王小亞，杜旭輝，何曉剛

作者單位：1平頂山市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 平頂山 467000；2許昌市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 許昌 461000

腦缺血被認(rèn)為是全世界腦血管疾病高發(fā)病率和高死亡率的主要原因［1］。盡管再灌注是有效治療腦缺血的可行療法，但它也可能在稱為腦缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷的過程中加劇腦損傷和功能損傷［2］。近年來，大量的研究表明，涉及多種信號途徑和生物學(xué)過程的多種機(jī)制參與腦I/R損傷；然而，其機(jī)制復(fù)雜，目前對這方面的認(rèn)識還不盡如人意。許多研究證實(shí)，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是腦I/R后神經(jīng)元丟失的主要病理原因［3-4］。因此，關(guān)注與氧化應(yīng)激相關(guān)的分子機(jī)制和腦I/R損傷背后的炎癥反應(yīng)可能會促進(jìn)更有效的治療藥物的開發(fā)。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類非編碼小RNA，可以廣泛調(diào)節(jié)腦缺血的生物過程，包括氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。有人提出，miRNA可能是腦缺血的潛在診斷標(biāo)志物和有前途的治療劑［5］。據(jù)報(bào)道，miR-199a-5p在缺血性中風(fēng)大鼠模型中高表達(dá)，沉默miR-199a-5p后，大鼠的認(rèn)知功能明顯改善，腦梗死面積明顯減少，神經(jīng)細(xì)胞凋亡受到抑制，證實(shí)了沉默miR-199a-5p對缺血性中風(fēng)大鼠認(rèn)知功能和神經(jīng)元的保護(hù)作用［6］。已知，miRNA通過調(diào)節(jié)下游靶基因發(fā)揮作用，通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-199a-5p與Klotho之間存在結(jié)合位點(diǎn)。Klotho是一種具有多效性的抗衰老基因。據(jù)之前研究報(bào)道，Klotho可能作為一種內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)因子對抗缺血損傷，敲低Klotho加劇了小鼠神經(jīng)功能障礙和腦損傷，證實(shí)了Klotho本身或Klotho的增強(qiáng)劑可能是預(yù)防和治療老年急性缺血性腦損傷的一種有前途的方法［7］。然而，miR-199a-5p在腦I/R損傷中的潛在保護(hù)機(jī)制以及Klotho在其中發(fā)揮的作用仍有待闡明。

本研究自2021年5―11月通過構(gòu)建神經(jīng)元PC12細(xì)胞的氧-葡萄糖剝奪/再灌注（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）損傷模型模擬體內(nèi)腦I/R損傷條件，旨在研究抑制miR-199a-5p對OGD/R損傷PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用，以及Klotho在此過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞PC12（未分化）（貨號YS3032C）獲自美國ATCC。馬血清（貨號26050088）、胎牛血清（貨號10100147）、青霉素-鏈霉素（貨號15070063）獲自美國Gibco；DMEM培養(yǎng)基（貨號D6046）獲自德國MERCK，miR-199a-5p模擬物/抑制劑（miR-199a-5p mimics/inhibitor）及其陰性對照（miR-NC mimics/inhibitor）、Klotho敲低載體質(zhì)粒（shRNA-Klotho）及其對照載體質(zhì)粒（shRNApLKO.1）、3'-UTR Klotho野生型載體質(zhì)粒（Klotho-WT）及3'-UTR Klotho突 變型載體 質(zhì)粒（Klotho-MUT）均由上海GenenPharma提供；TRIzol試劑（貨號15596026）、大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）（貨號BMS622）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）（貨號ERIL1B）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）（貨號BMS631INST）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）（貨號BMS625）ELISA試劑盒獲自美國Invitrogen；HiScript?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit（貨號R211-01）獲自南京VAZYME；Arraystar SYBR?Green Real-time qPCR Master Mix（貨號AS-MR-005-5）獲自上海Arraystar；RIPA裂解緩沖液（貨號89900）獲自美國Thermo Scientific；一抗Klotho（貨號YB-2925R，113 kDa）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（貨號YB-01000，37 kDa）獲自上海鈺博生物科技；膽囊收縮素/縮膽囊素八肽（CCK-8）細(xì)胞增殖試劑盒獲自美國BestBio；Annexin V-FITC／PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（貨號FY600003-20T）獲自上海Fuyuanbio；活性氧（ROS）檢測試劑盒（貨號：S0033M）獲自上海Beyotime；大鼠丙二醛（MDA）含量［貨號JK-（a）-2197］、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性［貨號JK-（a）-2396］、超氧化物歧化酶（SOD）活性［貨號JK-（a）-2293］測定試劑盒獲自上海晶抗。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒（貨號11402ES60）獲自上海Yeasen。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞系維持在DMEM培養(yǎng)基中，補(bǔ)充有10%馬血清、5%胎牛血清、青霉素（100 mg/L）-鏈霉素（100 mg/L），在含有95%空氣和5%二氧化碳的37℃加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所有處理均在匯合超過80%的細(xì)胞進(jìn)行。

