6.4801 7.2196 1.1488 0.7947 SRj=(S2rj+S2Lj)1/2 11.4031 5.4965 6.4757 7.2178 1.5995 1.2922

由2.2.3.7可知, 再計(jì)算剔除第2水平E實(shí)驗(yàn)室的總平均值, 見表9。

表9 剔除第2水平E實(shí)驗(yàn)室后的總平均值和標(biāo)準(zhǔn)差Srj、SRj

表9 剔除第2水平E實(shí)驗(yàn)室后的總平均值和標(biāo)準(zhǔn)差Srj、SRj

項(xiàng)目（μg/100 g） 1# 2# 3# 4# 5# 6#總平均值images/BZ_54_1552_442_1584_472.png 25.32 10.43 15.32 13.89 25.04 14.21重復(fù)性方差S2rj 130.0011 8.9198 41.9920 52.1229 1.3197 0.6316再現(xiàn)性方S2Rj=S2rj+S2Lj 130.0303 8.8997 41.9341 52.0963 2.5585 1.6698 Srj 11.4018 2.9866 6.4801 7.2196 1.1488 0.7947 SRj=(S2rj+S2Lj)1/2 11.4031 2.9832 6.4757 7.2178 1.5995 1.2922

由表9可知, 當(dāng)?shù)?水平剔除E實(shí)驗(yàn)室時(shí), 重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差Srj=2.9866, 再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差SRj=2.9832。第2水平E水平剔除歧離實(shí)驗(yàn)室后的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差和再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差明顯小于未剔除前, 即第4水平剔除E實(shí)驗(yàn)室全部數(shù)據(jù)。

根據(jù)2.2～2.3可知, 我們對5個(gè)實(shí)驗(yàn)室對6個(gè)樣品水平的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行取舍, 最后得出如下的結(jié)論, 見表10。

表10 5個(gè)實(shí)驗(yàn)室及6個(gè)樣品水平實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行取舍的最后結(jié)果

2.4 精密度值（重復(fù)性和再現(xiàn)性）和平均水平之間的函數(shù)關(guān)系的建立

表11 總平均值升序排列

表11 總平均值升序排列

實(shí)驗(yàn)室（μg/100 g）2# 4# 6# 3# 5# 1# 平均值images/BZ_54_1552_442_1584_472.png 10.4 13.9 14.2 15.3 25.0 25.3 17.35 Srj 3.0 7.2 0.8 6.5 1.1 11.4 5.00 SRj 3.0 7.2 1.3 6.5 1.6 11.4 5.17

由表11可知, 具體公式以及判定參照GB/T 6379.2-2004《測量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度(正確度與精密度)第2部分：確定標(biāo)準(zhǔn)測量方法重復(fù)性與再現(xiàn)性的基本方法》[30], 對重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差Srj和再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差SRj考慮以下3種類型的關(guān)系式：

（1）關(guān)系式Ⅰ：s=bm（通過原點(diǎn)的直線）；

（2）關(guān)系式Ⅱ：s=a+bm（截距為正的直線）；

關(guān)系式Ⅲ：lgs=c+dlgm（或s=Cmd）, d≤1（指數(shù)關(guān)系）, 見表12。

由表12可知, 根據(jù)相關(guān)系數(shù)R2判定, 關(guān)系式關(guān)系式Ⅰ和關(guān)系式Ⅱ最好。但是根據(jù)變異系數(shù)（100 S/m）%是一個(gè)常數(shù)的要求, 關(guān)系式Ⅰ：重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差Srj=30%和再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差SRj=31%。當(dāng)min=10.4μg/100g和max=25.3μg/100g時(shí), 關(guān)系式Ⅱ：重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差Srjmin=112.9 %、Srjmax=117.08%和再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差SRjmin=150.52%、SRjmax=169.89%, 顯然不理想。所以關(guān)系式Ⅰ：重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差Srj=30 m和再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差SRj=31 m最好。

表12 精密度值（重復(fù)性和再現(xiàn)性）和平均水平之間的函數(shù)關(guān)系

表12 精密度值（重復(fù)性和再現(xiàn)性）和平均水平之間的函數(shù)關(guān)系

關(guān)系式 Ⅰ Ⅱ ⅢSrj SRj Srj=0.30m相關(guān)系數(shù)R2=1.0000 SRj=0.31m相關(guān)系數(shù)R2=1.0000 Srj=1.1+0.0028m相關(guān)系數(shù)R2=1.0000 SRj=1.37+0.013m相關(guān)系數(shù)R2=1.0000 lgSrjj=0.28-0.086gm(或Srj=0.28m-0.086)相關(guān)系數(shù)R2=0.9999 lgSRj=0.31+0.14gm(或SRj=0.31m0.14)相關(guān)系數(shù)R2=0.9930

3 結(jié)論

3.1 嬰幼兒配方食品中生物素提取條件的確定

0.5、1 、3 mol/L 3種硫酸溶液處理后的1#樣品顏色深淺為0.5 mol/L＜1 mol/L＜3 mol/L, 顏色逐漸加深, 并且樣品都能過濾且正常, 可見這3個(gè)濃度的硫酸溶液都可以使用。對于1#嬰幼兒配方粉（質(zhì)控樣品）, 生物素標(biāo)準(zhǔn)值為28.0μg/100 g。用0.5 mol/L硫酸溶液進(jìn)行121℃下水解30 min前處理后, 兩次測出的結(jié)果分別為28.2μg/100g、28.7μg/100g。通過實(shí)驗(yàn)可以看出隨著硫酸溶液的濃度提高, 生物素的含量下降, 所以嬰幼兒配方食品用0.5 mol/L硫酸溶液進(jìn)行前處理。

3.2 精密度值（重復(fù)性和再現(xiàn)性）的確定