鄒玉 陳宗耀 鄂建飛 鄭茂

(1.四川省德陽市人民醫(yī)院輸血科，德陽 618000；2.四川省德陽市人民醫(yī)院檢驗科，德陽 618000)

耳念珠菌(Candidaauris)可導(dǎo)致人體嚴重的侵襲性感染，自2009年日本首次報道以來，全球呈快速流行趨勢，甚至暴發(fā)多次院內(nèi)感染[1-3]。按照美國疾病預(yù)防控制中心(Centers for Disease Control and Prevention,CDC)暫定的耳念珠菌耐藥折點(氟康唑MIC≥32 mg/L、兩性霉素B MIC≥2 mg/L、卡泊芬凈MIC≥2 mg/L)，臨床分離的耳念珠菌對這3類常用抗真菌藥物往往表現(xiàn)出耐藥，甚至泛耐藥，故可選擇的治療方案非常有限[4]。近十年來耳念珠菌感染病例呈指數(shù)級增長，遍布全球六大洲40多個國家和地區(qū)，涉及5個不同的地理進化分支[5]。新冠病毒全球大流行也為耳念珠菌傳播提供了條件，新冠肺炎危重患者更易并發(fā)耳念珠菌感染，預(yù)后差，死亡率高[6-7]?？梢?，耳念珠菌儼然成為一個全球公共衛(wèi)生的新威脅。

實驗室傳統(tǒng)的形態(tài)及生化表型方法，無法識別耳念珠菌或誤將其鑒定為其他念珠菌，可能低估了實際的臨床感染率[8]。2018年，Wang等[9]報道中國首例耳念珠菌，該菌株分離自一名老年患者的支氣管肺泡灌洗液。同年，沈陽和北京地區(qū)分別進行的兩項回顧性研究，重新確認出17株耳念珠菌，所有菌株對氟康唑耐藥，原始鑒定均被誤判為希木龍念珠菌(Candidahaemulonii)[10-11]。2021年，中國醫(yī)科大學(xué)尚紅院士團隊[12]報道一項為期3年的耳念珠菌流行病學(xué)監(jiān)測，單從沈陽某綜合醫(yī)院就分離出耳念珠菌93株；復(fù)旦大學(xué)黃廣華教授團隊[13]研究證實，僅北京地區(qū)就至少存在兩個不同的耳念珠菌分支。為了加強對耳念珠菌感染的重視，中華醫(yī)學(xué)會組織專家組發(fā)布《成人耳念珠菌感染診治防控專家共識》，旨在助力解決其感染診治及防控的難題[14]。面對耳念珠菌難識別、難鑒定的困境，本文就其實驗室鑒定方法作如下綜述。

1 表型水平鑒定

1.1 形態(tài)及培養(yǎng)特征

耳念珠菌是一種以出芽方式繁殖的酵母類真菌，幾乎不形成假菌絲或芽管，也不產(chǎn)生厚壁孢子；鏡下形態(tài)無特征性提示，通常為單個或成雙的卵圓形孢子；可以常規(guī)生長在沙堡弱培養(yǎng)基，菌落呈黏性、奶油狀、灰白色，邊緣光滑，但篩選原始樣本的培養(yǎng)時間可能長達10 d[15]。臨床分離的耳念珠菌常具有多種菌落形態(tài)，如酵母狀、絲狀、細長狀等，但研究表明絲狀生長是其普遍特征，這很可能與其耐藥及毒力有關(guān)[16]。

與大部分念珠菌不同，耳念珠菌具有較強耐高溫、高鹽特性，在42℃含有100 g/L氯化鈉的培養(yǎng)基中生長良好(希木龍念珠菌42℃不生長)，基于該特性，美國CDC推薦采用高溫高鹽富集培養(yǎng)的方法從混合樣本中分離耳念珠菌[17]。Das等[18]報道將12.5%氯化鈉和9 mmol/L硫酸亞鐵添加至酵母浸出粉葡萄糖瓊脂制成一種新型培養(yǎng)基，耳念珠菌僅需42℃培養(yǎng)48 h即可生長良好，而非酵母菌不生長。另外，Ibrahim等[19]報道將20 g/L甘露醇等添加至改良的沙堡弱培養(yǎng)基，能夠培養(yǎng)出低至10 CFU/mL的耳念珠菌臨床樣本，且對所有分支均具有選擇性，特異性達到100%?；谂囵B(yǎng)的方法是當(dāng)前臨床實驗室真菌鑒定的中堅力量，而特殊真菌培養(yǎng)基便是一種選擇性分離耳念珠菌的快速方式。