1.2.2 細(xì)胞處理與轉(zhuǎn)染將PC12細(xì)胞分為Control組、OGD/R組、miR-NC inhibitor組、miR-199a-5p inhibitor組、miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1組和miR-199a-5p inhibitor+shRNA-Klotho組。Control組細(xì)胞不做任何處理；OGD/R組進(jìn)行OGD/R處理；其余四組細(xì)胞按照Lipofectamine 2000試劑盒方法對 應(yīng) 轉(zhuǎn) 染miR-NC inhibitor、miR-199a-5p inhibitor、shRNA-pLKO.1或shRNA-Klotho，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn) 行OGD/R處理，通過RT-qPCR或Western blotting確定轉(zhuǎn)染效率。

PC12細(xì) 胞OGD/R處 理［8］如 下：PC12細(xì) 胞 的DMEM培養(yǎng)基更換為DMEM無糖培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)移到缺氧室（95%N2和5%二氧化碳）中3 h，消耗細(xì)胞內(nèi)外葡萄糖和氧氣。在OGD階段結(jié)束時(shí)，將培養(yǎng)基更換為含有4.5 g/L葡萄糖的培養(yǎng)基，并在正常培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)24 h以復(fù)氧，各組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，檢測各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.3 RT-qPCR檢測PC12細(xì)胞 中miR-199a-5p和Klotho mRNA表達(dá)水平PC12細(xì)胞中總RNA通過TRIzol試劑獲取，使用cDNA合成試劑盒將全部的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。隨后通過SYBR? Green Real-time qPCR Master Mix進(jìn)行RT-qPCR。U6作為內(nèi)參對照基因，2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因表達(dá)。

引物由北京擎科生物科技有限公司參與合成，引物序列如下：miR-199a-5p：5'-GCCAAGCCCAGTGTTCAGAC-3'（正向）和5'-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3'（反向）；Klotho：5'-TGAGGACGACCAGCTGAGGGT-3'（正向）和5'-CATGGATGCCTTGGGCTCAAA-3'（反向）；GAPDH：5'-AAAAGCATCACCCGGAGGAGAA-3'（正 向）和5'-AAGGAAATGAATGGGCAGCCG-3'（反 向）；U6：5'-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3'（正向）和5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'（反向）。

1.2.4 Western blotting分析PC12細(xì)胞中Klotho蛋白水平通過RIPA裂解緩沖液從各組PC12細(xì)胞中獲得總蛋白質(zhì)。通過在10% SDS-PAGE（30微克/泳道）分離蛋白質(zhì)，并遷移到PVDF膜上，于室溫下在5%脫脂牛奶封閉2 h。將膜與一抗Klotho和GAPDH在4℃下過夜孵育。一抗孵育后，將膜與二抗在室溫下孵育1 h，使用ECL蛋白印跡底物試劑盒顯影。Image J軟件用于進(jìn)行灰度值分析。

1.2.5 CCK-8測定PC12細(xì)胞活力將上述各組轉(zhuǎn)染處理的PC12細(xì)胞按每孔1×106個(gè)接種在96孔板中，培養(yǎng)24 h后，每孔中添加10 μL的CCK-8溶液在37℃下孵育3 h，然后在酶標(biāo)儀上測量發(fā)射波長為450 nm的光密度（optical density，OD）值。

