楊 萍， 陸嘉偉， 李翠環(huán)

（浙江農(nóng)林大學(xué)省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，杭州 311300）

0 引言

瓊脂糖凝膠電泳是DNA片段分離、檢測最常用的技術(shù)之一［1］，也是高校生物類專業(yè)實踐教學(xué)的重要環(huán)節(jié)。核酸染料與瓊脂糖凝膠中DNA片段結(jié)合后，在特定光譜照射下發(fā)出熒光條帶，從而指示DNA片段大小和質(zhì)量。溴化乙錠（EB）是瓊脂糖凝膠電泳最早使用也是最常用的核酸染料，其含有一個插入DNA堆積堿基之間的三環(huán)平面基團，經(jīng)艾姆斯實驗證實具有高度致癌性和致突變能力，對長期使用EB的實驗人員和環(huán)境存在危害性［2］。隨著對核酸染料研究的深入以及化學(xué)合成技術(shù)的發(fā)展，近幾年一些新型核酸染料已上市，其中SYBR Green I、GeneFinder和4s Green plus屬于花青素類［3-5］；GeneGreen［6］和GeneRed是以花菁為根基將苯環(huán)改良成鏈式結(jié)構(gòu)的油性大分子，GeneRed是TIANGENE公司開發(fā)的新型核酸染料，上市不久相關(guān)文獻報道不多；SYBR Safe化學(xué)結(jié)構(gòu)與噻唑橙非常相似［7］；Goldview是吖啶橙類核酸染料［8］；GelRed和GelGreen均為二聚體的插層染料，具有獨特的油性和大分子量特點，與DNA結(jié)合的親和力比單體大很多［9］。在瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段過程中會出現(xiàn)核酸染料與部分DNA片段結(jié)合后發(fā)生電泳條帶遲滯或變形現(xiàn)象，這樣就造成目的基因片段鑒定的不確定性［10］。核酸染料的靈敏度與其在光譜下顯示的熒光信號強弱息息相關(guān)。有研究表明，EB靈敏度高于SYBR Green I和Gold View，但也有實驗證明SYBR Green I靈敏度高于EB［11］，出現(xiàn)這樣靈敏度結(jié)果不一致的原因一方面與DNA片段大小有關(guān)；另一方面受到染色方式的影響。膠染法是瓊脂糖凝膠電泳中最普遍的電泳染色方式，GeneFinder的膠染法效果明顯優(yōu)于泡染法和預(yù)染法［12］。另外，眾多文獻資料和實驗指導(dǎo)教材很少標明瓊脂糖凝膠電泳過程中核酸染料的濃度和使用量，因此核酸染料量化使用需要進一步探索。

本文通過瓊脂糖凝膠電泳的染色效果、靈敏度、染色方式和核酸染料的安全性以及性價比等方面對EB和9種新型核酸染料進行綜合評價，試圖尋找高效安全的核酸染料替代EB在瓊脂糖凝膠電泳中的應(yīng)用。提倡在保證實驗結(jié)果的前提下盡量減少核酸染料的使用量，從實驗室污染的源頭抓起，減少對人體和環(huán)境的危害。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

核酸染料：Gelred、GelGreen（Biotium公司），SYBR Green I、4s Green Plus（上海源葉生物科技有限公司），GeneGreen、GeneRed（天根生化科技有限公司），GeneFinder（廈門致善生物科技有限公司），GoldView（承勒科技有限公司），EB、SYBR Safe（APExBIO公司）。

核酸染料原始濃度為10000×，用1×TAE緩沖液按照10000∶1、10000∶0.5、10000∶0.2比例稀釋，輕輕震蕩混勻，使核酸染料最終濃度為1×、0.5×和0.2×，避光低溫貯存。DL5000DNA Marker（TAKARA公司，5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100 bp）。

1.2 實驗方法

1.2.1 膠染法

（1）取20 mL、1.5%瓊脂糖凝膠與2 μL、1×核酸染料充分混合后制膠，待膠室溫充分凝結(jié)后，將DL5000DNA Marker以5、10、20、30、40、50 ng量點樣于膠孔中。電泳參數(shù)為電壓125 V，電泳時間40 min；觀察核酸染料的染色效果。

（2）取20 mL、1.5%瓊脂糖凝膠，分別加入2 μL的1×、0.5×、0.2×核酸染料充分混合后制膠，待膠室溫充分凝結(jié)后，將DL5000DNA Marker以5、10、20、30、40、50 ng量點樣于膠孔中。電泳參數(shù)為電壓100 V，電泳時間50 min；觀察核酸染料的靈敏度。