1.2 顯色瓊脂

顯色瓊脂是一種利用微生物自身代謝產(chǎn)生的酶與相應(yīng)底物反應(yīng)顯色來鑒別微生物的培養(yǎng)基，其反應(yīng)的靈敏度和特異性均明顯優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)基。耳念珠菌在科瑪嘉顯色瓊脂上生長呈粉紅色或米黃色，培養(yǎng)第4天可變?yōu)闇\粉紅色至紅色或紫色。由于菌落顏色多樣、無特征性，僅憑肉眼難以準確區(qū)分，不能將顯色瓊脂用于耳念珠菌的最終鑒定，但能突出顯示可疑菌落。對于最易與耳念珠菌混淆的希木龍念珠菌，可以利用添加苯丙氨酸解氨酶的科瑪嘉顯色瓊脂進行簡單有效鑒別[20]。在這種改良的顯色瓊脂上，耳念珠菌37℃或42℃培養(yǎng)24 h、48 h，均融合生長，呈白色至乳白色的光滑菌落，不產(chǎn)生假菌絲；但希木龍念珠菌37℃培養(yǎng)24 h生長平整，呈淡粉色菌落，培養(yǎng)48 h產(chǎn)生假菌絲，且42℃不生長，從而實現(xiàn)二者的快速、低成本鑒別。

為了提高耳念珠菌識別率，新型顯色瓊脂陸續(xù)被研發(fā)出來，如科瑪嘉念珠菌顯色瓊脂，其對耳念珠菌分支的涵蓋率達到100%[21]。Borman等[22]報道耳念珠菌在這種新型顯色瓊脂上呈淡奶白色，帶有獨特藍色光暈并擴散到周圍瓊脂，與之平行培養(yǎng)的50多種念珠菌及相關(guān)屬，只有臨床非常罕見的酵母菌(Candidadiddensiae)呈相似外觀，并且耳念珠菌生長速度及菌落數(shù)均比在沙堡弱培養(yǎng)基上有明顯提高。Bayona等[23]還發(fā)現(xiàn)耳念珠菌在該顯色瓊脂上培養(yǎng)36 h即可出現(xiàn)特定顏色(淺藍色和藍色光暈)，憑借此特征可以推測耳念珠菌，以縮短篩選時間。因此，科馬嘉念珠菌顯色瓊脂可以替代傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)基，快速篩選耳念珠菌，該方法在患者有多種念珠菌混合定植時優(yōu)勢更加明顯。

1.3 生化反應(yīng)

不同微生物所具有的酶系統(tǒng)不盡相同，對底物的分解能力各異，代謝產(chǎn)物亦不同。生化反應(yīng)是通過檢測微生物對各種底物的代謝作用及其代謝產(chǎn)物，實現(xiàn)區(qū)別不同的種屬，是近代微生物學(xué)鑒定的基礎(chǔ)。目前，市面上主流的全自動微生物生化鑒定儀大都配備相應(yīng)的酵母菌鑒定卡，但這些鑒定系統(tǒng)卻極易將耳念珠菌錯判為其他類型真菌。美國CDC總結(jié)了可能出現(xiàn)的誤判情況，如表1所示，并建議如果出現(xiàn)表中所列的鑒定結(jié)果或無法鑒定時，應(yīng)進一步采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)或聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)等方法重新鑒定。

表1 常用酵母菌鑒定系統(tǒng)可能將耳念珠菌誤判的情況[24]