1.2.6 流式細(xì)胞儀測定PC12細(xì)胞凋亡率收集按照上述轉(zhuǎn)染處理的各組PC12細(xì)胞，重懸于緩沖液中，依次添加50 μL Annexin V-FITC和10 μL PI在37℃下染色15 min。使用流式細(xì)胞儀評估凋亡細(xì)胞，并使用Cell Quest 5.1軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.7 PC12細(xì)胞中ROS生成測定將上述各組轉(zhuǎn)染處理的PC12細(xì)胞按每孔1×106個(gè)接種在6孔板中，添加DCFH-DA（10 μmol/L）在37℃下培養(yǎng)20 min。然后收集細(xì)胞并使用流式細(xì)胞儀量化每組的熒光強(qiáng)度（fluorescence intensity，F(xiàn)I），通過FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.8 PC12細(xì)胞中氧化應(yīng)激指標(biāo)的測定將按照上述方法轉(zhuǎn)染處理的各組PC12細(xì)胞經(jīng)裂解后離心以收集上清液。根據(jù)試劑盒的方案，使用相應(yīng)試劑盒評估上清液中MDA含量以及SOD和GSH-Px活性。

1.2.9 ELISA檢測PC12細(xì)胞中炎癥因子水平將按照上述方法轉(zhuǎn)染處理的各組PC12細(xì)胞經(jīng)裂解后離心以收集上清液。根據(jù)試劑盒的方案，使用相應(yīng)的ELISA試劑盒檢測PC12細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、MCP-1和IL-6水平。

1.2.10 雙熒光素酶驗(yàn)證PC12細(xì)胞中miR-199a-5p與Klotho靶 向 關(guān) 系Targetscan（http：//www.targetscan.org/vert_71/，Release 7.2）網(wǎng)站預(yù)測顯示miR-199a-5p與Klotho之間存在潛在結(jié)合位點(diǎn)。將Klotho-WT和Klotho-MUT克隆到pmirGLO報(bào)告質(zhì)粒載體中，與miR-199a-5p mimics或miR-NC mimics一起通過Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染到PC12細(xì)胞中。使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)檢測相對熒光素酶活性。熒光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化為海腎熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 22.0分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用以±s表示，兩組間差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間差異比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證RT-qPCR和Western blotting結(jié)果顯示，與Control組相比，OGD/R組PC12細(xì)胞中miR-199a-5p表達(dá)水平增高，Klotho mRNA和蛋白水平降低（P＜0.05）；與miR-NC inhibitor組 相 比，miR-199a-5p inhibitor組PC12細(xì) 胞 中miR-199a-5p表達(dá)水平降低，Klotho mRNA和蛋白水平增高（P＜0.05）；與miR-199a-5p inhibitor+shRNApLKO.1組 相 比，miR-199a-5p inhibitor+shRNAKlotho組PC12細(xì)胞中miR-199a-5p表達(dá)水平增高，Klotho mRNA和蛋白水平降低（P＜0.05）；miR-NC inhibitor組 與OGD/R組、miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1組 與miR-199a-5p inhibitor組PC12細(xì) 胞中miR-199a-5p和Klotho表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1，表1。

表1 各組PC12細(xì)胞中miR-199a-5p和Klotho表達(dá)水平/±s

表1 各組PC12細(xì)胞中miR-199a-5p和Klotho表達(dá)水平/±s

注：①與Control組比較，P＜0.05。②與OGD/R組比較，P＜0.05。③與miR-NC inhibitor組比較，P＜0.05。④與miR-199a-5p inhibitor組比較，P＜0.05。⑤與miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1組比較，P＜0.05。

組別Control OGD/R miR-NC inhibitor miR-199a-5p inhibitor miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1 miR-199a-5p inhibitor+shRNA-Klotho F值P值重復(fù)次數(shù)6 6 6 6 6 6 miR-199a-5p 1.03±0.05 3.52±0.27①3.19±0.22①1.61±0.13①②③1.69±0.15①②③2.56±0.18①②③④⑤176.78＜0.001 Klotho mRNA 1.05±0.04 0.24±0.02①0.25±0.03①0.68±0.07①②③0.73±0.06①②③0.40±0.04①②③④⑤281.07＜0.001 Klotho protein 1.26±0.10 0.35±0.04①0.41±0.03①0.79±0.07①②③0.86±0.06①②③0.51±0.05①②③④⑤180.75＜0.001

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組PC12細(xì)胞中Klotho蛋白水平

2.2 各組PC12細(xì)胞活力及凋亡情況CCK-8和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與Control組相比，OGD/R組PC12細(xì)胞活力降低，細(xì)胞凋亡率增高（P＜0.05）；與miR-NC inhibitor組 相 比，miR-199a-5p inhibitor組PC12細(xì)胞活力增高，細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1組相比，miR-199a-5p inhibitor+shRNA-Klotho組PC12細(xì)胞活力降低，細(xì)胞凋亡率增高（P＜0.05）；miR-NC inhibitor組與OGD/R組、miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1組與miR-199a-5p inhibitor組PC12細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞0.05）。見表2。