1.2.2 泡染法

取4 μL、1×核酸染料與40 mL、1×TAE緩沖液混勻制備成泡染液，避光低溫貯存。制備N塊20 mL、1.5%瓊脂糖凝膠，將DL5000DNA Marker以5、10、20、30、40、50 ng量點樣于膠孔中，電泳參數(shù)同上述膠染法（1），電泳后的凝膠完全浸泡到泡染液中，暗處泡染60 min，依次更換電泳后瓊脂糖凝膠，觀察連續(xù)泡染N次后核酸染料的染色效果。

1.2.3 預(yù)染法

制備20 mL、1.5%瓊脂糖凝膠，將DL5000DNA Marker以5、10、20、30、40、50 ng量分別與1 μL、1×核酸染料和1×TAE緩沖液預(yù)先混勻后，點樣于膠孔中，電泳參數(shù)同上述膠染法（1），觀察核酸染料的染色效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 核酸染料的染色效果與靈敏度

2.1.1 核酸染料的染色效果

核酸染料的膠染法染色效果見圖1。不同核酸染料與DNA片段結(jié)合后電泳遷移率差異較大，EB、GeneGreen和GelGreen的DNA片段遷移率較快，4s green plus的DNA片段相對遲滯，GelRed和GeneRed的DNA片段遷移率相差不大。隨著DL5000DNA Marker上量樣增加，電泳條帶的亮度增大，GelRed、GeneRed、GelGreen、GeneGreen、4s green plus、Goldview和EB均檢測到DL5000DNA Marker所有條帶，條帶清晰易辨（圖1中6泳道）；SYBR Green I顯示的1000 bp片段條帶發(fā)生明顯前移或“拖尾”現(xiàn)象，GelGreen、GeneGreen和GeneRed顯示的1000 bp片段條帶發(fā)生輕微前移或變形（圖1中4～6泳道）；馬強等［6］在含GeneGreen的瓊脂糖凝膠電泳中觀察到類似情況。SYBR Safe檢測不到100～250 bpDNA小片段條帶（圖1（c））；GeneFinder顯示500 bp以上DNA大片段條帶模糊不清（圖1（d））；Goldview電泳背景噪性相對較高（圖1（b）），這與王洪梅等［13］的研究結(jié)果一致。

圖1 不同核酸10種染料的凝膠電泳染色效果

可見，EB和9種新型核酸染料的染色效果差異較大。主要原因是核酸染料的化學(xué)特性決定了與DNA片段結(jié)合方式和程度存在差異［9］，其次核酸染料的濃度過高會造成電泳部分條帶遲滯或變形。

2.1.2 核酸染料的靈敏度

采用膠染法，將核酸染料（1×、0.5×、0.2×）與DL5000DNA Marker（5、10、20、30、40、50 ng）交叉考量核酸染料的靈敏度，電泳時間50 min，略長。結(jié)果顯示GelRed的靈敏度最好，0.2×GelRed可以清晰顯示5 ng DNA marker所有DNA條帶5000～100 bp（圖2）；GeneRed的靈敏度次之，0.5×GeneRed可以清晰顯示10 ng DNA marker所有條帶5000～100 bp（圖3）。GelRed、GeneRed屬于二聚體插層染料，與DNA片段結(jié)合的親和力高于單體核酸染料，其靈敏度較高。余虹瑩等［14］認為20×或30×Gelred適合3%瓊脂糖凝膠電泳，其結(jié)論僅顯示為PCR反應(yīng)產(chǎn)物的條帶。與GelRed、GeneRed相比，其他核酸染料的靈敏度較弱。當減少核酸染料用量時，即核酸染料稀釋濃度為0.5×、0.2×，EB、GoldView可以顯示1000～5000 bp大片段條帶，但100～500 bp小片段條帶模糊不清，SYBR Green I則相反；GelGreen、GeneGreen、4s Green Plus和GeneFinder只能顯示部分DNA片段的條帶；SYBR Safe的電泳條帶幾乎觀察不到，說明SYBR Safe核酸染料靈敏度相對最弱，已有的研究表明SYBR Safe靈敏度只有GelGreen的1/3［9］。

圖2 GelRed膠染法靈敏度實驗電泳圖

圖3 GeneRed膠染法靈敏度實驗電泳圖

本文在研究核酸染料靈敏度過程中不僅探索DNA上樣量和相對分子質(zhì)量的敏感特性，還關(guān)注了核酸染料的化學(xué)特性與最小使用量；在不影響電泳結(jié)果的基礎(chǔ)上，降低核酸的使用量可以減少對實驗人員和環(huán)境的危害。

2.2 染色方法的比較

不同核酸染料的連續(xù)泡染效果相差較大。EB在連續(xù)泡染5塊膠后電泳條帶變模糊，GoldView可以連續(xù)泡染3塊膠，GelRed和GeneRed可以連續(xù)泡染2塊膠，其余核酸染料采用泡染法幾乎不顯示DNA條帶。與膠染法相比，采用連續(xù)泡染法可以提高EB利用率，但電泳加染色時間相對較長；另外，考慮到核酸染料容易降解，需要避光。GoldView、GelRed和GeneRed泡染效果一般，其他核酸染料泡染法的染色效果和靈敏度相對差，均不適合泡染法。