生化鑒定系統(tǒng)非常依賴于數(shù)據(jù)庫更新，Vitek2系統(tǒng)就在其升級版(8.01版)中納入了耳念珠菌。一項來自新加坡的研究顯示[25]，Vitek2系統(tǒng)(8.01版)能夠正確識別大多數(shù)南亞分支，但對東亞分支、南美分支的識別能力有限，若系統(tǒng)報告得分良好則可確認為耳念珠菌。另一項來自加拿大的多中心評價研究顯示[26]，Vitek2系統(tǒng)(8.01版)能夠以較高可信度正確鑒定出52%的耳念珠菌，但務(wù)必注意該版本鑒定出的希木龍念珠菌、C.duobuhaemulonii，仍需進一步判斷是否為耳念珠菌。

2 蛋白水平鑒定

MALDI-TOF MS是一種新興的軟電離生物質(zhì)譜技術(shù)，通過激光照射微生物樣本與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，樣本與基質(zhì)發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使樣本分子電離，離子在電場作用下加速進入檢測器進行質(zhì)荷比分析，最終得到以離子質(zhì)荷比為橫坐標(biāo)、離子峰為縱坐標(biāo)的特異性蛋白指紋圖譜。MALDI-TOF MS具有高靈敏度、高準確性、高通量等特點，為臨床微生物領(lǐng)域提供了一種強有力的蛋白質(zhì)水平鑒定手段。

由于MALDI-TOF MS是基于樣本的生成光譜與參考數(shù)據(jù)庫比對，故僅在數(shù)據(jù)庫包含耳念珠菌時方可起到鑒定作用，如德國布魯克公司的Biotyper系統(tǒng)、法國梅里埃公司的Vitek MS系統(tǒng)。Kwon等[27]報道使用Biotyper和Vitek MS的僅供研究(research use only，RUO)數(shù)據(jù)庫鑒定耳念珠菌，準確率分別為83.6%、93.4%；若使用Vitek MS的體外診斷數(shù)據(jù)庫，準確率還可提升至96.7%。Vatanshenassan等[28]報道采用更新數(shù)據(jù)庫后MALDI-TOF MS，可以快速鑒定沙堡弱培養(yǎng)基和血培養(yǎng)瓶中的耳念珠菌，平均鑒定得分≥ 2，準確率100%；倘若數(shù)據(jù)庫沒有涵蓋所有分支，則鑒定得分可能<2。由此可見，數(shù)據(jù)庫更新是MALDI-TOF MS識別耳念珠菌的關(guān)鍵，目前MicrobeNet在線數(shù)據(jù)庫已納入耳念珠菌光譜，免費用于布魯克數(shù)據(jù)庫的補充。

臨床微生物實驗室常使用直接點靶而不是全管萃取的方法分離蛋白質(zhì)，但使用布魯克質(zhì)譜儀必須注意到，直接點靶的方案可能造成無法識別耳念珠菌，需要采用全管萃取法才能順利鑒定[8]。為了提高布魯克Biotyper系統(tǒng)的識別率，Bao等[29]開發(fā)出一套新型CMdb數(shù)據(jù)庫，其對耳念珠菌識別準確率可達到100%，平均鑒定得分2.5。盡管MALDI-TOF MS具有無法比擬的優(yōu)點，但該技術(shù)需要培養(yǎng)分純菌株，前期過程耗時較長，還需配備價格不菲的質(zhì)譜儀和涵蓋所有分支的數(shù)據(jù)庫，目前尚未成為一種普及的耳念珠菌鑒定方法。

3 基因水平鑒定

3.1 PCR檢測

PCR是一種利用特定DNA片段為模板，在DNA聚合酶、核苷酸底物、特異性引物共同參與下，以變性、退火、延伸等步驟，體外擴增DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。通常采用耳念珠菌的28s rDNA的D1/D2區(qū)域或內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)作為PCR引物的目標(biāo)靶位，將擴增后的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中耳念珠菌任一分支基因序列比對，若一致性超過98%，可初步考慮為同一種屬。

臨床致病的念珠菌大都包含一些獨特的糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)蛋白，這些蛋白在其他物種或譜系中缺乏同源性，可以作為一種遺傳標(biāo)記。Ruiz-Gaitán等[30]報道利用GPI蛋白編碼基因，選取與其他物種序列不具有同源性的耳念珠菌特異性引物，可以實現(xiàn)可靠的菌株鑒定。該方法利用氫氧化鈉快速裂解單個菌落，通過PCR生成一個或多個小擴增子，隨后進行瓊脂糖凝膠電泳，總用時不到2 h即可獲得模板DNA。該團隊還設(shè)計了基于GPI蛋白編碼基因的多重PCR(multiplex PCR)，可以準確、快速區(qū)分耳念珠菌與其近緣物種，使鑒定效率進一步提升[31]。