表2 各組PC12細(xì)胞活力與凋亡情況/±s

表2 各組PC12細(xì)胞活力與凋亡情況/±s

注：①與Control組比較，P＜0.05。②與OGD/R組比較，P＜0.05。③與miR-NC inhibitor組比較，P＜0.05。④與miR-199a-5p inhibitor組比較，P＜0.05。⑤與miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1組比較，P＜0.05。

組別Control OGD/R miR-NC inhibitor miR-199a-5p inhibitor miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1 miR-199a-5p inhibitor+shRNA-Klotho F值P值重復(fù)次數(shù)6 6 6 6 6 6細(xì)胞活力（OD）0.82±0.05 0.37±0.03①0.40±0.02①0.63±0.05①②③0.67±0.06①②③0.52±0.04①②③④⑤92.34＜0.001凋亡率/%7.25±1.03 45.36±3.58①40.33±3.09①15.36±1.24①②③16.84±1.55①②③27.58±2.16①②③④⑤253.90＜0.001

2.3 各組PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激情況結(jié)果顯示，與Control組相比，OGD/R組PC12細(xì)胞中ROS釋放量和MDA含量增多，SOD和GSH-Px活性降低（P＜0.05）；與miR-NC inhibitor組相比，miR-199a-5p inhibitor組PC12細(xì)胞中ROS釋放量和MDA含 量 降低，SOD和GSH-Px活性升高（P＜0.05）；與miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1組相比，miR-199a-5p inhibitor+shRNA-Klotho組PC12細(xì)胞中ROS釋放量 和MDA含量增多，SOD和GSH-Px活性降低（P＜0.05）；miR-NC inhibitor組與OGD/R組、miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1組 與miR-199a-5p inhibitor組PC12細(xì) 胞 中ROS釋 放 量、MDA含 量 以 及SOD和GSH-Px活性變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組PC12細(xì)胞中活性氧（ROS）釋放量與丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平/±s

表3 各組PC12細(xì)胞中活性氧（ROS）釋放量與丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平/±s

注：①與Control組比較，P＜0.05。②與OGD/R組比較，P＜0.05。③與miR-NC inhibitor組比較，P＜0.05。④與miR-199a-5p inhibitor組比較，P＜0.05。⑤與miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1組比較，P＜0.05。

組別Control OGD/R miR-NC inhibitor miR-199a-5p inhibitor miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1 miR-199a-5p inhibitor+shRNA-Klotho重復(fù)次數(shù)6 6 6 6 6 6 ROS釋放量1.00±0.00 2.59±0.18①2.41±0.17①1.66±0.10①②③1.73±0.12①②③2.07±0.15①②③④⑤MDA/（μmol/L）3.89±0.25 11.16±0.93①10.98±0.86①6.78±0.59①②③6.20±0.51①②③8.56±0.72①②③④⑤SOD/（U/mL）15.36±2.04 4.02±0.41①4.36±0.48①10.67±1.15①②③9.87±0.86①②③7.15±0.69①②③④⑤GSH-Px/（U/mL）17.16±1.87 6.34±0.57①5.67±0.48①13.05±1.18①②③11.98±1.13①②③9.16±0.78①②③④⑤F值P值110.53＜0.001 105.08＜0.001 93.97＜0.001 93.77＜0.001

2.4 各組PC12細(xì)胞炎癥反應(yīng)情況結(jié)果顯示，與Control組相比，OGD/R組PC12細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、MCP-1和IL-6水平升高（P＜0.05）；與miR-NC inhibitor組相比，miR-199a-5p inhibitor組PC12細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、MCP-1和IL-6水平降低（P＜0.05）；與miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1組相比，miR-199a-5p inhibitor+shRNA-Klotho組PC12細(xì) 胞 中TNF-α、IL-1β、MCP-1和IL-6水平升高（P＜0.05）；miR-NC inhibitor組與OGD/R組、miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1組 與miR-199a-5p inhibitor組PC12細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、MCP-1和IL-6水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組PC12細(xì)胞中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）水平/±s