預(yù)染法是將DNA和核酸染料先混合上樣后再電泳。結(jié)果顯示GelGreen、GeneFinder和SYBR Green預(yù)染法顯示出部分DNA條帶，其他核酸染料顯示的條帶模糊或沒有顯示DNA條帶。相對膠染法和泡染法，預(yù)染法電泳染色效果差、靈敏度不佳且核酸染料使用量大，因此通常瓊脂糖凝膠電泳方式很少采用預(yù)染法。

2.3 核酸染料的安全性分析

核酸染料的安全性與其滲透細胞膜能力與有一定相關(guān)性［9］。EB已被證實具有高度致癌性和致突變能力。GelRed、GelGreen、GeneRed和GeneGreen均具有獨特的油性大分子特點，不能穿透細胞膜進入細胞內(nèi)，其中GelRed、GelGreen水溶劑已經(jīng)通過美國環(huán)保局安全認定，其廢棄物可以直接倒入下水道，不會對環(huán)境造成任何污染，安全性相對較高［15］。但余文等［16］在研究核酸染料的細菌回復(fù)突變實驗中發(fā)現(xiàn)，這些無法穿透細胞膜的核酸染料在高濃度情況下也會呈現(xiàn)致變性幾率；SYBR Green I和SYBR Safe對鼠傷寒沙門菌產(chǎn)生有明顯的突變能力；Goldview穿透性強，具有一定的突變性，并對皮膚和眼睛具有一定的刺激性［13］。4s Green plus和GeneFinder的誘變性雖然低于EB，但能引起有機體突變。因此在瓊脂糖凝膠電泳過程盡量使用濃度較低、靈敏度高的核酸染料GelRed才會更加安全。實際上目前商用核酸染料并非商家宣傳的無毒性，實驗人員在使用過程中還需做好自我防護。

2.4 核酸染料價格比較

目前核酸染料在高校生物類實驗室已廣泛應(yīng)用，其使用量逐漸增加，控制成本也是需要解決的關(guān)鍵點。通過市場調(diào)研核酸染料的價格，按照每塊瓊脂糖凝膠（20 mL）中染料成本來算，SYBR GreenI成本為3.4元，相對較貴；GelRed、GelGreen、4s Green Plus、GeneRed、GeneGreen和SYBR Safe成本均為1.2元左右，價格適中；GeneFinder成本為0.6元，相對便宜；GoldView和EB成本0.16元左右，價格最廉價。從核酸染料靈敏度實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不影響實驗結(jié)果的情況下，高靈敏性的GelRed可以通過減少使用量來降低使用成本。

3 結(jié)語

本文選取EB和9種新型核酸染料，通過瓊脂糖凝膠的染色效果、靈敏度、染色方式和核酸染料的安全性、性價比等方面進行綜合評價（見表1）。結(jié)果表明采用膠染法，GelRed的電泳染色效果、靈敏度和安全性方面俱佳，其性價比合理，作為EB替代染料值得在高校生物類實驗室推廣應(yīng)用。相比之下，GeneRed安全性和靈敏度略有遜色；GeneGreen、GelGreen靈敏度不佳；GeneFinder、SYBR Safe和4s Green Plus染色效果一般、靈敏度較差，它們致突變性雖然低于EB，但還具有一定的毒性；GoldView和SYBR GreenI突變性較強，安全性較差；SYBR GreenI穩(wěn)定性欠佳并且價格貴，不建議在瓊脂糖凝膠電泳中使用，但它與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光強度會顯著增加，已成為定量PCR的標志性染料［17］。本研究發(fā)現(xiàn)不同大小的DNA片段與核酸結(jié)合靈敏度存在差異性，因此實驗人員可以根據(jù)目的基因片段來選擇核酸染料的品種和使用量。膠染法具有操作便捷，靈敏度高、核酸染料使用量少等優(yōu)點，依然推薦為瓊脂糖凝膠電泳最常用的電泳方式。

表1 核酸染料綜合評價

目前核酸染料的應(yīng)用范圍不再局限于瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段。1×GelRed適合在聚丙烯酰胺凝膠電泳中檢測PCR產(chǎn)物［14］；GeneFinder［18］、SYBR GreenI［3］可以定量檢測水和土壤中Hg2+。隨著核酸染料在高校生物類實驗室大量廣泛使用，應(yīng)進一步加強核酸染料使用后廢膠的規(guī)范處理，避免污染環(huán)境，保證高校實驗室安全、環(huán)保和可持續(xù)發(fā)展。