目前文獻已報道多種PCR擴增技術(shù)用于耳念珠菌鑒定，包括常規(guī)PCR(reverse transcription PCR)[32-33]、多重PCR(multiplex PCR)[34]、實時熒光定量PCR(real-time PCR)[35-41]、單管經(jīng)典PCR(single-tube classical PCR)[42]、干粉式單劑量PCR(dried single-dose PCR)[43]、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplication，LAMP)[44]等。其中應(yīng)用最廣泛的當(dāng)屬實時熒光定量PCR，其根據(jù)融解曲線溫度的差異可以從相似念珠菌中特異性識別耳念珠菌，不僅能檢測純培養(yǎng)菌株，亦能檢測臨床采集的原始樣本，如拭子、血液、尿液等[38,41,45-46]。Arastehfar等[47]還設(shè)計出首個通過動物模型驗證的四重終點PCR(tetraplex PCR)，這種新穎PCR具有成本低、特異性高等優(yōu)勢，但尚無法量化宿主體內(nèi)的真菌載量。筆者將近年來文獻報道用于耳念珠菌鑒定的多種PCR方法進行總結(jié)，如表2所示。不難看出，盡管采用不同探針、不同基因靶位的PCR，在鑒定耳念珠菌靈敏度、特異度、檢出限等方面略有差異，但其檢測性能已滿足實驗室診斷的常規(guī)要求。其中一些PCR方案還成功應(yīng)用于自動化檢測系統(tǒng)(如BD Max平臺)[37-38]。此外，布魯克等公司還研發(fā)出耳念珠菌特異性PCR試劑盒，在較低DNA濃度下也能順利完成鑒定[48]。雖然PCR操作過程相對繁瑣，但可以直接檢測患者樣本的耳念珠菌DNA，而不依賴于真菌培養(yǎng)，極大地縮短實驗室鑒定周期并提高診斷敏感性，這一優(yōu)勢是基于培養(yǎng)的其他方法無法媲美的。

表2 文獻報道用于耳念珠菌鑒定的多種PCR方法總結(jié)

3.2 全基因組測序

全基因組測序(whole genome sequencing，WGS)是利用高通量測序平臺檢測并排列物種整個基因組堿基序列，幾乎能夠識別出基因組中任何類型的突變，成為分辨率最高的病原體溯源技術(shù)，亦是菌株鑒定的參考方法。WGS發(fā)展已日趨成熟，現(xiàn)階段主流有二代測序技術(shù)(high-throughput sequencing，高通量測序)和三代測序技術(shù)(single molecule sequencing，單分子測序)。

近年來分離自全球不同地域的耳念珠菌，WGS揭示了其生物學(xué)特性和基因組特點明顯不同，存在四大分支(南亞、東亞、南非、南美)和伊朗分支，這說明耳念珠菌具有多個獨立起源[50]。Chow等[51]采用WGS追溯耳念珠菌的進化史，證實四大分支在全球持續(xù)存在，其中東亞分支耐藥率最高。Muoz等[52]基于WGS的研究表明，耳念珠菌同一分支之間遺傳多樣性較低，單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)一般小于100，而不同分支之間遺傳多樣性明顯，SNP一般大于10000。WGS還常作為耳念珠菌暴發(fā)的流行病學(xué)調(diào)查手段，以便快速分析傳播鏈和追蹤傳播源頭。實際工作中，由于某些耳念珠菌分支異常低的多樣性，難以建立一個具體SNP臨界值來區(qū)分來自醫(yī)院暴發(fā)和流行地區(qū)的環(huán)境分離株，但醫(yī)院暴發(fā)的分離株與基因組高度相關(guān)，SNP差異常小于3[53]。