表4 各組PC12細(xì)胞中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）水平/±s

注：①與Control組比較，P＜0.05。②與OGD/R組比較，P＜0.05。③與miR-NC inhibitor組比較，P＜0.05。④與miR-199a-5p inhibitor組比較，P＜0.05。⑤與miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1組比較，P＜0.05。

組別Control OGD/R miR-NC inhibitor miR-199a-5p inhibitor miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1 miR-199a-5p inhibitor+shRNA-Klotho F值P值重復(fù)次數(shù)6 6 6 6 6 6 TNF-α/（μg/L）11.26±1.65 34.56±3.04①31.62±2.54①18.54±1.24①②③19.59±1.81①②③25.06±2.26①②③④⑤96.65＜0.001 IL-1β/（ng/L）105.36±10.22 354.36±21.19①322.66±17.55①187.63±14.32①②③202.58±15.33①②③260.57±18.63①②③④⑤186.03＜0.001 MCP-1/（ng/L）300.18±22.67 945.36±85.29①824.36±74.26①498.21±41.82①②③520.87±45.61①②③679.55±50.63①②③④⑤101.53＜0.001 IL-6/（ng/L）115.69±10.28 396.57±27.63①420.68±34.28①194.18±18.52①②③203.81±21.37①②③298.65±24.65①②③④⑤153.27＜0.001

2.5 miR-199a-5p與Klotho靶向驗(yàn)證Targetscan預(yù)測發(fā)現(xiàn)，Klotho（簡稱KL）的3'-UTR區(qū)（1062-1069）存在與miR-199a-5p互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)。因此采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果顯示，與miR-NC mimics組相比，miR-199a-5p mimics組轉(zhuǎn)染Klotho-WT的PC12細(xì)胞中相對熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），而轉(zhuǎn)染Klotho-MUT的PC12細(xì)胞中相對熒光素酶活性變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

表5 雙熒光素酶檢測Klotho與miR-199a-5p的靶向關(guān)系/±s

表5 雙熒光素酶檢測Klotho與miR-199a-5p的靶向關(guān)系/±s

注：①與miR-NC mimics組比較，P＜0.05。

組別miR-NC mimics miR-199a-5p mimics t值P值重復(fù)次數(shù)6 6相對熒光素酶活性Klotho-WT 1.02±0.05 0.41±0.04①23.34＜0.001 Klotho-MUT 1.06±0.04 0.98±0.05 3.06 0.012

3 討論

腦I/R損傷通常由手術(shù)麻醉、心臟驟?；蛑酗L(fēng)引起，是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡和殘疾的主要原因［9］。腦血流不足會導(dǎo)致腦損傷，血液再灌注會進(jìn)一步加重腦損傷。I/R損傷導(dǎo)致興奮性神經(jīng)遞質(zhì)釋放、ROS生成過多、神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元凋亡，這些過程是腦損傷的病理生理機(jī)制［10-11］。但目前尚無有效的I/R損傷治療策略。因此，尋找新的有效參與腦I/R損傷的分子靶點(diǎn)，有助于臨床制定有效的治療策略。