其他基因測序技術(shù)也被用于耳念珠菌暴發(fā)的調(diào)查，如英國牛津納米孔技術(shù)公司生產(chǎn)的便攜式MinION測序儀。2016年，英國一家心胸?？漆t(yī)院暴發(fā)大規(guī)模耳念珠菌疫情，研究者使用MinION測序儀很快溯源出菌株歸于印度/巴基斯坦分支，證實疫情起源于亞洲[54]。盡管WGS可以明確菌株起源，在分析菌株間的相關(guān)性和醫(yī)院感染的傳播鏈方面具有優(yōu)越性，但其作為鑒定手段，尚不夠簡潔、快速；另一方面，WGS要求操作者具備豐富的生物信息學(xué)知識，測試成本相對昂貴，目前不適用于耳念珠菌的常規(guī)鑒定。

4 其他方面

生物傳感器是利用生物化學(xué)和電化學(xué)反應(yīng)原理，將生物化學(xué)反應(yīng)信號通過信號轉(zhuǎn)換器變?yōu)楣怆娦盘柕臋z測器，為醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷提供了一種簡便快速的新思路。Pla等[55]報道一種基于寡核苷酸門控納米材料的生物傳感器，通過篩選GPI蛋白編碼基因中的寡核苷酸，獲得耳念珠菌的種屬特異性序列，實現(xiàn)準確識別臨床樣本(如血液)中的耳念珠菌。這種熒光納米傳感器無需對樣本進行預(yù)處理或DNA擴增，在1 h內(nèi)即可獲得結(jié)果，檢測限低至6 CFU/mL。Guedes等[56]報道一種可重復(fù)使用的新型電化學(xué)基因傳感器，使用茚三酮作為DNA雜交指示劑，通過微分脈沖伏安法和電化學(xué)阻抗譜法能夠靈敏地檢出尿液中耳念珠菌DNA，并在長達80 d的儲存期間仍保持100%響應(yīng)。與大多數(shù)分析技術(shù)相比，生物傳感器具有成本低、耗時短、體積小、操作簡便等優(yōu)點，在臨床樣本的耳念珠菌快速鑒定方面顯現(xiàn)出巨大潛力，提供即時診斷(point-of-care testing，POCT)的可能性。

T2 Biosystems公司為內(nèi)置的T2磁共振(T2MR)平臺開發(fā)了一種用于耳念珠菌診斷的新方法，該技術(shù)使用與超順磁性粒子鏈接的特異性目標(biāo)探針，識別并放大病原體相關(guān)信號，進而被磁共振檢測到。Sexton等[57]報道利用T2MR系統(tǒng)可以快速檢測臨床皮膚拭子的耳念珠菌，檢測限低至5 CFU/mL，耗時僅4～8 h，該方法的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別達到89%、98%、98%、89%。T2MR系統(tǒng)操作簡便、高效，有望成為一種鑒定皮膚拭子耳念珠菌的候選方法。

5 結(jié) 語

耳念珠菌是一種難以識別和治療的真菌病原體，盡管對其流行病學(xué)及致病機制已有一些初步了解，但仍必須時刻避免暴發(fā)疫情，而快速、準確的菌株鑒定是重要前提。鑒于傳統(tǒng)酵母菌生化鑒定系統(tǒng)的缺陷，選擇高性能的鑒定方法十分必要。念珠菌顯色瓊脂簡單易用，也不需要專業(yè)的真菌學(xué)知識，可作為一種不錯的篩選方案。研究者可采用更新數(shù)據(jù)庫的MALDI-TOF MS準確鑒定耳念珠菌，而尚未配備質(zhì)譜儀的實驗室，也可采用基于DNA的PCR方法，各種PCR優(yōu)點各異，靈敏度、特異度、適用樣本類型亦不同，研究者應(yīng)根據(jù)實際檢測需求來選擇。雖然WGS不是耳念珠菌的常規(guī)鑒定方式，但仍是其菌種水平的參考鑒定方法，更是疫情暴發(fā)時不可或缺的流行病學(xué)分析手段。隨著耳念珠菌在世界范圍內(nèi)繼續(xù)蔓延，相信科研工作者會研發(fā)出更多便捷、特異的鑒定技術(shù)和更有效的抗真菌藥物，為臨床提供及時的病原學(xué)證據(jù)和治療策略，早日遏制耳念珠菌傳播。