越來越多的證據(jù)表明，miRNA在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，包括腦I/R損傷。體內(nèi)外研究表明，通過靶向miRNA抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，對腦I/R損傷有良好的治療作用［12］。因此，基于miRNA的治療可能成為一種潛在且有前景的腦I/R損傷治療策略。近年來，miR-199a-5p因其在多種疾病中的作用而受到廣泛研究。已有報(bào)道稱，miR-199a-5p通過抑制癌細(xì)胞生長和誘導(dǎo)凋亡而抑制腫瘤生長［13］，miR-199a-5p還促進(jìn)化療誘導(dǎo)不同類型的癌細(xì)胞凋亡［14］。另外，抑制miR-199a-5p提高了間充質(zhì)干細(xì)胞的存活率［15］。這些發(fā)現(xiàn)表明miR-199a-5p是一個(gè)促進(jìn)細(xì)胞凋亡的因子，因此，miR-199a-5p可能參與細(xì)胞凋亡相關(guān)的病理過程。令人關(guān)注的是，miR-199a-5p在心肌I/R中也起著重要的調(diào)節(jié)作用，抑制miR-199a-5p可促進(jìn)心肌細(xì)胞對缺氧誘導(dǎo)的凋亡的耐受性［16］。另外，據(jù)報(bào)道，阿托伐他汀通過抑制miR-199a-5p保護(hù)心肌免受I/R損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［17］。這些結(jié)果表明，miR-199a-5p的下調(diào)對不良刺激的細(xì)胞具有保護(hù)作用。本研究結(jié)果表明，miR-199a-5p下調(diào)對神經(jīng)元細(xì)胞PC12的OGD/R損傷有保護(hù)作用。有趣的是，有研究證實(shí)miR-199a-5p在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起著關(guān)鍵作用。Wang等［18］報(bào)道，miR-199a-5p的下調(diào)減輕了毛果蕓香堿誘導(dǎo)的癲癇持續(xù)狀態(tài)，并通過抑制細(xì)胞凋亡來保護(hù)神經(jīng)元免受損傷。此外，Li等［19］研究證實(shí)，抑制miR-199a-5p對OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡和ROS的產(chǎn)生具有保護(hù)作用。本研究結(jié)果證實(shí)，miR-199a-5p下調(diào)可通過提高OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞活力，降低細(xì)胞凋亡，對神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激主要是由過量的ROS引起的，ROS廣泛參與包含細(xì)胞凋亡、神經(jīng)損傷和炎癥等在內(nèi)的多個(gè)病理過程，是腦I/R后神經(jīng)元損傷的核心機(jī)制。而防御性抗氧化劑，如SOD和GSH-Px，可以改善氧化劑的升高，從而保護(hù)腦組織免受ROS細(xì)胞毒性［20］。miR-199a-5p已被證明可減少I/R損傷中的氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡［19］。同樣，本研究表明，miR-199a-5p抑制物改善了OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中ROS生成和MDA含量（氧化應(yīng)激引起的脂質(zhì)過氧化的主要標(biāo)志物）增加，并提高了SOD和GSH-Px活性。因此，這些結(jié)果表明，抑制miR-199a-5p可有效防止由ROS誘導(dǎo)的氧化損傷和脂質(zhì)過氧化作用引起的I/R損傷。此外，研究表明，在I/R期間，促炎介質(zhì)（TNF-α、IL-1β、MCP-1和IL-6）水平顯著增高［21］。本研究 發(fā) 現(xiàn)，miR-199a-5p抑制物降低 了OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、MCP-1和IL-6水平。這些結(jié)果表明，miR-199a-5p抑制物可降低改善OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞炎癥反應(yīng)。另外，令人感興趣的是，本研究證實(shí)，miR-199a-5p可靶向負(fù)調(diào)控Klotho的表達(dá)。多項(xiàng)研究表明，Klotho被鑒定為衰老抑制因子，其可影響許多對心血管疾病的發(fā)病機(jī)制及其預(yù)防至關(guān)重要的代謝途徑；同時(shí)，還具有抑制脂質(zhì)過氧化和炎癥，并防止內(nèi)皮損傷和血管鈣化的作用［22］。據(jù)報(bào)道，Klotho過表達(dá)可改善心肌梗死后氧化應(yīng)激對心肌組織的損傷［23］。此外，Jin等［24］研究證實(shí)，腦卒中病人腦脊液中Klotho表達(dá)下調(diào)，上調(diào)Klotho表達(dá)可減輕氧化應(yīng)激，從而改善腦I/R損傷后的認(rèn)知功能障礙，進(jìn)而對腦I/R損傷發(fā)揮保護(hù)作用。此外，本研究結(jié)果顯示，Klotho敲低逆轉(zhuǎn)了抑制miR-199a-5p對OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用。以上研究結(jié)果說明，抑制miR-199a-5p可能通過上調(diào)Klotho對腦I/R損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

總之，本研究結(jié)果表明，抑制miR-199a-5p對腦I/R損傷的保護(hù)可能是其在OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中抗氧化和抗炎作用的結(jié)果，且Klotho有助于抑制miR-199a-5p表達(dá)對神經(jīng)損傷的保護(hù)作用。這些結(jié)果可能為減輕腦I/R損傷提供新的策略，并為未來腦I/R損傷的研究提供幫助。然而，本研究尚存在一些局限性。目前尚不清楚miR-199a-5p直接靶向Klotho保護(hù)OGD/R誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的具體作用機(jī)制，這還需要進(jìn)一步研究。此外，還需要在體內(nèi)對腦I/R損傷模型進(jìn)行研究，以進(jìn)一步闡明miR-199a-5p對腦I/R損傷神經(jīng)保護(hù)所涉及的具體機(jī)制。